Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN




ĐINH THỊ PHƢƠNG




PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học







HÀ NỘI, 2014

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

ĐINH THỊ PHƢƠNG



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. TRẦN THỊ THÚY






HÀ NỘI, 2014



LỜI CẢM ƠN

Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Trần Thị Thúy,
ngƣời đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này.
Em gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô giáo đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Công nghệ
Sinh học- Vi sinh, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đã hết lòng tạo
điều kiện, giúp đỡ em thực hiện các nghiên cứu của mình.
Xin cảm ơn tới các anh, chị, các bạn sinh viên đang làm việc và học tập Bộ
môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình
làm đề tài này.
Cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân, bạn bè, đã quan tâm giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Đinh Thị Phƣơng









LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả

nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với
công trình của tác giả khác.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Đinh Thị Phƣơng












NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CFU (Colony Forming Unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc
VSV Vi sinh vật
VK Vi khuẩn
GRAS Generally Regarded As Safe
DNS DiNitroSalycilic acid
Da Dalton
kDa Kilodalton
OD Optical Density
Cs Cộng sự
G

+
Gram dƣơng
G
-
Gram âm
VTM Vitamin
w/v Khối lƣợng/thể tích
STT Số thứ tự
ĐC Đối chứng
PTN Phòng thí nghiệm













DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10
Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic 25
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc
từ mật và sáp ong……………………………………………… 26

Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc với
các chủng vi khuẩn kiểm định 31
Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33
Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 36
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên đến sự sinh trƣởng và phát triển
của chủng LT31 41
Bảng 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng LT31 trong các môi trƣờng MRS có
bổ sung dịch chiết bắp cải 42
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn/ml dịch
nuôi và giá trị OD
620
của chủng LT31 ….18
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose trong dung
dịch và giá trị OD
540
20
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc
từ sáp và mật ong 30
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc
từ sáp và mật ong 30
Hình 3.5. Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số
chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong 32
Hình 3.6. Hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng LT31 33
Hình 3.7. Hoạt tính catalase 34
Hình 3.8. Khả năng sinh khí của chủng LT31 34
Hình 3.9. Khả năng quần tụ của chủng LT31 35
Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 37
Hình 3.11. Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31 38
Hình 3.12. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng LT31 39

Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 40
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 41
























MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………1
1. Lí do chọn đề tài………………………………………………………………… 1
2. Mục đích nghiên cứu…………………………………………………………… 1

3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………… 1
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu……………………………………………… 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………… …… 2
6. Những đóng góp mới của đề tài……………………………………………… 2
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…….…………………………………….……… 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vi khuẩn lactic 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic 3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic 4
1.1.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng của vi
khuẩn lactic 4
1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic 5
1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic 6
1.2. Probiotics 7
1.2.1. Định nghĩa probiotics 7
1.2.2. Các loại VSV đƣợc dùng làm chế phẩm probiotics 7
1.2.3. Tác dụng của probiotics 9
1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10
1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics 10
1.3. Sáp ong và mật ong 12
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14
2.1.1. Vi sinh vật 14
2.1.2. Máy móc thiết bị 14
2.1.3. Hoá chất 14
2.1.4. Môi trƣờng 15
2.1.4.1. Môi trƣờng phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của
vi khuẩn lactic – Môi trƣờng MRS 15
2.1.4.2. Môi trƣờng nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA 15
2.1.4.3. Môi trƣờng thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic……………………………15

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong 15
2.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn 16
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đặt khối thạch 16
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch 17
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn 17
2.2.4. Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi
khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD
620
18
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 19
2.2.5.1. Phát hiện hoạt tính catalase 19
2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose 19
2.2.5.3. Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy 19
2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp
của Reniero và cộng sự (1992) 21
2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định
theo phƣơng pháp của Kmet và cộng sự (1995) 21
2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu 22
2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trƣởng với mật lợn 22
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng
sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 23
2.2.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 23
2.2.6.2. Ảnh hƣởng của độ pH 23
2.2.6.3. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng tự nhiên 23
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol 24
2.2.8. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật ong, sáp ong 25
3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn 30

