Nghiên cứu quy trình sản xuất γ aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng lactobacillus

i

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Trịnh Tất Cường là
người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm
cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các
anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và
Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014

Học viên

Lý Thị Kim Tuyến










ii

MỤC LỤC
M U 1
U 3
1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA) 3
1.2. Cng ca GABA 3
1.3. ng h 4
1.4. Enzym tng hp GABA 5
1.5. Th th GABA 6
1.6. Sn xut GABA t vi sinh vt 7
1.7. t tham gia sn xut GABA 9
1.8. Thc phm ch 10
1.8.1. o - nguu to thc phm cha GABA 10
1.8.2. u v GABA  Vit Nam 10
1.9.  th 11
 14
2.1. U 14
2.1.1. Vi sinh vt 14
2.1.2. o 14
2.1.3.    14
2.1.4. ng c 14
2.1.5.  14
2.2. U 15
2.2.1. n xut GABA t do 15
2.2.1.1. o qun chng KC1 15
2.2.1.2. Kim tra kh a chng KC1 16
2.2.1.3. o 16
2.2.1.4. nh hoo 19
2.2.1.5. nh glutamic axit bn mng (TLC) 19

iii

2.2.1.6. ng glutamic acid b 19
2.2.1.7. Chit xuo bc  20
2.2.1.8. nh GABA bn mng (TLC) [41] 20
2.2.1.9. ng GABA b 21
2.2.1.10. nh ngu 22
2.2.1.11. u kin p  ng do . 23
2.2.2. Tinh ch GABA [31] 24
2.2.2.1. Kh  24
2.2.2.2. Kh mui 24
2.2.2.3. Chy si ion 24
2.2.2.4. Kt tinh GABA 25
2.2.3.  25
2.2.3.1.  WSS- PC12 25
2.2.3.2.  ng cht ca t  26
2.2.3.3. nh GABA b[42] 26
2.2.3.4.   26
2.2.3.5. ng GABA ds  27
: KT QU O LUN 29
3.1. n xut GABA t do 29
3.1.1. Kh a chng KC1 29
3.1.2.  c phm co 29
3.1.3. ng co 30
3.1.4. a cho 31
3.1.4.1. o 31
3.1.4.2. ng glutamic acid trong hai mo 32
3.1.5. c b 34
3.1.6. ng chung GABA b
 35

iv

3.1.7. Ngup  36
3.1.8. u king dch o 40
3.1.8.1. pH p cho  40
3.1.8.2. Nhi  41
3.1.8.3. Th 42
3.1.8.4. T l  43
3.1.9.   dch chio 45
3.2. a GABA bn mng 46
3.3. a GABA 47
3.3.1.  ng cht ca t  47
3.3.2. nh GABA bng HPLC 48
3.3.3. c c th 52
3.3.3.1. y t WSS-1 52
3.3.3.2.  bt 
WSS-1 53
3.3.3.3. ng GABA d  54

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GABA
Axit gamma-amino butylric
GABA-T
GABA transaminase
GAD
L-glutamate decarboxylase
HTS
c High throughput
screening
KC1
Chng Lactobacillus plantarum KLEPT
ml
milliliter
mM
millimolar
MRS
De Man, Rogosa, Sharpe
MSG
Monosodium glutamate
OD
M quang hc
PLP
Pyridoxalphosphate
TCVN
n Vit Nam
TLC

