Khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái và thành phần hóa học của tinh dầu của loài Thìa là gỗ việt (Xyloselium Vietnamense Pimenov &Kljuykov) ở tỉnh Hà Giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
LƯU THỊ NHƯ
PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM
LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỔ
LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
• • • • Chuyên ngành:Thực vật học
Người hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG
TS. HÀ MINH TÂM
Hà Nội, 2013
LỜI CẢM ƠN
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của
TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tại viện.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ
chức, cá nhân trong và ngoài trường. Nhân dịp này, tôi xin ưân trọng cảm ơn: Ban
chủ nhiêm khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt là sự
giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên
cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Lưu Thị Như
LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam

đoan:
Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm
ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi
Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Các kết quả trình bày
trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ công
trình nào trước đây.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013. Sinh viên
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Lưu Thị Như
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABI Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình
tự)
ADN Acid Deoxyribonucleic
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại)
ARN Acid Ribonucleic
Bp Base pair (cặp bazơ)
Cl Cloroform-Isoamyalcohol
cpDNA Chloroplast Acid Deoxyribonucleic (genome lục lạp)
cpSSR Chloroplast-Simple Sequence Repeat (trình tự lặp lại đơn giản
trong genome lục lạp)
(ỈH2O Nước khử ion
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do)
Genbank Ngân hàng gen quốc tế
ISSR Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp
lại đơn giản)
ITS Internal Transcribed Spacer
Kb Kilobase

MEGA Phần mềm phân tích di ữuyền tiến hóa phân tử
NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
rDNA ADN ribosome
RE Restriction Enzyme (enzyme giới hạn)
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Simple Sequence Repeat (ưình tự các đoạn lặp đơn giản)
DANH LUC BẢNG
trang
và Panax vỉetnamensỉs với một số loài khác trong chi Panax trên
cơ sở phân tích trình tự vùng ITS- rDNA bằng phương pháp
Maximum Parsimony
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
SSR
Bảng 1
Bảng 2
MUC LUC
• •
MỞ ĐÀU
Lý do chọn đề tài:
Sâm ngọc linh {Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv. 1985) được tìm thấy ở
Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền trung
Việt Nam (vĩ độ 14°15) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18]. Sâm ngọc linh
được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen
[16].
Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc biệt
từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà khoa

học Ba Lan và Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất Saponin,
trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu
tiên được công bố. Khi so sánh với các nhóm sâm trồng có giá trị trên thế giới
như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quỉnqueỷolỉus) và Tam thất
(pnotogỉnseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài trên
nhưng hàm lượng lại cao hơn rất nhiều. Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh
là một loài độc đáo về thành phần hóa học [17], là một cây thuốc quý có giá trị sử
dụng cao.
Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường cây thuốc xuất hiện một loại sâm (đặc
điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, được làm giả Sâm
ngọc linh. Do mẫu vật chúng tôi thu được mới chỉ là mẫu lá và củ nên chưa đủ cơ
sở hình thái để chứng minh mối quan hệ của chúng với Sâm ngọc linh, vì vậy, để
phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với Sâm ngọc linh của Việt
Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu ‘Thân tích mối quan hệ di ữuyền của
Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với
một số loài Sâm khác ữong chi Panax”
Điểm mới của đề tài
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công
trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa
học các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI.
Mục đích của đề tài
Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ Lào
và Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó đánh
giá mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế giới.
Nội dung nghiên cứu
- Tách ADN tổng số của mẫu Sâm, nhân bản vùng gen ITS- rDNA
- Giải trình tự gen ITS - rDNA
- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu thu

được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong chi
Panax.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ỷ nghĩa khoa học:
Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấpđộ phân tử,
chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào.
Ỷ nghĩa thực tiễn:
Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ
Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Sâm {Panax)
Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Toàn bộ chi Sâm {Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới
loài (thứ -var) [23]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và (P.
trỉỷolỉatus) . Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông Nga, đông bắc Trung Quốc, bán
đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài p. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân
bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía
Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân
Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới
loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai loài trồng là p. notogỉnseng nhập tò Bắc Mỹ và
p. pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc
từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó).
Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm {Panax L.) của thế giới. Ở Bắc
Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng; p. quỉnqueỷolỉus và p. trỉỷolỉatus). Giới hạn
cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài Sâm ngọc linh (Panax
Vieừiamensis) ở miền trung của Việt Nam, tại 14°15 vĩ độ Bắc. Chính vì vậy Sâm

