Nghiên cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và tinh sạch FOS bằng phương pháp lọc nano

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA





LÊ THỊ HỒNG ÁNH





NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SACCHAROSE
THÀNH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)
VÀ TINH SẠCH FOS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC NANO




LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT








TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA




LÊ THỊ HỒNG ÁNH




NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SACCHAROSE
THÀNH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)
VÀ TINH SẠCH FOS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC NANO




Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và đồ uống
Mã số chuyên ngành: 62540201
Phn bin đc lp 1: PGS. TS Nguyễn Thị Xuân Sâm
Phn bin đc lp 2: PGS. TS Lý Nguyễn Bình
Phn bin 1: GS. TSKH Lưu Duẩn
Phn bin 2: PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng
Phn bin 3: PGS. TS Mai Thanh Phong

NGƯI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Đống Thị Anh Đào
2. TS. Nguyễn Hữu Phúc

i

LỜI CAM ĐOAN
Tc gi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu ca bn thân tc gi. Cc kết
qu nghiên cứu và cc kết lun trong lun n này là trung thực, và không sao chp t
bt cứ mt nguồn nào và dưi bt k hình thức nào. Vic tham kho cc nguồn tài liu
đã đưc thực hin trch dn và ghi nguồn tài liu tham kho đúng theo yêu cu.
Tc gi lun n
Lê Thị Hồng Ánh

ii

TÓM TT LUN ÁN
Sn xut prebiotic và bổ sung prebiotic vào thực phẩm là xu hưng nổi bt ca
cc nghiên cứu trong lĩnh vực công ngh thực phẩm hin nay trên toàn thế gii. Mt
trong những prebiotic đã và đang đưc quan tâm nhiều là Fructooligosaccharides
(FOS). Chnh vì vy, vic nghiên cứu sn xut FOS có đ tinh khiết cao, phù hp vi
tiêu chuẩn chế biến thực phẩm t nguồn nguyên liu trong nưc tht sự là vn đề cn
quan tâm và pht triển.
Để góp phn gii quyết vn đề trên, lun n tiến hành nghiên cứu cc yếu tố nh
hưởng, đng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme
Fructosyltransferase (FTS) và nghiên cứu nâng cao đ tinh khiết ca FOS bằng
phương php lọc nano. Lun n đã đạt đưc mt số kết qu chính như sau:
1) Kết quả nghiên cứu lý thuyết
 Xây dựng đưc mô hình đng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành
FOS bằng enzyme FTS.
 Xc định đưc quy lut nh hưởng ca mt số thông số công ngh đến kh
năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano và
đề xut phương n lọc tun hoàn kết hp pha loãng để nâng cao đ tinh
khiết ca FOS.
2) Kết quả nghiên cứu thực nghiệm
 Đã xc định cc thông số đng học ca enzyme FTS bằng phương php gii

thut di truyền, giúp gim thiểu số th nghim, thời gian và chi ph khi
nghiên cứu đng học phn ứng enzyme, đặc bit trong trường hp phn ứng
có nhiều cơ cht.
 Xây dựng đưc phương trình hồi quy thực nghim mô t nh hưởng ca
nhit đ, pH, nồng đ saccharose ban đu và tỷ l enzyme đến hiu sut
chuyển hóa saccharose thành FOS, t đó xc định đưc điều kin tối ưu cho
qu trình tổng hp FOS.

iii
 Đã tối ưu hóa cc thông số công ngh ca qu trình lọc nano bằng phương
php vùng cm và lựa chọn chế đ lọc tun hoàn thch hp để nâng cao đ
tinh khiết ca FOS đến 86,7%.
Những kết qu trên bưc đu đã tạo tiền đề cho vic triển khai công ngh, ứng
dụng vào thực tế, đồng thời là nguồn tham kho tin cy cho những nghiên cứu tiếp
theo trong cùng lĩnh vực.

iv
ABSTRACT OF THESIS
Nowadays, producing prebiotic and supplement prebiotic in food products is
considered a worldwide prominent trend in food technology. One of the most
important prebiotics that has gotten interest is Fructooligosaccharides (FOS). Hence,
the study of producing high purity for FOS that can meet the food processing standards
from domestic materials must obviously be put into consideration.
In order to solve the above issue, this dissertation aims to study the influencing
factors, the kinetics of FOS synthesis from sucrose using Fructosyltransferase enzyme
(FTS), and the improvement of purity for FOS by nanofiltration. The major results are
found as follows:
1) Theoretical results
 A kinetics model of FOS synthesis from sucrose using FTS enzyme was
performed.

 Rules of main factors influencing of some technological parameters on the
separation of monosaccharides, saccharose and FOS by nanofiltration were
determined and the technique of diafiltration to enhance the purity of FOS
was also proposed.
2) Experimental results
 The kinetic parameters of FTS enzyme by genetic algorithm method were
determinated. The result helped reduce the quantity of experiments, time
and cost related to study of kinetics of FTS enzyme, especially in case of
multiple substrates.
 The regression equation which stimulates the effects of temperature, pH,
initial sucrose concentration and rate of enzyme on the performance of
transforming saccharose into FOS was established, from which the
optimum conditions of FOS synthesis was proposed.
 Main parameters of nanofiltration process were optimized by restricted area
method. Moreover, the optimum diafiltration mechanism was also set to
increase the purity of FOS to 86.7%.

v
These results have established beginning steps for the application of new
technology into practice. In addition, results found in this dissertation would be useful
reference for coming research in the same field.