Thin layer chromatography
TPCN
Thc phm ch








vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

 Ca GABA 4
ng tng hy ca GABA 5
a th th GABA
A
6
a th th GABA
B
7
ng ca th th n kt vi GABA 7
6: Kt qu chy si vi dng MRS 29
7: Ho 31
 Kt qu nh glutamic acid o bng TLC 32
ng chun glutamic acid 33
u qu nhi i i vglutamic acid t
go 35

ng chun GABA 36
u qu cn t n xut GABA 37
ng ca pH tn xu
dch chit o 41
ng ca nhi tn xut G
men dch chit o 42
ng ca thi gian tn xu
men dch chio 43
ng cn xu
dch chio 44
 o 45
18: Sn ph (B) 46
Kim tra GABA bng TLC 46

vii

  Kh  o v t   a d   ng Lactobacillus-
plantarum KLEPT 48
S ca GABA chun 49
22: ng chun GABA qua HPLC 49
H23: Chy smu d 50
24: Cht bng sc k ct 51
u GABA tinh sng chu  tinh sch ca
mu 52
nh chp t i sau 24 gi y t -1
(A), sau 48 gi (B) 53
t qu i OD ca Iot di n c
men 54
  ng chun gia n      quang t  
405nm 55

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bng MRS 15
Bng 2: Ch ng ca hai mo 30
B glutamic acid cu co 33
B t  thun Cacbon 38
B t  thun Nit
Bng 7: T l MSG (%)  ng ti hiu sut to GABA trong hai loi 
ng 40
Bng 8: ng GABA trong d 55

1

MỞ ĐẦU
-ng trong
h thng thn kinh. GABA thc hiu
thn kinh qua khe    i nhau trong h thng thn kinh
c biu qu t s ri lon thn
kinh gi
nhng cht nhiu tr
 n  thc phm ch. Hin xut
t nhing ht t c,
tu kin t ht go ny mm, hong vi sinh vt.
n xut GABA bn vi sinh vt (vi khun, n
c ng dng ru qu  gic bit, vi khu
c ng d cho ng ln GABA t thc phm truyn
thn xut GABA khi s dng vi khui vi
mp.
  c      GABA  
 

 
Lactobacillus 

Hiu ng dn gc t  
thc phm chu xut hin  Vit Nam. Thc t, khi mt sn ph

th tip c n phm phm bo v ch
 gii quyt hai v lu c n mt
nguu r tit  n cung c
  u sut cao.
V chng sn phm  dng cht ch th ch ra
c s ion clorua  kim tra ho ca t 

2

Xu     khoa hc thc ti       
“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo
bằng Lactobacillus”
u thc hin nh:
 sn xut GABA t do bng
chng Lactobacillus plantarum t hiu su.
 th GABA.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA  , 

n trong h thng th
kho1950 b
xut dn truyn thn kinh c ch 
mt trong t n ty, bung tr c
  ng trong h thng thn kinh [5]. Ho ng c   i
c hin phn ln ho trong h
thng th20, 51].
Mt s a GABA vi sc khe ci:
- Gim bt trt an,  ng 
- u tr mt t ch tm thi quan h gia vic thi
hing mt t ch a mt s bng h
b  a s  n
kinh ti s mt t ch ca b
- Stress    
mt cht dn t  gim bng
u hiu lo l
t c s 
- Gim trm cm.
- Vic s di thuc an th
ng hong lon.

-    u tr c tr i lo
c thi k kinh nguyt (PMS - i vi ph n.
1.2. Cấu trúc và hình dạng của GABA
         
nhng ca GABA ph thuc nhiu kin c

4

ng.  trn li nhiu l to ra sa
  c
cn mng khong 50 kcal/mol.  trng
mch thi dng mch thc trans  
amin cung cis   
t d   trng, GABA tn
ti  nhiu dng c   m dng g  ng mch thng.
 kh n ti  nhiu dng c
nhiu chc quan trng [20, 22].

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]
1.3. Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não
a h thng thng
hm c 
 c tng hng
i chc bin cui ca
-glutamate bng s
t ca enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nh 
hiu thn kinh [20, 22].
ng GABng t u t n kinh s
c mt enzym g  -aminobutyric acid transaminase (GABA- 
gim bt [20]. M- tham gia tng hp GABA t semialdehyde

n cng
cht c ch hong ca GABA-ng ln GABA  trong
20o GABA ca GAD c tham gia ca vitamin

5

  c g --   t cofactor [32].
 