3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33
3.4. Một số đặc tính probiotics của chủng vi khuẩn lactic LT31 35
3.4.1. Khả năng quần tụ của chủng LT31 35
3.4.2. Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng
vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột 35
3.4.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 36
3.4.4. Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31 37
3.4.5. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng vi khuẩn lactic LT31 38
3.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của chủng vi
khuẩn lactic LT31 39
3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 40
3.5.2. Ảnh hƣởng của pH 40
3.5.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Probiotics là chế phẩm vi sinh vật (VSV) sống, đƣợc bổ sung cho ngƣời và
động vật nuôi để hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn và giảm rối loạn trong hệ đƣờng ruột.
Bên cạnh đó, probiotics còn đƣợc biết đến với các công dụng nhƣ: đẩy mạnh sự
tổng hợp vitamin B, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch,
ngăn chặn các chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi khuẩn gây hại
trong ruột. Do các công dụng hữu ích trên mà probiotics đƣợc quan tâm nghiên cứu
trên khắp thế giới. Cho đến nay, rất nhiều nghiên cứu về probiotics đã và đang thu
đƣợc những kết quả đáng kể trong thử nghiệm cũng nhƣ trong ứng dụng thực tiễn.
Vi khuẩn lactic là một trong số những vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến
trong các chế phẩm probiotics đƣợc sử dụng cho cả ngƣời và các loài vật nuôi (lợn,

gà, tôm, cua, cá,…).
Mật và sáp ong từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một bài thuốc dân
gian để phòng trị nhiều bệnh, từ các bệnh đƣờng hô hấp đến các bệnh đƣờng tiêu
hóa, nhiễm trùng da. Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng đã báo cáo những
phát hiện về khu hệ VSV có ích trong tổ ong, sáp và mật ong.
Từ thực tiễn nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic làm chế phẩm
probiotics đã nêu trên, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và
nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong”
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp
ong.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn.
3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn.
3.4. Nghiên cứu một số đặc tính probiotics của chủng tuyển chọn.
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng tới sinh trƣởng của chủng
vi khuẩn lactic.
2

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong thu đƣợc ở một số khu vực
phía bắc Việt Nam.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp vi sinh học: phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ mật và sáp
ong; các phƣơng pháp quan sát, nghiên cứu đặc điểm sinh học và xác định số
lƣợng tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng nuôi cấy; các phƣơng pháp nghiên cứu
ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng và dinh dƣỡng tới sinh trƣởng và phát
triển của VSV; các phƣơng pháp bảo quản chủng giống VSV.
5.2. Phƣơng pháp hóa sinh: xác định hàm lƣợng đƣờng sót, định lƣợng axit tổng số.

5.3. Phƣơng pháp toán xác xuất thống kê: xử lý các số liệu thu đƣợc bằng phần
mềm Excel 2010, Word 2010.
6. Những đóng góp mới của đề tài
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số
chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics phân lập từ mật và sáp ong.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
7.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài đóng góp những hiểu biết về khu hệ vi khuẩn lactic trong mật và sáp
ong, tiềm năng ứng dụng chúng trong các chế phẩm probiotics.
7.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp
ong, bƣớc đầu góp phần làm đa dạng các sản phẩm probiotics cho ngành chăn nuôi
gia súc, gia cầm và cả cho con ngƣời.




3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn lactic
Nhóm vi khuẩn lactic đƣợc xác định bởi Orla Jensen (1919), bao gồm nhiều
giống có đặc tính chung là lên men gluxit sinh năng lƣợng và tạo ra một lƣợng lớn
axit lactic [5].
Từ lâu vi khuẩn lactic đã đƣợc sử dụng để chế biến các loại thức ăn nhƣ sữa
chua, nem chua, dƣa và cà muối… Tuy nhiên, mãi đến năm 1780, một nhà hóa học
ngƣời Thụy Điển mới tách đƣợc axit lactic từ sữa bò bị chua. Năm 1857, L.Paster
đã chứng minh đƣợc sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm VSV đặc biệt
(gọi là vi khuẩn lactic) trên sữa bò. Năm 1878, Lister là ngƣời đầu tiên phân lập

thành công vi khuẩn lactic từ sữa chua và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là
Streptococus lactis.
Từ đó đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều loài vi khuẩn lactic
khác nhau trong nhiều loại cơ chất, từ thực phẩm lên men chua đến các loại hoa quả
tự nhiên và cả trên niêm mạc của ngƣời và động vật [3].
1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic
Căn cứ vào đặt điểm hình thái tế bào, ngƣời ta chia vi khuẩn lactic thành hai
nhóm: Hình que và hình cầu.
 Nhóm hình que có hình dạng tế bào thay đổi từ que ngắn (0.5 – 0.7 m)
đến que dài (3 – 8 m). Các tế bào này có thể ở dạng đơn, đôi hay tạo thành chuỗi
(ngắn, dài tùy loài). Thuộc về nhóm này là các loài thuộc chi Lactobacillus,
Bifidobacterium.
 Nhóm hình cầu có hình dạng tế bào biến đổi từ hình cầu đến hình ovan,
đƣờng kính khoảng 0.5 – 1 m. Các tế bào cũng có thể ở dạng đơn, đôi, tạo tứ cầu
hoặc tạo chuỗi ngắn hay chuỗi dài (tùy loài). Nhóm này gồm các loài thuộc chi
Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus [5].
4