vi
LỜI CẢM ƠN
Lun n đưc hoàn thành là kết qu sự nỗ lực ca bn thân cùng những giúp đỡ,
đng viên tinh thn ca cc thy, cô, gia đình, đồng nghip, bạn bè.
Vi tt c sự chân thành, tôi xin trân trọng cm ơn PGS.TS Đống Thị Anh Đào
đã tn tình hưng dn, nâng bưc tinh thn cho tôi trong suốt thời gian va qua; xin

cm ơn TS. Nguyễn Hữu Phúc đã giúp đỡ, góp ý cho lun n.
Tôi muốn gửi lời cm ơn sâu sắc đến gia đình b nhỏ đã tạo điều kin cho tôi
nghiên cứu, yên tâm làm vic, cm ơn cc con Vĩnh Liêm, Viên Phương và Thục Khuê
đã mang lại niềm vui và nhit tình cho mẹ.
Đặc bit, cm ơn người bạn Như Nguyn đã st cnh nghiên cứu cùng tôi, tng
ngày tng ngày, dù đã ở tht xa, vn luôn hỗ tr và đng viên tôi hoàn thành lun n
này.
Tôi cũng xin cm ơn Khoa Kỹ thut Hóa học – Trường Đại học Bch khoa, tp
thể đồng nghip khoa Công ngh thực phẩm – Trường Đại học Công nghip thực
phẩm TP.HCM đã giúp đỡ và chia sẻ vi tôi trong thời gian va qua.
Leâ Thò Hoàng AÙnh


vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
TM TT LUN N ii
ABSTRACT OF THESIS iv
LỜI CẢM ƠN vi
MỤC LỤC vii
DANH MỤC CC HÌNH ẢNH ix
DANH MỤC CC BẢNG BIU x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TT xii
MỞ ĐẦU 1
1. TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH 4
1.1. FOS và prebiotic 4
1.2. Cc phương php tổng hp FOS t saccharose 8
1.3. Đng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS 14
1.4. Cc phương php nâng cao đ tinh khiết ca FOS 19
1.5. Ứng dụng phương php gii thut di truyền (GA - Genetic Algorithm) vào bài

ton tìm kiếm và tối ưu 30
1.6. Những vn đề tồn tại trong công ngh sn xut FOS 32
1.7. Hưng nghiên cứu và ni dung nghiên cứu ca lun n 33
2. NGUYÊN VT LIỆU, HA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHP
NGHIÊN CỨU 36
2.1. Nguyên liu 36
2.2. Hóa cht 36
2.3. Màng lọc nano 37
2.4. Thiết bị 39
2.5. Phương php nghiên cứu 40
2.6. Phương pháp phân tích 41

viii
3. NGHIÊN CỨU CC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG
CHUYN HA SACCHAROSE THÀNH FOS BẰNG ENZYME FTS THU
NHN TỪ
ASPERGILLUS FLAVIPES
43
3.1. Tổng hp FOS t saccharose bằng enzyme FTS 43
3.2. Nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng đến qu trình tổng hp FOS t saccharose
bằng enzyme FTS 44
3.3. Nghiên cứu đng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng
enzyme FTS thu nhn t Aspergillus flavipes 51
3.4. Đnh gi mức đ tương thch ca mô hình ton học đã xây dựng vi thực
nghim 69
3.5. Kết lun 71
4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO ĐỘ TINH KHIẾT CỦA FOS BẰNG PHƯƠNG
PHP LỌC NANO 72
4.1. Nghiên cứu lựa chọn màng lọc nano để tinh sạch FOS 72
4.2. Nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng đến kh năng loại bỏ glucose, fructose và

saccharose ra khỏi dung dịch FOS sau tổng hp bằng phương php lọc nano 74
4.3. Nghiên cứu nh hưởng ca phương thức pha loãng trong qu trình lọc nano
đến đ tinh khiết và hiu sut thu hồi FOS 99
4.4. Kiểm tra cht lưng, xc định tổng hiu sut thu hồi sn phẩm FOS 85% 111
4.5. Kết lun 113
5. KẾT LUN VÀ KIẾN NGHỊ 114
5.1. Kết lun 114
5.2. Kiến nghị 115
6. CC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TC GIẢ 116
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 117

ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tỷ l tiêu thụ cc loại prebiotic trên thế gii năm 2008 4
Hình 1.2. Cu trúc ca mt số phân tử FOS 5
Hình 1.3. Sơ đồ h thống sn xut FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao đ
(Neosugar P) sử dụng phương php lọc gel 13
Hình 1.4. So snh kết qu giữa dự đon theo mô hình ton học và thực nghim 18
Hình 1.5. So snh kết qu giữa dự đon theo mô hình ca Lee và thực nghim vi
nồng đ saccharose ban đu là 400g/L 19
Hình 1.6. So snh kết qu dự đon theo mô hình ca Rocha và thực nghim 19
Hình 1.7. Sơ đồ h thống phức hp sn xut FOS cao đ theo nghiên cứu ca
Sheu và cng sự 24
Hình 1.8. Sơ đồ h thống th nghim vi bình phn ứng có tch hp b phn
lọc màng trong nghiên cứu ca Nishizawa và cng sự 26
Hình 2.1. H thống thiết bị lọc nano sử dụng màng dạng cun xoắn 39
Hình 3.1. Quy trình tổng hp FOS t saccharose bằng enzyme FTS 43
Hình 3.2. Lưu đồ thut ton xây dựng qun thể bằng phương php ngu nhiên 59
Hình 3.3. Lưu đồ thut ton tìm nghim tối ưu bằng phương php gii thut
di truyền 66