Hình 2: Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
 m b      ng c   c bi  
neuron th trong vic gim bt s hong ca
c ch s lan truyn c n truyu.

bng vic chim gi hoc khng ch p nhn tin c 20].
Do vi thic tinh thn. Cho ti
nay, nhiu khoa h i
c ng i thin kh t t ch tm th 
ri lon ng thinh trm cm, trc thi k
kinh nguyt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54].
1.4. Enzym tổng hợp GABA
L-glutamate decarboxylase (GAD)     n ng tng hp
GABA t Glutamate khi lo CO
2
. GAD tn ti hai dng
 c
c lp nm sc th s 
10  i, gen GAD65 n  2
[20, 40].       kh    n kinh GABAergic
c li, GAD65 ch yy  tn

6

h t dn truyn thn kinh. Hot
ng ca enzym GAD cn m52].
1.5. Thụ thể GABA
Th th GABA bao gm: th th GABA
A
n phc h 
n kt vi phi t; th th GABA
B
thuc h th th m v m
[20, 39].
Th th GABA
A
 l protein. Tt c u
 n cu ph 
 n loop ln, cun cui C
ng  hp bng nhc
sp xp to ra m
-
 . GABA
A
n
u khiu hing t   n
kinh sn xuc g
c ch  ng vng 
[39]. 17-20% neuron thu ha
c t th GABA
A
ng vng,

GABA hong   t vi th th 
 n kinh.  dn ti m  

-
 
  tn th   n
ti v  trc rt mnh [20].





Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABA
A
[59]



7

Th th GABA
B
 
B1

B2
GABA
B1

 n dng phi t   

B2
 m v  
 u. Th th GABA
B
c ng d 
i thuu tr c hu v
kh    n xu     u trm cm
[20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABA
B
[59]







Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA [52]
1.6. Sản xuất GABA từ vi sinh vật
Hin xut nhing
hn:  cacbon c t ca GAD [11, 8]
chit t c [24, 27], tu kin t ht go ny m
ng GABA gn 15,8 g/100 g go [36m g 

8

chuyt hiu sum go [36] hou
ng vi sinh vt [9, 11, 37, 55] s dc bit vi

khun lactic  sn xut GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,
47, 53].
Vi khun lactic      c rt nhi  u g 
ch n xut GABA [24]. B, vi khun lactic ng hot
 c bi  dc
 c kh i [10, 15, 23, 29, 30, 34]. Do vy, GABA
c sn xut t vi khun lactic n cht t t c khe
]. Nhiu sn ph
ng GABA bng s dng nhng GABA sn xut t vi khun lactic c
p t sn phm c], s], phophat [35
nhng sn ph ]. Mng sn xuc chng
n xut GABA  i th n [28]. Chng
hn, chng Lactobacillus brevis p t paocai Trung Quc [32
c n GABA trong d    mM. Leuconostoc
p t sn ph n
800 mM [6c bit, chng Latobacillus sakei B2-p t kim chi
  dch chio vi n 660
mM [28]. Vic vi khun lactic dh ng h
m ra mt trin vng mi v n xut GABA.
t s vi sinh vt  c ng
dng chng hn k n xu
m ].
Lactobacillus (vit tng
trc khu     thu        gen
   y trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25
Lactococcus lactis subsp. Lactis [34].

9

p k n m ra mu
mi vc hop cht hn gc
t thc phm.Vic s dng hc
 u r   ng dng trong thc t. Hin nay, vi  
Lactobacillus plantarum  tng hp GABA t c ngua ca
    ng m y ti  Ho ng ca GAD trong
Lactobacillus plantarum o v vi khun chng li pH thp cng.
Sau khi hp th L-glutamate t c hiu, GAD s hn ng
-glutamate trong t t, d mt proton trong t
t qu  pH ca t i
L- [25, 14].
1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) 
sn xut Axit gamma-aminobutyric (GABA) bng vi khun lactic [28t
dng mui ca glutamic axit. MSG trong t  
th c phc bit c phm chng protein
cao chng ha, thu loc phm
ng s d to ra v c bit ti kho c. Vi
v c bit ct Bt
 u loi thc ph
bng cao. Trong sa c ng
MSG chim t l cao nht so vt s loi thuc cao
c ho n kinh  chut cng mi sinh. Tuy
          y ra trong thc ph 
 nhng chng minh khoa hng b MSG
t gia v thc ph nguy hn sc kh
 truy  trong th mt s