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dƣơng, nói chung là bất động,
không sinh nội bào tử, catalaza và nitrate reductaza âm.
Vi khuẩn lactic lactic là các vi khuẩn hoá dị dƣỡng hữu cơ. Khả năng sinh
tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của chúng rất yếu, cho nên, chúng là
những VSV khuyết dƣỡng đối với nhiều axit amin, bazơ nucleic và vitamin… Vi
khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp các porphyrin (nhƣ Hem), bình thƣờng
chúng không có cytocrom. Song, một số vi khuẩn lactic khi sinh trƣởng trên các
môi trƣờng chứa máu có thể tạo thành các cytocrom và có thể tiến hành cả quá trình
phosphoryl hoá trong chuỗi hô hấp. Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các
porphyrin thì một số vi khuẩn lactic cũng có thể tổng hợp các sắc tố hemin tƣơng
ứng [3].

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kị khí tuỳ nghi hoặc vi hiếu khí, là loại vi
sinh vật duy nhất có khả năng lên men lactic ngay cả ở trong điều kiện hiếu khí [5].
1.1.3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của vi
khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic cũng nhƣ các VSV nhân sơ khác, cấu tạo cơ thể của chúng
chỉ gồm một tế bào nên hoạt động sống của chúng liên quan chặt chẽ với các điều
kiện của môi trƣờng xung quanh.
Một yếu tố môi trƣờng có thể tham gia vào quá trình sống của vi khuẩn lactic
dƣới hình thức cản trở, ức chế hay tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đó.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau có giới hạn về nhiệt độ khác nhau. Giới
hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic phát triển khá rộng, từ 5ºC – 55ºC, thƣờng hoạt
động tốt nhất ở vùng nhiệt độ 15ºC – 40ºC. Nhóm ƣa ấm hoạt động thích hợp trong
khoảng 20ºC – 40ºC, nhóm ƣa nhiệt thích hợp trong khoảng 40ºC – 45ºC. Tuy nhiên
cũng có những chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ rất cao.
Buchta K. (1983) tìm ra chủng L. bulgaricus có khả năng hoạt động tối ƣu ở nhiệt
độ 45ºC – 62ºC [16].
5

Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic sinh trƣởng, phát triển và lên men cũng
là giới hạn nhiệt độ hoạt động của các enzyme nội bào. Chính vì thế mà trong phạm
vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ càng tăng thì sự lên men lactic càng mạnh, thời
gian lên men càng ngắn.
* Ảnh hưởng của pH
Độ pH ban đầu của môi trƣờng thích hợp cho lên men lactic là 5,8 – 7,3 (tùy
loài). Trong quá trình lên men lactic, sự tích tụ các axit lactic trong giai đoạn đầu có
tác dụng kích thích sinh trƣởng của vi khuẩn lactic và ức chế các VSV khác, nhƣng
khi lƣợng axit lactic tiếp tục tăng sẽ làm cho pH của môi trƣờng giảm xuống đến pH
3 – 4, dẫn đến ức chế cả vi khuẩn lactic, làm giảm tốc độ sinh trƣởng, phát triển của
chúng [3].

* Ảnh hưởng của nồng độ oxy
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi và vi hiếu khí. Chúng thực
hiện quá trình lên men lactic cả trong điều kiện vi hiếu khí cũng nhƣ kỵ khí. Trong
quá trình lên men lactic, sự có mặt của oxy phân tử không gây độc với vi khuẩn
nhƣng sự lên men diễn ra thuận lợi hơn trong điều kiện yếm khí.
1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa kị khí đƣờng và tạo ra một lƣợng
axit lactic lớn thông qua quá trình lên men lactic. Lên men lactic là quá trình chuyển
hóa sinh hóa kị khí các hợp chất cacbonhydrat tạo năng lƣợng, axit lactic và một số
sản phẩm khác với sự tham gia của nhóm vi khuẩn lactic [3], [5].
Tùy theo cách chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrat mà quá trình lên men
lactic có thể xảy ra theo phƣơng thức lên men đồng hình, lên men dị hình hoặc kết
hợp cả hai phƣơng thức trên.
 Lên men lactic đồng hình
Khi lên men đồng hình, vi khuẩn lactic phân giải cacbonhydrat theo con
đƣờng EMP (Embden – Meyerhof – Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic
(90 – 98%) [6], do đó lên men lactic đồng hình rất có ý nghĩa trong công nghiệp sản
xuất axit lactic.
Phƣơng trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình:
6