Hình 3.4. So snh giữa mô hình đng học phn ứng tổng hp FOS bằng enzyme
FTS vi thực nghim 70
Hình 4.1. Sơ đồ h thống thiết bị lọc nano 73
Hình 4.2. Ảnh hưởng ca nhit đ ti đ phân riêng và tốc đ dòng qua màng 77
Hình 4.3. Ảnh hưởng ca nồng đ ti đ phân riêng và tốc đ dòng qua màng 82
Hình 4.4. Cơ chế qu trình lọc nano 83
Hình 4.5. Ảnh hưởng ca lưu lưng ti ti đ phân riêng,tốc đ dòng qua màng 87
Hình 4.6. Ảnh hưởng ca p sut ti đ phân riêng và tốc đ dòng qua màng 90
Hình 4.7. Ảnh hưởng ca nồng đ nhp liu ti tốc đ dòng (DS-5-DL) 99
Hình 4.8. Sự thay đổi ca nồng đ cc đường, đ tinh khiết ca FOS, hiu sut
thu hồi FOS theo số bưc lặp đối vi cc phương thức pha loãng khc nhau
(màng DS-5-DL) 104
Hình 4.9. Sự thay đổi ca nồng đ cc đường, đ tinh khiết ca FOS, hiu sut
thu hồi FOS theo số bưc lặp đối vi cc phương thức pha loãng khc nhau
(màng G5) 108
Hình 4.10. Sắc ký đồ FOS phổ thông và sn phẩm FOS cao đ 112


x
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bng 1.1. Tổng kết thị trường prebiotic trên thế gii giai đoạn 2004-2009 và
dự đon giai đoạn 2009-2014 4
Bng 1.2. Tỷ l bổ sung FOS vào mt số thực phẩm 7
Bng 1.3. Thông số đng học ca mt số enzyme FTS 17
Bng 1.4. So snh cc phương php tinh sạch FOS 28
Bng 2.1. Chỉ tiêu cht lưng ca đường saccharose 36
Bng 2.2. Đặc tnh ca enzyme FTS 36
Bng 2.3. Thông số kỹ thut ca màng M-N2514A5 37
Bng 2.4. Thông số kỹ thut ca màng DS-5-DK 38
Bng 2.5. Thông số kỹ thut ca màng DS-5-DL 38

Bng 2.6. Thông số kỹ thut ca màng G5 38
Bng 2.7. Thông số kỹ thut ca màng GM 39
Bng 3.1. Mức và khong biến thiên ca cc yếu tố trong qu trình chuyển hóa
saccharose thành FOS sử dụng enzyme FTS 45
Bng 3.2. Kết qu thực nghim theo ma trn TYT 2
4
45
Bng 3.3. Ảnh hưởng ca thời gian phn ứng đến qu trình tổng hp FOS bằng
enzyme FTS 50
Bng 3.4. Qun thể đưc xây dựng bằng phương php ngu nhiên trong giai
đoạn 1 60
Bng 3.5. Thông số đng học ca enzyme FTS thu nhn t Aspergillus flavipes
xc định bằng phương php gii thut di truyền 67
Bng 4.1. Kh năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS ca cc màng 73
Bng 4.2. Bố tr th nghim nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng đến qu trình lọc nano
(Màng DS-5-DL) 74
Bng 4.3. Bố tr th nghim nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng đến qu trình lọc nano
(Màng G5) 75
Bng 4.4. Kết qu kho st nh hưởng ca nhit đ đến qu trình lọc nano 76
Bng 4.5. Kết qu kho st nh hưởng ca nồng đ nhp liu đến qu trình lọc nano 81
Bng 4.6. Kết qu kho st nh hưởng ca lưu lưng nhp liu đến qu trình
lọc nano 85
Bng 4.7. Kết qu kho st nh hưởng ca p sut đến qu trình lọc nano 88
Bng 4.8. Mức và khong biến thiên ca cc yếu tố (màng DS-5-DL) 93
Bng 4.9. Ma trn thực nghim toàn phn, k=2 và kết qu (màng DS-5-DL) 93

xi
Bng 4.10. Mức và khong biến thiên ca cc yếu tố (màng G5) 94
Bng 4.11. Ma trn thực nghim toàn phn, k=2 và kết qu (màng G5) 95
Bng 4.12. Bố tr th nghim lọc tun hoàn có pha loãng 100

Bng 4.13. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức CVD
(Màng DS-5-DL) 101
Bng 4.14. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,95:1 (Màng DS-5-DL) 102
Bng 4.15. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,90:1 (Màng DS-5-DL) 103
Bng 4.16. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
CVD (Màng G5) 105
Bng 4.17. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,95:1 (Màng G5) 106
Bng 4.18. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,9:1 (Màng G5) 106
Bng 4.19. Kết qu th nghim lọc tun hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,85:1 (Màng G5) 107
Bng 4.20. Số bưc lặp trong cc phương thức pha loãng 110
Bng 4.21. Hiu sut thu hồi FOS trong cc phương thức pha loãng 110
Bng 4.22. Cc phương thức pha loãng có thể p dụng để tinh sạch FOS 111
Bng 4.23. Kết qu kiểm tra cht lưng sn phẩm FOS 85% 111


xii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TT
Chữ viết tắt
Thuật ngữ tiếng Việt
CAT
Catalase
CVD
Phương php lọc tun hoàn vi thể tch không đổi
F
Fructose