 ca t n kinh s t to ra nhc t dn tng ho

10

ti t  c cho t 
thn kinh  tr i 5 tui. Bi vy, s d
i].
1.8. Thực phẩm chức năng GABA
Hin nay, thc phm ch (TPCN)  bi
th ng sn phng hi dng
 ung, thc phm, kem, d   o  Vit Nam, thc phm chc
 n phu vn
p khu [58].
1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA
a nhiu cht quan tr
B6, ma- -gan, s       n ch y  
polysaccharide [1, 7, 12, 13, 11]. c ch m
m cholestert cho h tim mch ca ph n 
ng thi, vi chng li bng mnh, gim
c bnh ting. M c
phm cho con   i mt
ng ln cho mng h min dy,  mt s 
 t ngun sn xui nhng
u kin t ng ca GAD t
 /100 g o [36
g dng Lactobacillus  ch
u su 1 kg
 c b         i 679
o [28].
1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam
Ti Vit Nam, t s  cu v 
t GABA t c d  u

11

 sn xut mt s thc phm chng bnh
 Thc phm ch  ng dng
sn xut  mp vu qu  dng ngu
lit tia, sn phm t ng d
thc phm chn ch v m tra hoc.
 mt s c ca Trung Quch
khong 40ng/kg. i nay v
c dt ngun xut
GABA. u  c rt di
 p  s d 
mt trong nhn xup.
1.9. Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể
, t t nhit yu cho s s
hong cht dn truyn th
t  i nhng chc thc hi
 n gc t  th g
  th  t trong t t (th
th   th  i th th ca
, th th GABA thuc h th th ng th th  
nh nhn dng cu t   t nhng ng
truyu    th c bit t 
phi nhiu loi ba bnh ca gi thuc y hc
hii hi 
hp chc d thc ti
s c tip cp cht mi (hon gc tng hp,
hon gc t  th u.
T kt qu p chc hiu v

th p chc ti
tip tc c cp

12

 t  c  . Trong thc t    sinh h    
protein th th c ngot v m trong vit
k p chc tic bi
tin v mi quan h t c - cp ch
 th ng rt nh mt
hp cht hoc dch chit mi (ch cn  ng thp t 5 mg n 10 mg) v kh
c tip c c [59].
c s dng r c ta u d s
dt g 
c hi nhng th
lt gn vi protein th thc l nhiu hn
ch chng h:  n sc khe, cng
ng xung quanh, ct k 
nghim b, trang thit b  t
li    Hin nay, m    d ng v
 t gc hiu hunh quang b
th th c s d bi gi
  cao. V         tip c c mt
   c mi hi  dng rt nhiu    gi  
throughput screening. m khoa hc bic s
di thuc sinh h
hu
u kin v kic hc di truyn, 
nhn dp ch u khin
 sinh hc c th. Nhng kt qu c 

u to ra nhng loi thuc mu c
c .nh hin nay ca Vit
  y, vic
u hunh quang hou th cp

13

khi th th ho ng dc trong
u kin thc t ca Vit Nam hin nay [17].
 th ng cn
c thit lh vic s d.
 th t chn gia
t ch vi v ng dng cho phn l
th. Do vc chi vi th th Gt trin
g
-
  th t
vi GABA. T 
-
s bt mu vi Iot. Do vy, vi
 bc bp ph 405 
 thc hin trong nhi s ng gi
96, 384, 1536, 3456. [17a ch
d  u.