C
6
H
12
O
6
+ 2 ADP + 2 Pv 2CH
3

-CHOH-COOH + 2ATP
(glucose) (axit lactic)

Đại diện của nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình thƣờng gặp là:
Lactococcus, lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, L.plantarum,
L.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, S.cremoris, Sporolactobacillus inulinus, …
 Lên men lactic dị hình
Vi khuẩn lên men lactic dị hình do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đƣờng
EMP là aldolase và triozophosphate – izomerase nên giai đoạn đầu của quá trình
phân giải glucose xảy ra theo con đƣờng PP (Pentose phosphate). Sau đó, quá trình
chuyển hóa triozophosphate thành axit lactic xảy ra tƣơng tự nhƣ lên men đồng
hình.
Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (khoảng 40%)
còn có các sản phẩm khác nhƣ: axit axetic (10%), axit xuccinic và rƣợu ethylic
(20%), còn lại là carbon dioxit (CO
2
).
Sự hình thành CO
2
trong quá trình lên men lactic là đặc điểm khác biệt dễ
nhận biết nhất giữa lên men lactic dị hình và lên men lactic đồng hình.
Phƣơng trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình đƣợc
biểu diễn nhƣ sau:
2C
6
H
12
O
6
 2C

3
H
6
O
3
+ C
2
H
4
O
2
+ C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ H
2
O + Q
Glucose Axit lactic Axit axetic Rƣợu ethylic
Các vi khuẩn lactic lên men dị hình là: Leuconostoc mensenteroides,
L.cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, L. viridescens, Bifidobacterium
bifidum, Leuconostoc, Weissella ….
1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic
Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau, củ,
quả, thịt, cá, tôm, sữa …. ; trong đất, phân, rác, xác động vật, thực vật. Trên niêm
mạc miệng, ruột của ngƣời, gia súc, gia cầm, ngƣời ta cũng phát hiện thấy sự có mặt
của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic có mặt nhiều nhất trong các loại thức ăn ủ chua
Vi khuẩn lactic

lactic
lên men đồng hình
7

nhƣ: sữa chua, rau quả muối chua, thịt, cá muối chua … Ngoài ra, cũng có một số
loài vi khuẩn lactic sống ký sinh trên thực vật, hút các chất trong biểu mô cây [22].
1.2. Probiotics
1.2.1. Định nghĩa probiotics
Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ “pro” có nghĩa là
dành cho và “biosis” có nghĩa là sự sống. Định nghĩa về probiotic đầu tiên đƣợc
R.Fuller đƣa ra vào năm 1989. Theo ông, probiotics là thành phần của thức ăn có
cấu tạo từ những VSV sống và có tác động hữu ích lên vật chủ qua việc làm cải
thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột của nó [17].
Ngày nay, probiotics đƣợc định nghĩa những VSV sống đƣợc bổ sung vào
đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật làm tăng sức khỏe con ngƣời và động vật
nuôi thông qua việc cải thiện vân bằng của khu hệ VSV đƣờng ruột [17].
1.2.2. Các loại VSV được dùng làm chế phẩm probiotics
Các chế phẩm probiotics chứa một hoặc nhiều chủng VSV hữu ích. Thông
thƣờng, chế phẩm này bao gồm một tổ hợp các chủng VSV có tính chất probiotics.
Điều này giúp chế phẩm khi đƣợc áp dụng sẽ tác động một cách đồng đều đến hệ
VSV của vật chủ tránh việc gia tăng đột biến một chủng VSV trong hệ tiêu hóa.
Vi khuẩn lactic là nhóm VSV đƣợc dùng phổ biến trong các chế phẩm
probiotics cho ngƣời và động vật nuôi bởi chúng đƣợc xem là nhóm vi sinh vật an
toàn (GRAS), có khả năng tồn tại trong đƣờng ruột, có tác dụng phục hồi và cân
bằng khu hệ vi sinh vật tự nhiên trong đƣờng ruột, khống chế các bệnh đƣờng ruột,
làm tăng sức đề kháng cho vật nuôi. Một số vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để làm
chế phẩm probiotics thƣơng mại gồm: Lactobacillus, Streptococcus,
Bifidobacterium [17].
Vi khuẩn lactic đƣợc quan tâm nghiên cứu trong tạo chế phẩm probiotics là
do chúng có đƣợc những ƣu điểm sau:

(*) Có khả năng ngăn cản đƣợc bệnh tiêu chảy. Cơ chế chống tiêu chảy có
thể đƣợc giải thích là do vi khuẩn laclic (1) tạo ra sự cân bằng cho khu hệ vi sinh
vật đƣờng ruột. (2) cạnh tranh về dinh dƣỡng và nơi khu trú với các vi sinh vật gây
bệnh. (3) tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng chống lại mầm bệnh. VD các
8

chủng L. casei, L. acidophilus, và L. bulgaricus có khả năng sản sinh ra các chất kháng
khuẩn nhƣ acidophilin, bulgarican có tác dụng kìm hãm sự sinh trƣởng của vi sinh vật
gây bệnh. (4) tăng cƣờng miễn dịch cho cơ thể vật nuôi, phòng chống đƣợc tiêu
chảy.
(**) Ngoài khả năng sinh axit lactic, làm giảm pH môi trƣờng, vi khuẩn
lactic còn sinh nhiều loại chất kháng khuẩn khác:
- Axit hữu cơ và ethanol: Các axit hữu cơ nhƣ axit lactic, axit formic, axit
propionic…và ethanol là các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic. Các sản
phẩm này có tác dụng làm giảm pH môi trƣờng đến mức có thể ức chế và tiêu diệt
một số VSV gây bệnh.
- Hydroperoxit (H
2
O
2
): Whater và cs (1951) đã chứng minh đƣợc
Lactobacilus lactic có khả năng tạo ra H
2
O
2
nên chúng kháng đƣợc Staphylococcus
aureus
- Diacetyl: có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn Gram âm, nấm mốc, đặc
biêt là vi khuẩn gây bệnh lao (Micrococcus tubeculosis).
- Bacteriocin: là các phân tử protein mang điện tích dƣơng, kích thƣớc nhỏ

(gồm 30 – 60 axit amin), trung tính, có điểm đẳng điện cao, có khả năng ức chế và
tiêu diệt hầu hết các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh
bacteriocin. Nhiều loài vi khuẩn lactic đƣợc phát hiện có khả năng sinh bacteriocin
[14].
(***) Khả năng quần tụ là khả năng quần hợp giữa các tế bào do phản ứng
giữa kháng thể và kháng nguyên làm kết tủa kháng nguyên. Khả năng quần tụ của
vi khuẩn lactic là do yếu tố APF quyết định. APF (Aggregation Promoting Factor)
là phân tử protein phức tạp, trọng lƣợng phân tử 32 kda, đƣợc sinh ra trong quá
trình sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lactic. Chúng có thể liên kết các thành
phần: axit lipoteichoic, axit teichoic của thành tế bào; làm thay đổi cấu trúc mạch
bên α – D – Glucopyranosyl – (1,2) – D – Glucose, do đó thiết lập đƣợc cầu nối cho
giữa các tế bào vi khuẩn, làm các tế bào gắn kết và quần tụ [23].
9

Một số loài thuộc chi Bacillus cũng đƣợc phát hiện có tính chất probiotics và
đƣợc ứng dụng làm chế phẩm probiotics. Đó là các loài B. subtilis và
B.Coagulans[17], [21], [26].
Nguồn VSV làm probiotics rất đa dạng, đƣợc phân lập từ đất, nƣớc… nhƣng
nguồn quan trọng nhất chính là từ hệ tiêu hóa của động vật nuôi, vì các VSV này
thích nghi đƣợc với hệ tiêu hóa cũng nhƣ khu hệ VSV của vật chủ.
1.2.3. Tác dụng của probiotics
Những ảnh hƣởng có lợi của probitics đã đƣợc Fuller cũng nhƣ Patterson và
Burkholder (2003) tổng kết lại nhƣ sau [17], [21]:
 Làm thay đổi cấu trúc quần thể VSV đƣờng ruột theo chiều hƣớng có lợi cho
vật chủ.
 Kích thích hệ thống miễn dịch và tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho vật chủ.
 Giảm phản ứng viêm.
 Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.
 Tăng khả năng sản xuất axit béo bay hơi.
 Tăng cƣờng quá trình tổng hợp các vitamin nhóm B.