FOS
Fructooligosaccharides
FTS
Fructosyltransferase
G
Glucose
GF
Saccharose
GF
2

1-kestose
GF
3

Nystose
GF
4

1
F
- Fructosylnystose
GI
Glucose isomerase
GO
Glucose oxidase
MF
Quá trình vi lọc
MWCO
Gii hạn khối lưng phân tử

NF
Qu trình lọc nano
RO
Qu trình lọc thẩm thu ngưc
SCFA
Acid bo mạch ngắn
UF
Quá trình siêu lọc
VVD
Phương php lọc tun hoàn vi thể tch thay đổi
w/w
khối lưng/khối lưng
w/v
v/v
khối lưng/thể tch
thể tch/thể tch


1
MỞ ĐẦU
Fructooligosaccharides (FOS) ngày càng đưc sử dụng rng rãi để bổ sung vào
thực phẩm như sữa, bnh kẹo…vì những đặc tnh sinh học có li cho cơ thể con người.
Cc nhà khoa học đã chứng minh FOS có kh năng ci thin h vi sinh vt hữu ch
trong đường rut (Bifidobacteria, Lactobacilli), t gây sâu răng, gim lưng
triglycerides trong mu, tăng kh năng hp thu canxi cho cơ thể… nên có tc dụng tốt
đối vi trẻ em, người già, cc bnh nhân tiểu đường, bo phì, mỡ mu…[1], [2], [3],
[4].
Tại Vit Nam, người tiêu dùng đã quen vi mt số thực phẩm đưc bổ sung FOS
như sữa bt Ensure, Nestle, Dielac, mt số loại bnh (Kinh Đô, Bibica), kẹo… Mặc dù
nhu cu tiêu thụ FOS tại Vit Nam rt cao nhưng hin nay thị trường sn xut FOS

trong nưc chưa pht triển, cc nhà my vn sử dụng 100% sn phẩm FOS ngoại nhp
t cc hãng Orafti (Bỉ), Meiji Seika Kaisha (Nht)… Cũng chnh vì vy, nghiên cứu
công ngh sn xut FOS t saccharose và sn xut ở quy mô pilot đã đưc chnh ph
quan tâm và đưa vào ni dung chnh trong chương trình nghiên cứu trọng điểm quốc
gia pht triển công nghip hóa dưc đến năm 2020 (quyết định số 61/2007/QĐ-TTg
ca Th tưng chnh ph ký ngày 7/5/2007). Do đó, vic nghiên cứu quá trình chuyển
hóa saccharose thành FOS và tinh sạch để thu đưc FOS có đ tinh khiết cao (>75%),
t nguyên liu sẵn có trong nưc, thay thế FOS nhp ngoại, là vn đề thực sự cn thiết,
có ý nghĩa khoa học, có gi trị thực tiễn và tnh xã hi cao.
Mục tiêu của luận án:
(1) Nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng và đng học phn ứng chuyển hóa
saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhn t Aspergillus
flavipes nhằm lựa chọn cc thông số công ngh thch hp và thông qua mô hình hóa về
đng học phn ứng, có thể dự đon đưc nồng đ saccharose, glucose, fructose, FOS
theo thời gian phn ứng, tăng kh năng ch đng điều khiển qu trình tổng hp FOS.
(2) Nghiên cứu nâng cao đ tinh khiết ca FOS bằng phương php lọc nano,
khẳng định tnh ưu vit ca phương php này so vi cc phương php truyền thống
như lên men, enzyme.

2
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
(1) Đã nghiên cứu mt cch có h thống về công ngh sn xut FOS, bao gồm c
chuyển hóa tạo FOS và tinh sạch đến đ tinh khiết 86%, phù hp vi tiêu chuẩn sử
dụng cho thực phẩm. Đặc bit, đã chứng minh đưc cơ chế phn ứng chuyển hóa
saccharose thành FOS bằng enzyme FTS thông qua mô hình đng học và dữ liu thực
nghim. Cc kết qu thu đưc có ý nghĩa như những bưc khai ph ban đu để cc nhà
khoa học công ngh khc tham kho khi nghiên cứu về lĩnh vực này.
(2) Đã xc định đưc cc thông số công ngh tối ưu và xây dựng mô hình ton
học mô t đng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS
dưi dạng h phương trình vi phân. Đây là cơ sở khoa học quan trọng cho vic tiến ti

ch đng điều khiển qu trình tổng hp FOS, hưng ti quy mô công nghip.
(3) Ln đu tiên đã ứng dụng thành công phương php gii thut di truyền (GA –
Genetic Algorithm) để xc định cc thông số đng học ca enzyme FTS và tối ưu hóa
thông số công ngh ca qu trình lọc nano bằng phương php vùng cm. Thành công
bưc đu này đã chứng minh mt cch thuyết phục rằng ứng dụng lý thuyết ton học
vào gii quyết cc vn đề ca khoa học công ngh sẽ mang lại hiu qu tốt, chnh xc,
rút ngắn khong cch giữa ton học vi cc ngành khoa học công ngh.
(4) Đã xc định đưc quy lut nh hưởng ca nhit đ, nồng đ, lưu lưng, p
sut đến kh năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano
và xc lp đưc chế đ lọc nano thch hp nhằm nâng cao đ tinh khiết ca FOS.
(5) Vic ứng dụng thành công màng lọc nano để tch cc cu tử có kch thưc
phân tử như glucose, fructose, saccharose… ra khỏi hỗn hp nhiều cu tử là gi ý có
sức thuyết phục cc nhà khoa học Vit Nam trong vic nghiên cứu vt liu nano ứng
dụng vào thực tế sn xut cc qu trình ca công ngh cao như tinh sạch enzyme,
khng sinh, cc hoạt cht sinh học…
Lun n đưc trình bày trong 115 trang, chia làm 5 chương bao gồm:
 Mở đu (03 trang).
 Chương 1: Tổng quan, hưng nghiên cứu và ni dung chnh (32 trang).
 Chương 2: Nguyên vt liu, hóa cht, thiết bị và phương php nghiên cứu