14

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Vi sinh vật
Chng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) c cung cp b
nghim Tr - i hc Khoa hc T

2.1.2. Các mẫu cám gạo
o  (gi ng bu Long
(gimua trc tip t  ngu

2.1.3. Các dòng tế bào
 -1  hp th th GABA mua t ATTC ca M.
   t n kinh chut nht trng Swiss c cung
cp bm Tr - i
hc Khoa hc T 
2.1.4. Máy móc và dụng cụ
y t  c
c n nhi, HPLC (Simazu) u thit b
enzym hc.
2.1.5. Các hóa chất, nguyên liệu khác
Agar, peptone, cao nm men, glucose, cao tht, CH
3
COONa, Tri ammonium

citrate, MgSO
4
, Monosodium glutamate (MSG), Tween, CaCO
3,
Sucrose, Borate,
2-   acetic, ninhydrin, methanol, acetonitrile, LaCl
3
,
o-phthaldialdehyd, 1-butanol, K+pyroph -Nicotinamide adenine, NaCl,
dinucleotide phosphate hydrate, GABASE, -ketoglutarate, NaI, GABA chun,
), GFX PCR, Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences).    One Solution
Cell Proliferation Assay, Promega, M), Triton X-100, citrate, malate, Tripsin,

15

2-morpholinoethanesulfonic (MES), Pyridoxal 5-   
trichloroacetic (TCA), triethylamine, phenylisothiocyanate (Sigma, M). Fetal
bovine ng DMEM, (Invitrogen, M).
Sn mng TLC (Meck), i (50 ml, 15 
96 gi  ng, 




cy vi khuy t My t u
i (1 ml; 0,2 ml)  (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tit
y t  ml, 5 ml, 10 ml, 50 y tinh duran
i (Inovagen, M). c vi khun c).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS
Công thức
gram/ lít
Peptone
10
Cao tht
10

5
Glucose
20
Tween

Dipotassium hydrogen phosphate
2
CH
3
COONa
5
Triammonium citrate
2
MgSO
4

0,1
MnSO
4

0,05
Agar
10

16


ng MRS vng 1, chnh pH=6, b sung 1
c ctng thit b khuy t 
 ng ni hp (ALP, Nht)  
+ Chc bo qun  4
o
- 6
o
C c cng
 y ria  37
o
C trong 24 gi.
+ Khun lng cp II vng MRS l

2.2.1.2. Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1
Chng KC1 s c c c
vi t  nhi . Dy sau khi ly
   
sinh GABA.
2.2.1.3. Đánh giá chất lƣợng cám gạo
   ng protein, lipid, tro tng s, chng s,
mnh vt sc nhc kim nghim.
 Phương pháp xác định độ ẩm
Vi m cc ti-4326-86.

+ S nhi  ngu
+ Li mu (S1)
y.
+ i m sy, sy  nhi 100-ng 6-8 gi 
ngun nhi n trng mi (S2).
 m: S1 - S2 (g).
 Phương pháp xác định hàm lượng protein
Vi    nh         ng theo


17

 Phương pháp xác định hàm lượng lipid
+ Sy c nhi 100-i gian 2-3 gi. Gp c
 ngui  nhi ng cc (B).
u (ng bng gi chit sut m
mu mt l m ng mu. L ng m 
ct mu.
+  khong 70 ml ete- -p cc
 t mu.
t mu trong thi gian 45-
y cy  nhi 100-
+ Gp c  ngung c thu
c (A).
t qu: A - B (g).
T - Trng cc  m (g).
B - Trng ct (g).
 Phương pháp xác định tro tổng số
Tro u bng nhit:
+ Chun b mu.

+ Ra sch cc nung bc, sy trong t sy  105


nung  525

 n 
c lp ln khi ci i.
+  n b.
+ Sy trong t sy  nhi 105

n khng khi.
+ Nung  nhi 525


m.
+ c lp ln khi ci.
t qu: X = m
2
- m
1
(g).