 Tăng hấp thụ chất khoáng.
 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh.
 Giảm tỉ lệ còi cọc và làm tăng năng suất vật nuôi.
 Giảm hàm lƣợng amoniac và ure trong chất thải.
 Phòng bệnh tiêu chảy cho vật nuôi, làm giảm tỉ lệ nhiễm bệnh, rút ngắn thời
gian bị bệnh, giảm tỉ lệ tái phát, giảm tỉ lệ chết…






10

1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics
STT
Chỉ tiêu lựa chọn
Mục đích
1
Chịu đƣợc pH thấp
Sống đƣợc khi đi qua dạ dày và tá
tràng
2
Chịu đƣợc trong môi trƣờng có
nồng độ axit mật cao
Sống đƣợc khi đi qua phần ruột non
phía trên
3
Sản sinh axit từ glucose và lactose

Tiêu diệt vi khuẩn gậy bệnh ở phần
ruột trên
4
Sản sinh ra các chất kháng khuẩn
Cạnh tranh vị trí cƣ trú, dinh dƣỡng và
tiệu diệt các vi khuẩn gậy bệnh
5
Bám đƣợc lên tế bào biểu mô của
ruột
Chiếm hữu các vị trí khác, cƣ trú và
loại trừ các VSV khác ra khỏi vị trí
bám
6
Chịu đƣợc nhiệt độ cao
Sống đƣợc qua quá trình ép viên của
máy sấy phun
7
Chịu đƣợc các chất kháng khuẩn
có trong thức ăn
Có thể dùng với thức ăn trị bệnh có
chất kháng sinh
8
Dễ nuôi cấy, có khả năng tồn tại
độc lập trong thời gian dài
Tạo điều kiện cho chế phẩm bảo quản
trong thời gian dài
9
Sinh ra các enzyme hoặc các sản
phẩm cuối mà vật chủ có thể sử
dụng đƣợc

Tăng hiệu suất tiêu hóa của vật nuôi
10
An toàn không gây bệnh cho vật chủ
Trên thực tế khó có chủng VSV nào đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu trên vì thế khi
tuyển chọn phải dựa vào mục đích cụ thể. Cân nhắc các tính chất của chủng để thu
đƣợc các chủng theo mục đích phù hợp [9], [21].
1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics
 Trên thế giới
Công trình nghiên cứu đầu tiên ứng dụng probiotics đƣợc tiến hành trên lợn
do Pollman và cs công bố năm 1959 mang tên “Giá trị dinh dƣỡng và phòng trị
bệnh của việc cấy những chủng vi khuẩn lactic vào lợn con”. Tiếp theo năm 1987,
11

Nielsen và Trine đã nghiên cứu “Tác dụng ngăn chặn bệnh colibacilosis ở lợn sau
cai sữa của 5 chủng Lactobacillus” cho kết quả rất khả quan trong việc ngăn chặn
bệnh colibacilosis và giúp tăng trọng cho vật nuôi.
Tardani (1996) [25] và Zani (1998) [26] đã thí nghiệm chế phẩm B.cereus
trên lợn sau cai sữa thấy rằng tốc độ tăng trƣởng, hệ số thức ăn và tỷ lệ tiêu chảy
đƣợc cải thiện rất rõ.
Năm 1998, Oh Tae – Kwang đã sử dụng probiotics từ Lactobacillus sp. TSC
– 66 cho lợn [20]. Kết quả cho thấy chế phẩm probiotics từ VSV sống này có tác
dụng chống bệnh và kích thích sinh trƣởng cho vật nuôi.
Đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều nƣớc sản xuất và ứng dụng rộng rãi
chế phẩm probiotics không những cho động vật mà còn cả ngƣời. Nhìn chung, tất
cả các công trình nghiên cứu đó chú trọng chủ yếu vào phòng, trị bệnh tiêu chảy và
giúp tăng trọng ở động vật nuôi.
 Ở Việt Nam
Probiotics đƣợc ứng dụng trong ngành chăm nuôi ở Việt Nam khá muộn, vào
những năm cuối của thế kỷ 19. Tuy vậy trên thị trƣờng hiện nay cũng đã xuất hiện
ngày một nhiều các chế phẩm probiotics cho ngƣời và vật nuôi.