ngọc linh được coi là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6].
Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ, sợ
rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và nhiệt độ
cao, sợ gió nóng. Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 28°c. Candolle, 1830,
Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm cánh, bộ nhụy có 2
hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2
- 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số
năm sinh trưởng [20]. Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình
nghiên cứu sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39].
*
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Hình 1: Sâm Vỉệt Nam - Panax vietnamensis (nguồn: Wikipedia.org)
1.2 Sâm ngọc lỉnh
1,2.1, Đãc điểm hình thái
9
Sâm ngọc linh là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính
3.5cm, không có rễ phụ dầy dự trữ, đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ
gần hình cầu, đường kính đến 5cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân.
Thân cao từ 40cm - lOOcm, rỗng, Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá
kép chân vịt có 5 (ít khi 6,7) lá chét, lá dài 7 - 12cm (ít khi 15cm). Lá chét trên
cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14cm, rộng 3 - 5cm, đầu lá
thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng
cưa nhỏ đều . Cụm hoa dài 25cm, gấp 1 . 5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường
mang tán đơn độc. Tán hoa chính đường kính 2.5 - 4, có 50 - 120 hoa. Hoa màu
vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có
hai ô, hai vòi (chiếm 20%). Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên
đỉnh quả. Quả một hạt hình thận, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7 -1 0 mm rộng 4-
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh

6 mm [12, 15] (Hình 2).
Sinh thái:
Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ
ban ngày từ 20 - 25°c, ban đêm 15 - 18°c, Sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm.
Công dụng:
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể
dùng lá và rễ con.
Sinh học:
Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,
thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây
nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối
tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ sâm và
bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ
mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít
nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng 1 lá) mới có thể
khai thác, khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt
nhất phần thân rễ của sâm.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vườn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,
tỉnh Quảng Nam)
1.2.2. Phân bổ tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis)
Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung
phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi Ngọc
Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường
Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh,
Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam).
Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang
Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13].

Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì Sâm ngọc linh đã có
mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc
Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500m. Điểm phát
hiện có Sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200IĨ1 [6, 24].
1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị và thành phần hoá học của cây Sâm ngọc
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
lỉnh
a. Tầm quan trọng và giá trị
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài của
chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền
y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như Nhâm sâm (Panax
ginseng); Giả Nhâm sâm (P. pseudoginseng); Tây Dương Sâm (P. quique/oỉius);
Tam thất (P. notogiseng) và Sâm ngọc linh (P. vỉetnamensỉs Ha et Grushv.). Ở
Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán
bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây
thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu,
dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường
như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24].
Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu
của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc 2 nhóm
chính:
Nhóm 1 gồm các loài hiện đã được phát triển ữồng trọt gồm: Nhâm sâm (Panax
gỉnseng), Sâm mỹ ịP. quinqueýolius) và Tam thất (P. notogỉnseng), có bộ phận
dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát ữiển và chứa các Saponin có khung
thuộc nhóm dammaran.
Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như p. japonicas, p. zingỉberensỉs, p.
stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển theo hướng nằm ngang, chứa
Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [17].
Tuy nhiên, hàm lượng Saponin của Sâm ngọc linh so với các loài Panax

ữồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều.
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc
biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp
chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm trồng có giá tri trên
thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất
(p. notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói
trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều [16, 17].
b. Thành phần hóa học
Từ năm 1974 - 1990 Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu Nhâm
sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên {Panax ginseng), Nhâm sâm
nhật bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax quinquefollium) [17].
Kết quả có thể tóm tắt như sau:
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax
vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương
ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng. Chi tiết hơn nữa trong Panax
vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane (7.58%), trong đó
saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit
oleanolic. Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhâm sâm
cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và lượng
nhóm saponin damarane [17].
Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được 1 lượng lớn
majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất
này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao
nhất có trong các loài chi Panax. Ocotillol saponin đã trở thành 1 hợp chất cần
chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học cho các cây Panax vì nó
có thể ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis.
Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho Sâm Việt Nam