3
(07 trang).
 Chương 3: Nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng và đng học phn ứng chuyển
hóa saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhn
t Aspergillus flavipes (29 trang).
 Chương 4: Nghiên cứu nâng cao đ tinh khiết ca FOS bằng phương php
lọc nano (42 trang).
 Chương 5: Kết lun và kiến nghị (02 trang)

4
1. TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH
1.1. FOS và prebiotic
Prebiotic là nguồn thức ăn cho cc vi sinh vt sống hữu ch trong đường rut vt
ch. Nhờ có prebiotic mà vi sinh vt hữu ch có điều kin pht triển mạnh mẽ hơn, do
đó ci thin h tiêu hóa cho vt ch.
Trên thế gii có trên 400 sn phẩm prebiotic t hơn 20 công ty sn xut. Ở châu
Âu, tổng doanh thu ca thực phẩm chức năng vào năm 2005 là khong 8 tỷ euro, trong
đó phân đoạn prebiotic khong 87 triu euro. Kh năng sn xut prebiotic ở châu Âu
ưc tnh khong 30.000 tn/năm, bao gồm Inulin, Oligofructose, Fructo-
oligosaccharides (FOS), Galacto-oligosaccharides (GOS) và Lactulose, trong đó FOS
chiếm 19,7%. Thị trường oligosaccharides tăng trưởng khong 15% mỗi năm [5], [6].
Bảng 1.1. Tổng kết thị trường prebiotic trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và dự
đoán giai đoạn 2009-2014 [7]
Năm
Tổng doanh thu (triệu USD)
Năm
Tổng doanh thu (triệu USD)
2004
2005
2006
2007
2008
2009
268,13
291,72
317,50
349,42
406,03
466,59

2010
2011
2012
2013
2014
526,41
585,84
645,29
705,08
765,85

Hình 1.1. Tỷ lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thế giới năm 2008 [6]
Cc prebiotic đưc bổ sung nhiều vào thực phẩm là fructo-oligosaccharides
(FOS), galacto-oligosaccharides (GOS), isomalto-oligosaccharides (IMO), inulin và
oligosaccharides đu nành [8]. Trong số đó, FOS đưc cc nhà nghiên cứu đặc bit
quan tâm bởi chúng có nhiều hoạt tnh sinh học tốt cho cơ thể ca người, dễ thu nhn

5
và phạm vi ứng dụng rng rãi.
Meiji Seika Co. là công ty đu tiên sn xut FOS thương mại t saccharose vi
tác nhân là Aspergillus niger vào năm 1984. Sn phẩm đưc đưa ra thị trường Nht
Bn vi tên gọi Meioligo (Neosugar). Công ty này sau đó thiết lp mt liên doanh vi
Beghin-Say ca Php và sn xut FOS vi tên thương mại Actilight. Ngoài ra, công ty
Cheil Foods & Chemical ca Hàn Quốc cũng đã sn xut FOS ở quy mô công nghip
vi tác nhân là cc tế bào Aureobasidum pullulans cố định [5], [9], [10].
1.1.1. Định nghĩa, cấu tạo, nguồn gốc của FOS
FOS là các oligomer fructose vi cc nhóm fructosyl đưc gắn vi saccharose ở
vị tr β-2.1, thường đưc mô t bằng công thức GF
n
, trong đó G chỉ nhóm glucosyl và

F chỉ nhóm fructosyl, n là số nhóm fructosyl [11]. Cc dạng phổ biến nht ca FOS là
1-kestose (GF
2
), nystose (GF
3
) và 1
F
-fructofuranosyl nystose (GF
4
) [12].
FOS có nhiều trong cc loại thực vt như hành, măng tây, lúa mì, lúa mạch,
artichoke Jerusalem [13], chuối, mn, hành, hẹ tây, c chicory [14]. Quá trình trích ly
FOS t những nguồn này ở quy mô công nghip không có tnh kinh tế do nồng đ
FOS trong nguyên liu rt thp. Vì lý do đó, FOS thương mại đưc sn xut bằng
phương php tổng hp t sacharose hoặc thy phân t inulin [15].