Năm 1948, bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sử dụng canh trƣờng B.subtilis để
điều trị tiêu chảy, đầy hơi và có tác dụng tốt [9]. Đến năm 1979 bác sỹ Vũ Văn Ngữ
đã nghiên cứu và tạo chế phẩm colisubtyl có tác dụng giảm tiêu chảy ở lợn [11].
Cùng thời gian đó xí nghiệp thuốc thú y trung ƣơng đã chế tạo thành công chế phẩm
B.subtilis để chữa bệnh tiêu chảy và bệnh lợn con ỉa phân trắng.
Lê Thanh Bình và cs (1999) (Viện Công nghệ sinh học) đã sản xuất thành
công chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus và
Enterococcus và tiến hành nuôi thử nghiệm trên gà Broiler, kết quả cho thấy: Ở
nhóm gà đƣợc ăn chế phẩm PRO99 có sự giảm đáng kể E.coli (mà sự có mặt của nó
gây tác động bất lợi cho dinh dƣỡng, bệnh tật và năng suất vật nuôi), tác dụng tăng
trọng của chế PRO99 tăng 11% so với đối chứng [2].
Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003) đã phân lập 789 chủng vi khuẩn
lactic trong phân gà vừa thải ra, và sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu sinh học phân
tử đã xác định đƣợc hai chủng L. agalis CH123 và L. salavarius CH156 có những
tính chất probiotic nhƣ: có khả năng sinh trƣởng đƣợc với 40% axit mật; sinh
12

trƣởng đƣợc ở môi trƣờng pH 4.0 và nồng độ NaCl 6.0% có hoạt tính kháng với
Salmonella, E.coli và có khả năng sử dụng nhƣ nguồn probiotic ứng dụng trong
chăn nuôi [10].
Nguyễn Thị Hƣờng (2005) đã phân lập và tuyển chọn đƣợc hai chủng vi
khuẩn lactic YHN77 và YHN99 để bổ sung vào chế phẩm probiotic cho lợn con [8].
Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng probiotic gần đây tập trung mạnh vào
việc phát triển chăn nuôi gia súc, gia cầm, với mục đích chính là làm tăng hiệu suất
chuyển hoá thức ăn, giảm bớt bệnh tật, làm tăng trọng cho vật nuôi. Chúng ta cần
đẩy mạnh hơn nữa những nghiên cứu và ứng dụng probiotic vào chăn nuôi nhằm
mang lại lợi ích về kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi.
1.3. Sáp ong và mật ong
Mật ong, sáp ong đƣợc con ngƣời dùng từ cách đây hàng ngàn năm. Ở Việt
Nam, ngƣời ta cũng đã biết dùng mật và sáp ong để tăng cƣờng sức khỏe và phối

hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa trị những căn bệnh từ thông thƣờng đến nguy
hiểm.
Theo nhƣ phân tích thì mật ong là sản phẩm tự nhiên rất bổ dƣỡng với
khoảng 75-80% đƣờng (đƣờng trong mật ong là fructose và glucose, loại đƣờng
đƣợc hấp thụ trực tiếp vào máu); mật ong cũng rất giàu chất khoáng: phốt pho,
canxi, magiê…vài loại axit amin và enzyme…
Từ xa xƣa, mật ong đã đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thuốc kháng khuẩn,
dùng để băng bó vết thƣơng và điều trị những bệnh liên quan đến rối loạn chức
năng cơ thể. Trong mật ong có chứa chất bảo vệ các vết thƣơng không bị nhiễm
trùng. Ðể giải thích cơ chế làm cho vết thƣơng lành bệnh khi dùng mật ong có nhiều
ý kiến cho rằng: Thứ nhất, trong mật ong có mặt hai loại đƣờng là glucose và
fructose, hai loại đƣờng này thƣờng thu hút nƣớc mạnh, mật ong sẽ hấp thụ nƣớc ở
vết thƣơng, làm khô vùng thƣơng tích, chính điều kiện này làm môi trƣờng không
thuận lợi cho các vi khuẩn và nấm phát triển (VSV thƣờng phát triển mạnh trong
một môi trƣờng ẩm). Ðiều quan trọng thứ hai là mật ong có chứa một enzyme gọi là
glucose oxidase, khi kết hợp với nƣớc, sản xuất hydrogen peroxide, một chất có tính
khử trùng cao. Một nghiên cứu của trƣờng Ðại Học Bonn (Ðức) đã xác nhận đặc
13