khác với Nhâm sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol
trong Nhâm sâm ữiều tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh Nhâm
sâm việt nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với Nhâm
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong
nhâm sâm triều tiên [10].
Ngoài những saponin nói trên, trong Nhâm sâm việt nam còn chứa các
polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [15].
1.2.4 Hiện trạng của loàỉ Sâm ngọc linh ở Việt Nam
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có khoảng 5 loài, trong
đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (p.notogineng) và Nhâm sâm (P.ginseng) [1].
Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm Vũ Diệp
(p.bỉpỉnnatỉỷỉdus Seem.), Tam thất hoang (p.stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc
biệt Sâm ngọc linh (p.vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền
Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei
(tỉnh Kom Tum), Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên
vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500m. Tuy nhiên hiện tại loài này đã trở nên cực
hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với
việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp. Hiện tại Sâm ngọc
linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế
khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày
31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo
sách đỏ Việt Nam (2007), Sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI +
2b, c, e [3]. Hiện nay Sâm ngọc linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt
Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà
Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng
khoảng lOhecta [18].
1.3. Phương pháp phân loại học phân tử.
Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong việc xác định mối

quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự ADN, bởi vật liệu di truyền là duy nhất
cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi,
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến. ADN chiết
từ lá và củ đều mang cùng thông tin di truyền. ADN chiết thì ổn định và có thể
giữ ở -20°c trong thời gian dài (khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về
thời gian trong phân tích. Chỉ sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là
một thuận lợi trong việc phân tích mẫu có giới hạn [2, 9,21].
1.4. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
1.4.1 Thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang
được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa
dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân
tích ADN. Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại), RFLP
(đa hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại ngẫu
nhiên), SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn giản), gen
mã hóa 18S - RNA, hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng
các đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23, 19]. Với số lượng bản sao
lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích
hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu dữ
trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về
trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho
đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự
nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn
đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di ữuyền quần thể (population genetics), vì nó
bộc lộ rõ các biến đổi di ưuyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa
cha mẹ và con cái ; (3) kết quả ADN cho phép xác định chính xác loài, quần thể

cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý, ; (4) kết quả nghiên cứu
ADN không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con
người gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là
công cụ hỗ ượ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới,
giải quyết mối nghi ngờ về vị ữí phân loại, đánh giá đầy đủ về tình trạng di
ữuyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hóa của nhiều loài động thực vật và vi
sinh vật . Các kết quả nghiên cứu ở mức độ ADN đã và đang góp phần đánh giá
tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một
cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ
công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm
và phát triển. Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước
tiếp cận. Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN có tính thống nhất
cao mới được thực hiện tại Viện sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật cho một số loài
động vật quý hiếm, còn với thực vật thì hầu như chưa có. Hơn nữa trong thực tế,
có nhiều loài tồn tại và phân bố biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen
rất lớn mà chưa được nghiên cứu.
Một số cơ sở nghiên cứu như Viện công nghệ sinh học, Viện sinh thái và
Tài nguyên sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp, Bảo
tàng Thiên nhiên Việt Nam, đã thực hiện một số nghiên cứu về đa dạng di truyền
thực vật, trên các đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan ) [13, 14,
23] cây rừng (họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh, Giổi ) [8, 22] nhưng các nghiên
cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể phục vụ cho
nghiên cứu bảo tồn, tiến hóa và tái tạo nguồn gen.
Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều

Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
kết quả có giá trị. Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện trên gen ty
thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài, đã
phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14]. Hay nhóm tác giả của đặng Tất Thế
(2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và
phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát quý hiếm của Việt Nam [27].
Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13]. Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã
dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam
làm cơ sở cho công tác di truyền [22].
Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít.
1.4.2. Các bước trong phương pháp phân loại hiện
đại 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng sự
mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh
học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào
đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10"
3
[xg). Kỹ thuật này có độ
nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tò, chuẩn
đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp lý [29].
Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc nhân bản
số lượng lớn các đoạn ADN, có thể sử dụng PCR để tách dòng đặc hiệu, giúp phát
hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá
trình tiến hóa ở mức độ phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại
cách đây hành chục triệu năm [30].
1.4.2.2. Đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp
Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination

method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Fredermination Sanger
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
phát ữiển vào năm 1975 [39].
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của
enzyme ADN - polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzim ADN -
polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp
ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH ở vị trí 3
’thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các
loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một các ngẫu nhiên.
Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch đơn có kích thước
khoảng 20 nucleotit.
1.4.2.3. Phân tích mối quan hệ di truyền
Mỗi quan hệ di ưuyền của các loài được thể hiện bằng cây
phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến
hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và
khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể.
Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về
cấu ữúc ADN giữa các loài. Các taxon được nối với nhau
trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền. Trên cây có rễ
mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên
chung. Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm,
các nút còn lại được tỏa ra từ nút này được gọi là con
cháu. Mỗi một nút được gọi là đơn vị phân loại, các nút
trong cây được gọi là các đơn vị phân loại giả thiết. Độ
dài của cành cây mô phỏng thời gian tiến hóa. Cây không
rễ là cây không có điểm khởi đầu, do đó nó không tái dựng
lịch sử tiến hóa của các loài. Cây không rễ chỉ cho biết
mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại. Có 4 phương
pháp tạo cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor - Joining

(NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp
Maximum Parsimony . Khoảng cách di truyền giữa các loài
cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây [37,
38].
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Mầu lá và củ của Sâm thu được ở Lào (tạm gọi là Sâm lào - Panax sp.)
(Mầu Sâm lào do viện Dược liệu trung ương cung cấp. (hình 3).
- Mầu Sâm ngọc linh thu tại vườn trồng sâm Đak-Tô, huyện Nam Trà My,
Tỉnh Quảng Nam
Hình 3. Lá và củ Sâm lào (Mấu do Viện dược liệu TW cung cấp)
Hình 4. Mau Sâm ngọc lỉnh (vườn Sâm Đăk-tô, Nam Trà My,
Quảng Nam)
2.2 Nơi thực hiện nghiền cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn,
viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2011-5/2013
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Tách ADN tổng số
Mầu lá (củ) củ tươi được nghiền trong nitơ lỏng (-196°C) thành dạng bột mịn.
Khoảng lOOmg bột nghiền được dùng để tách ADN, sử dụng Dneasy plant mini kit
(Qiagen, Đức).
Phương pháp chiết tách ADN gồm ba bước chính:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hay hoá học hoặc kết
hợp nhiều tác nhân, giải phóng ADN ra môi trường.
Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid,

polysaccharide ). Thường dùng hỗn hợp phenol - chloroform - isoamyl alcohol
(25:24:1) làm biến tính protein, sau đó ly tâm: protein biến tính sẽ tủa thành một lớp
nằm giữa pha nước chứa axit nucleic và pha phenol - chloroform, thu nhận lại pha nước
chứa axit nucleic.
Bước 3: Kết tủa axit nucleic. Thường dùng cồn ethanol thể tích 2.5:1 và trong môi
trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol thể tích 1:1. Thu
ADN bằng li tâm, sau đó hoà trong nước khử ion hoặc dung dịch đệm.
2.4.2 Phát hiện ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp này được áp dụng cả trong phân tích định tính lẫn trong việc thu
nhận mẫu axit nucleic.
Nguyên tắc phương pháp dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic.
Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của
một điện trường, chúng sẽ di chuyển về hướng cực dương. Sự di chuyển nhanh hay
chậm tuỳ thuộc vào hình dạng và tỉ số điện tích - khối lượng, nhờ đó các chất khác
nhau sẽ được tách ra thành từng vết riêng và được phát hiện bằng nhiều cách khác nhau
.
Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%:
- Cân 0,4g Agarose, pha với 40ml với đệm TAE 1 lần, đun trong lò vi sóng
khoảng 1 phút cho tới khi agarose hoàn toàn tan trong đệm
- Để dung dịch gel Agarose nguội đến 60oC, bổ sung 4^1 Ethydium Bromide
(EB). Đổ dung dịch gel agarose vào bể điện di, cài lược tạo giếng, để khoảng 30
phút cho gel đông.
- Dùng pipet hút trộn mẫu với giọt loading dye (màu chạy điện di) rồi cho vào các
giếng tương ứng.
- Bật máy điện di cài đặt thời gian 20 phút, 120 V.
- Đặt gel lên đèn uv, quan sát vạch sáng.
2.4.3 Kỹ thuật PCR
Nhân bản vùng gen ITS - rADN bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu (thiết
kế trên cơ sở trình tự ITS - rADN của các loài trong chi Panax trên Genbank).
- Mồi xuôi PaITS-F: 5’- CAC TGA ACC TTATAC TTT TGAG - 3.