Hình 1.2. Cấu trúc của một số phân tử FOS [16]

6
1.1.2. Vai trò và ứng dụng của FOS
Mt số tc gi khi nghiên cứu về tnh cht hóa lý ca FOS đều đưa ra kết lun
chung là FOS có nhiều tnh cht hóa lý tương tự saccharose như đ hòa tan, đ đông
đặc, nhit đ sôi và cc thông số về qu trình kết tinh [9], [17]. Tuy vy, khc vi
saccharose, FOS mang nhiều đặc tnh sinh học ưu vit hơn. Đây chnh là đặc điểm
khiến cc nhà thực phẩm chú ý và tp trung khai thc loại đường này.
FOS có kh năng gây sâu răng thp hơn so vi saccharose, do vi khuẩn
Streptococcus mutans trong khoang ming gây sâu răng không sử dụng đưc FOS
[18]. Ngoài ra Ikeda T. (1990) [2] còn nghiên cứu cho thy FOS không chỉ có kh
năng phòng mà còn có kh năng chữa bnh sâu răng. Vì thế ngày nay nhiều nơi trên
thế gii dùng FOS thay thế cho đường saccharose trong thành phn thức ăn hoặc trong

chế biến bnh kẹo, đặc bit là bnh kẹo cho trẻ em để phòng bnh sâu răng.
FOS không bị tiêu hóa ở rut non nên đến đưc rut già mt cch nguyên vẹn.
Tại đây FOS bị lên men bởi h vi sinh vt trong rut tạo thành những acid bo mạch
ngắn (SCFA) như acid acetic, acid propionic, acid butyric làm cho FOS có tc dụng
giống cht xơ: gim to bón, ci thin tnh cht ca phân, ci thin mỡ mu và ngăn
chặn sự tổng hp cc cht thối rữa trong rut. Mặt khc, vic sử dụng FOS còn thúc
đẩy qu trình hp thu Ca, Mg, không làm tăng lưng đường trong mu do FOS không
hoặc rt t bị thy phân bởi h enzyme đường rut. Vì vy FOS thch hp cho người
già, phụ nữ và người bị bnh tiểu đường [3], [4].
Tnh an toàn ca FOS đã đưc chứng minh trong nhiều nghiên cứu khc nhau
(Hidaka và cng sự, 1986; Clevenger và cng sự, 1988; Tokunaga và cng sự, 1989;
Kolbye, 1992; Coussement, 1999) vi kết qu là FOS không có nguy cơ gây ung thư.
Nhiều nghiên cứu tiến hành trên đng vt và người cho thy có rt t tc dụng phụ liên
quan ti vic sử dụng FOS [19]. Cc kết qu nghiên cứu đc tnh đã chứng tỏ FOS
không gây đt biến hoặc sinh qui thai và không tạo ra tc dụng phụ nghiêm trọng
hoặc kh năng gây ung thư ở đng vt sau khi hp thu vi liều lưng lên ti 15% trong
chế đ ăn [20].

7
Bảng 1.2. Tỷ lệ bổ sung FOS vào một số thực phẩm [20]
Loại thực phẩm
Tỷ lệ bổ sung (%w/w)
Thức ăn trẻ em
1,2
Nưc gii kht
1,2
Bánh quy
3,6
Bnh ngọt
1,6 - 3,6

Kẹo
5,0
Bánh cookie
2,5 – 3,3
Bánh quy giòn
1,7 – 3,3
Sữa không bổ sung và có bổ sung mùi
0,4
Kẹo cứng
6,7
Kem
1,5
Mứt và thạch
0,9
Bánh nưng xốp
3,6
Bt ngũ cốc ăn liền
3,3 – 15,4
Kem tri cây và nưc qu
1,4
Súp
0,4
Sữa chua
1,3
FOS đưc bổ sung vào cc loại thực phẩm như nưc gii kht, cc sn phẩm sữa,
bnh kẹo, mứt, thức ăn gia súc [16]. Trong mứt, FOS có thể đưc dùng làm cht tạo
ngọt, sn phẩm có mức năng lưng thp hơn khi so snh vi dùng saccharose. Mặc dù
cc đặc điểm cm quan tương tự nhau, sn phẩm bổ sung FOS có đ ngọt thp hơn và
cu trúc mềm hơn. Trong kem, FOS có thể đưc dùng vi inulin để thay thế đường,
tạo cm gic ngon ming [21].

Ở Nht Bn, FOS đưc dùng phổ biến như cht tạo ngọt, cht điều vị, cht đn
và cht giữ ẩm, bổ sung vào cc sn phẩm thực phẩm như bnh quy, bnh ngọt, bnh
mì, kẹo, cc sn phẩm sữa và mt số loại nưc gii kht thay thế saccharose. Ngoài ra,
FOS còn đuc bổ sung vào mt số loại thực phẩm chức năng để tăng cường sự pht
triển ca vi khuẩn có ch trong tuyến tiêu hóa [17].

8
1.2. Các phương pháp tổng hợp FOS từ saccharose
FOS đưc tổng hp t saccharose bằng phương php lên men vi tc nhân là vi
sinh vt hoặc enzyme theo phương thức liên tục hoặc không liên tục. Trong phương
pháp lên men không liên tục, người ta thường sử dụng tế bào vi sinh vt và enzyme tự
do, còn công ngh cố định enzyme hoặc cố định tế bào đưc sử dụng đối vi phương
php liên tục [22], [23], [24].
Gii php cố định enzyme và cố định tế bào trong sn xut FOS cho hiu qu cao
hơn vì sn xut đưc liên tục, tiêu hao năng lưng t, nhà xưởng nhỏ v.v… nhưng tnh
ổn định km và cn my móc, thiết bị hin đại, nhà xưởng tiêu chuẩn. Mặc dù vy, đây
lại là phương php có kh năng công nghip hóa cao và đưc tp trung nghiên cứu
nhiều ở cc nưc có nền công nghip pht triển như Nht Bn, Trung Quốc, Hàn
Quốc. Phương pháp không liên tục có kỹ thut sn xut đơn gin, thiết bị rẻ tiền hơn
phương php liên tục. Vì vy, phương php này đưc sử dụng nhiều ở cc qui mô nhỏ,
đu tư thp [25].
1.2.1. Sử dụng tác nhân là tế bào vi sinh vật
Vi sinh vt thường đưc sử dụng để chuyển hóa saccharose thành FOS là các
chng có hoạt tnh fructosyltransferase như: Aspergillus [26], [27], [28],
Aureobasidum [24], Fusarium [29] và Penicillium [30], trong đó Aspergillus đưc sử
dụng phổ biến nht.
1.2.1.1. Sử dụng tế bào vi sinh vật tự do
Sangeetha và cng sự [28] dùng tế bào Aspergillus oryzae CFR 202 để tổng hp
FOS vi cơ cht là dung dịch saccharose 60% trong điều kin nhit đ 55
0