tính kháng khuẩn kỳ diệu của mật ong, nhƣ y học dân gian đã khẳng định. Sáp ong
có rất nhiều tác dụng trong y dƣợc học, điển hình nhƣ: (1) Làm giảm cholesterol
trong máu và giảm đau; (2) chống viêm, chống loét (VD: viêm loét dạ dày, tiêu
chảy…); (3) kháng nấm và kháng sinh tự nhiên; (4) điều hòa hệ miễn dịch, ức chế
và kích thích hệ miễn dịch [29].
Sáp ong có khả năng điều trị bỏng da hiệu quả, giúp làm mềm và giữ ẩm cho
da. Trong công nghệ bào chế dƣợc phẩm, sáp ong còn đƣợc sử dụng làm tá dƣợc.
Trong công nghiệp, sáp ong là một chất nhũ hóa hiệu quả hay đƣợc sử dụng nhƣ là
một loại hƣơng liệu trong sản xuất xà phòng và nƣớc hoa.

14

CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vi sinh vật
Vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ các mẫu mật ong, sáp ong đƣợc thu từ các
địa phƣơng khác nhau ở miền bắc Việt Nam.
Các chủng VSV kiểm định gồm: Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, Lactobacillus plantarium nhận từ phòng thí nghiệm Công
nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội.
2.1.2. Máy móc thiết bị
Sử dụng các máy móc, thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội.
Các thiết bị để khử trùng, vô trùng: Buồng thao tác vô trùng (Biosafe, Đan
Mạch), nồi khử trùng (Tomy, Nhật), tủ sấy (Binder, Đức), lò vi sóng, máy cất
nƣớc…
Các thiết bị để nuôi cấy và giữ giống: Tủ ấm (Binder, Đức), máy lắc ổn
nhiệt, tủ lạnh sâu, tủ làm đá…
Các thiết bị nghiên cứu đặc điểm sinh học: kính hiển vi quang học (Olympus
CH – 2, Nhật), máy đo quang phổ tử ngoại (UV- vis, Nhật), máy li tâm (Sorvall,
Mỹ), cân phân tích (Pracisa XT 320M, Thụy Sĩ) và các dụng cụ thông dụng khác
của PTN.
2.1.3. Hoá chất
Cao nấm men (Đức), Cao thịt (Merck, Đức), Pepton (Trung Quốc), Tween 80
(Đức), NaH
2
PO
4

(Nhật), FeSO
4
.7H
2
O (Merck, Đức), NaOH (Merck, Đức), NaCl (Việt
Nam), MgSO
4
.7H
2
O (Trung Quốc), Glucose (Việt Nam), CH
3
COONa (Trung Quốc),
MnSO
4
.4H
2
O (Anh), CaCO
3
(Việt Nam), (NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7
(Trung Quốc), Na
2

HPO
4
(Nhật), NaOH (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), CaCO
3
(Việt Nam), Thạch (Việt
Nam)…
15

2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi
khuẩn lactic – Môi trường MRS
Thành phần (g/l) Thành phần (g/l)
Cao thịt 10.0 (NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7
2.0
Cao nấm men 5.0 MgSO
4.
7H
2
O 0.1
Pepton 10.0 MnSO
4

.4H
2
O 0.05
Glucose 20.0 CH
3
COONa 5.0
Aga 20.0 Tween 80 1.0 ml
Nƣớc cất 1000 ml NaH
2
PO
4
2.0
2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA
Thành phần (g/l)
Cao thịt 5.0
Pepton 5.0
NaCl 5.0
Aga 20.0
Nƣớc cất 1000ml
2.1.4.3. Môi trường thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic
Nghiền nhỏ 250g nguyên liệu hữu cơ (bắp cải, rau má, cải ngọt, hành) trong
1l nƣớc, lọc lấy dịch trong, thu đƣợc 1l dịch chiết tự nhiên 25%.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong
Phân lập trực tiếp trên môi trƣờng MRS có CaCO
3

 Nguyên tắc
Dựa vào đặc tính sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic, làm tan CaCO
3

trong môi trƣờng phân lập MRS tạo nên vòng phân giải CaCO
3
trong suốt xung
quanh khuẩn lạc.
 Tiến hành thí nghiệm
Nghiền nhuyễn mẫu, cân lấy 1g. Sau đó pha loãng 1g mẫu này trong nƣớc
cất đã vô trùng để đạt độ pha loãng từ 10
-1
đến 10
-3
. Dùng pipette lấy 100 mẫu ở