- Mồi ngược: PalTS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG - 3’. Chu
trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50|xl gồm 32|xl
H2O, 5 (0.1 đệm, 5 |xl dNTP, 3 (0.1 mồi xuôi F (30 pM), 3 (0.1 mồi ngược R (30 pM), 1
|J,1 ADN tổng số, 1 ^il enzyme Tag polymerase.
Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 3 phút ở 95°c, 30 chu
kỳ (50 giây 95 °c, 1 phút 55 °c, 1 phút 72 °C) và sau đó là 1 chu kỳ ở 72 °c trong 5
phút.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch bằng
Qiaquick gel extranction kit (Qiagen,Đức).
2.4.4. Đoc trình tư
• •
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải
trình tự trực tiếp với mồi PalTS - F, sử dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả
trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems.Mỹ).
2.4.5. Phân tích số liệu
Trình tự ADN của 2 loài Sâm lào và Sâm ngọc linh được so sánh, phân tích với
7 loài khác thuộc chi Panax và 1 loài ngoài nhóm (Aralia foliolosa) được dùng làm
tham chiếu (Bảng 3) sử dụng phần mềm Clustal w và MEGA
5.1
Bảng 1. Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu
Ten khoa hoc Mã hiệu Genbank
1
Panax
quinquefolius
AY233328
2 Panax japonicus FJ980423
3 Panax japonicus var bipinnatifidus AY271921
4 Panax notoginseng JX680329
5 Panax pseudoginseng var bipinnatifidus AY271923
6

Panax
stipuleanatus
U41690
7 Panax variabilis AY233329
8 Aralia foliolosa DQ007383
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
Chúng tôi đã tiến hành giải mã 1 đoạn gen ITS của Sâm lào và Sâm ngọc linh, so
sánh một số loài khác trong chi Panax để làm rõ vị trí phân loại của Sâm lào nói riêng
cũng như mối quan hệ di truyền Sâm lào với Sâm ngọc linh.
3.1 Kết quả tách ADN tổng số
Mầu lá và củ của Sâm lào và Sâm ngọc linh được nghiền trong nitơ lỏng (-
196°C) thành dạng bột mịn. Khoảng lOOmg bột nghiền được dùng để tách ADN tổng
số, sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức). Kết quả sau đó được điện di kiểm tra
trên gel Agarose 1% (Hình 5)
Hình 5 Điện di tổng số ADN trên gel Agarose 1%
Giếng 1 ADN tổng số từ Lá Sâm ngọc linh
Giếng 2 ADN tổng số từ Củ Sâm ngọc linh
Giếng 3 ADN tổng số từ Lá Sâm lào
Giếng 4 ADN tổng số từ củ Sâm lào
Ảnh điện di cho thấy đều có ADN xuất hiện ở tất cả các mẫu, tuy nhiên ở các
giếng số 1 (mẫu lá Sâm ngọc linh), 2 (củ Sâm ngọc linh), 3 (lá Sâm lào) thì có vạch
sang rõ nét hơn, giếng số 4 (mẫu củ Sâm lào) vạch mờ, chứng tỏ ADN tách từ củ Sâm
lào có chất lượng không tốt bằng 3 mẫu còn lại.
3.2 Kết quả khuếch đại gen ITS bằng PCR
Chúng tôi chọn ADN tổng số mẫu lá Sâm ngọc liáh và ADN tổng số mẫu lá
Sâm lào làm khuôn để khuếch đại đoạn gen ITS bằng PCR. Theo lý thuyết khi sử
dụng cặp mồi đặc hiệu PaITS-F và PaITS-R thì sẽ khuếch đại được 1 đoạn gen ITS
dài 700bp.
Sau khi chạy PCR, sản phẩm PCR của mẫu lá Sâm ngọc linh và lá Sâm lào
được kiểm tra bằng điện di trên gel agrarose 1% (hình 6).

70ũbp
Hình 6. Kỉểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1%
Giếng M: 1 OObp DNA ladder (invitrogen)
Giếng 1: Sản phẩm PCR từ lá Sâm ngọc linh
Giếng 2: Sản phẩm PCR từ mẫu lá Sâm lào