C và pH
5,15. Hiu sut thu nhn FOS đạt 53% (g FOS/g saccharose).
Trong mt nghiên cứu khc, Aspergillus sp. N74 có hoạt tnh fructosyltransferase
đã đưc Oscar và cc cng sự [27] dùng để tổng hp FOS trong thiết bị phn ứng có
khuy trn cơ học vi hai nồng đ sinh khối ca Aspergillus sp. N74 là 6 và 9,5g/L.
Cc điều kin phn ứng là nhit đ 60
0
C, pH 5,5, nồng đ saccharose ban đu là 70%
(w/v) và thời gian phn ứng 26 giờ. Kết qu thu nhn đưc cho thy hiu sut tổng hp
FOS cũng như thành phn ca sn phẩm FOS phụ thuc vào nồng đ sinh khối và thời

9
gian phn ứng. Thời gian phn ứng tối ưu cho qu trình tổng hp FOS ứng vi nồng
đ sinh khối 6 và 9,5g/L ln lưt là 24 giờ và 4 giờ (nồng đ FOS tương ứng là 378 và
427g/L). Nồng đ sinh khối 9,5g/L tổng hp đưc 1-β-fructofuranosylnystose, trong
khi đó sn phẩm FOS tổng hp vi nồng đ cơ cht 6g/L không có thành phn này.
Cc tc gi cũng khẳng định rằng thiết bị phn ứng thiết kế trong đề tài và enzym
fructosyltransferase đưc sn xut t Aspergillus sp. N74 nguyên bn có thể là phương
n sn xut FOS ở quy mô công nghip.
Ngoài Aspergillus, mt số loại tế bào vi sinh vt tự do khc cũng đưc sử dụng
để tổng hp FOS. Prata và cng sự (2010) [30] đã nghiên cứu tổng hp FOS t
Penicillium expansum ở nhit đ 22 – 25°C, sau 12 giờ thu đưc 0,58g FOS/g
saccharose. Kết qu này đã khẳng định tiềm năng ca chng Penicillium expansum
trong sn xut FOS.
1.2.1.2. Sử dụng tế bào vi sinh vật cố định
Đối vi công ngh cố định tế bào, mt số cht mang có hiu qu cao đã đưc
nghiên cứu là calcium-alginate [31], [32], gluten [33], lõi bắp [34].
Nhiều nhà khoa học đã cố định tế bào vi sinh vt trên gel calcium alginate để
tổng hp liên tục FOS như Feng, Bo vi Aspergillus niger AS0023 [31] và Sanchez
vi Aspergillus sp. N74 [32]. Bằng kho st thực nghim và tối ưu hóa cc thông số

nhit đ, pH, nồng đ saccharose ban đu, kết qu cho thy có thể đạt hiu sut tổng
hp FOS lên đến 53% w/w (Aspergillus niger AS0023) và 50% w/w (Aspergillus sp.
N74).
Vic tổng hp FOS t saccharose sử dụng công ngh cố định tế bào Aspergillus
japonicus (có hoạt tnh β-D-fructofuranosidase) đã đưc nghiên cứu vi cht mang là
gluten (Chien, 2001) và lõi bắp (Mussatto, 2009). Chien và cng sự chứng minh rằng
tốc đ phn ứng tăng theo nồng đ tế bào trong mạng gluten và gi trị tối ưu đạt đưc
khi nồng đ tế bào là 20% (w/w), nồng đ ban đu ca dung dịch saccharose là
400g/L, thời gian phn ứng 5 giờ, hiu sut tổng hp FOS đạt 61% [21], [35]. Kết qu
thực nghim khi cố định Aspergillus japonicus ATCC 20236 trên lõi bắp cho thy vi
nồng đ saccharose ban đu là 200g/L, hiu sut tổng hp FOS cao hơn so vi khi
dùng tế bào tự do, đạt 0,66g/g dựa trên tổng cơ cht, 0,73g/g dựa trên cơ cht tiêu thụ
[34].

10
1.2.2. Sử dụng xúc tác là enzyme
Ngoài tc nhân tế bào vi sinh vt tự do hoặc cố định, để chuyển hóa saccharose
thành FOS, có thể dùng xúc tc enzyme β-fructofuranosidase, còn gọi là invertase (EC
3.2.1.26) hoặc fructosyltransferase (E.2.4.1.9) có ở thực vt và vi sinh vt [36]. Vic
sử dụng enzyme ca thực vt không hiu qu khi sn xut ở quy mô ln, do đó hin
nay ch yếu dùng enzyme ca vi sinh vt.
Enzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) đưc thu nhn t nhiều loại vi sinh vt
như Aspergillus foetidus [37], Bacillus subtilis [38], Bacillus macerans [39], [40],
Streptococcus salivarius [41], Aureobasidium pullulans [42], [43], Aspergillus niger
[1], [44], Aspergillus japonicus [45], Aureobasidium sp. [46], Aureobasidium
pullulans [47], Fusarium oxysporum [29] và cc chng Penicillium [8], [48].
Những thông số quan trọng nh hưởng đến qu trình chuyển hóa saccharose
thành FOS là nhit đ, pH, nồng đ saccharose ban đu, tỷ l enzyme xúc tc và thời
gian lên men.
Vic lựa chọn nhit đ và pH thích hp cho phn ứng phụ thuc vào nguồn gốc

enzyme. Cc điều kin tối ưu đưc khuyến co cho qu trình tổng hp FOS là nhit đ
55°C, pH 5,5 vi enzyme t Aureobasodium pullulans; nhit đ 60°C, pH 5 vi
enzyme t Aspergillus niger; nhit đ 55 – 65°C, pH 5,0 – 6,0 vi enzyme t
Aspergillus japonicus [49]; nhit đ 40 – 50°C, pH 4 – 6 vi enzyme t Aspergillus
flavipes [25]. Hiu sut lý thuyết ca qu trình tổng hp là 75% nếu chỉ tạo thành FOS.
Tuy nhiên, do enzyme xúc tc bị ức chế bởi glucose đưc gii phóng ra nên hiu sut
thực tế thp hơn nhiều [50], chỉ đạt khong 60% khi dùng enzyme t Aspergillus niger
ATCC 20611 [1], [44] t 53 đến 59% vi enzyme t Aureobasidium sp. [46] và 54,3%
vi enzyme t Aspergillus flavipes [25].
Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu cho rằng nên chọn nồng đ saccharose ban đu
cao để gim hoạt đ nưc, vì vy làm gim nguy cơ nhiễm vi sinh trong qu trình tổng
hp và làm gim chi ph cô đặc sn phẩm sau này [9], [49].
Quá trình tổng hp FOS t saccharose có thể đưc thực hin theo phương thức
liên tục bằng enzyme cố định hoặc phương thức không liên tục bằng enzyme tự do
(enzyme hòa tan). Vic sử dụng enzyme tự do có mt số nhưc điểm như bị tổn tht
hoạt tnh enzyme trong qu trình vn hành, phi bt hoạt enzyme sau khi chuyển hóa,

11
hoạt tnh thy phân cao dn đến tạo nhiều fructose, gim đ tinh khiết ca FOS. Điều
này làm tăng chi ph sn xut FOS [10], [21]. Tuy nhiên, hin nay sử dụng enzyme tự
do để tổng hp FOS vn là phương php phổ biến nht.
1.2.2.1. Sử dụng enzyme tự do
Enzyme tự do β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) ca Aspergillus sp. 27H phân
lp t đt đã đưc Fernandez và cng sự (2004) [51] sử dụng để tổng hp FOS. Điều
kin tối ưu cho hoạt tnh chuyển fructose là pH 5,5 – 6,0 và 60°C, trong khi hoạt tnh
thy phân cao nht tại pH 4,0 và 55°C. Ở nồng đ saccharose thp (10g/L), có sự
chuyển hóa nhanh saccharose thành glucose và fructose, nồng đ FOS thu đưc rt
thp. Ở điều kin nồng đ saccharose 615g/L, tỷ l enzyme 20 U/g saccharose, nhit
đ 40°C, pH 5,5, nồng đ FOS đạt gi trị tối đa 376g/L (234g/L 1-kestose và 142g/L
nystose).

Enzyme -D-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) dưi dạng chế phẩm enzyme
thương mại Pectinex Ultra SP-L ca hãng Novozymes mang hoạt tnh
fructosyltransferase đã đưc nghiên cứu để tổng hp FOS t saccharose [52] và t
dịch ma [53]. T saccharose (nồng đ 450g/L), sau 14 giờ phn ứng ở 65°C trong
đm natri acetate 0,05mol/L (pH 5,6), Hang Y.D. [52] đã thu đưc FOS có nồng đ
272g/L (224g/L kestose và 48g/L nystose) vi hiu sut chuyển hóa hơn 70% dựa trên
lưng saccharose tiêu thụ. Trong đó, FOS, saccharose, glucose và frucrose chiếm
56,5%, 19,4%, 23,4% và 0,7% tổng lưng đường có trong sn phẩm. Còn vi cơ cht
là saccharose t dịch ma, hoạt lực chuyển hóa ca chế phẩm enzyme Pectinex Ultra
SP-L là 58,1U/ml, nhit đ 40C, pH 5,6 và tỷ l enzyme/dịch đường ma là 2:100
(v/v), dung dịch FOS sau tổng hp có thành phn gồm: FOS 50,4%; saccharose
10,4%; fructose 3,9% và glucose 35,3% [53].
Năm 2007, Yoshikawa và cng sự [50] sử dụng chế phẩm enzyme thô β-
fructofuranosidase thu nhn t Aureobasidium pullulans DSM 2404 trong các nghiên
cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và đã đạt hiu sut tổng hp FOS 62%. Gi trị
này cao hơn so vi khi dùng cc chng Aureobasidium sp. khác (53 – 59%).
Ngoài ra, xúc tc là inulinase t Kluyveromyces marxianus cũng đã đưc Risso
(2009) [54] và Santos (2007) [55] nghiên cứu thông qua vic xc định cc điều kin tối