Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển Gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tu mefaciens

i




















Bộ giáo dục và đào tạo
Tr-ờng đại học s- phạm hà nội 2
=================================

Hoàng thị thủy






Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh
và b-ớc đầu chuyển gen chỉ thị vào cây
khoai tây thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens







luận văn thạc sĩ sinh học

Hà nội, 2010



ii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.
TS. Lê Huy Hàm, Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Lý Thu là người thầy đã tận tình
hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự đào tạo và giúp đỡ nhiệt tình của các giáo viên
Bộ môn sinh – Trường đại học sư phạm Hà Nội 2, những người thầy đã dạy tôi
trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành chương trình các môn học cao học.
Đồng thời tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ
khoa học của Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di
truyền Nông nghiệp.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đã luôn luôn bên tôi, quan
tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự
động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã dành cho tôi.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010
Học viên


Hoàng Thị Thủy

iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010
Tác giả


Hoàng Thị Thủy



iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC CÁC BẢNG viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
MỞ ĐẦU 1

Chƣơng 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 4
1.1.1. Hệ thống phân loại cây khoai tây 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái 4
1.2. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 5
1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 6
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật 7
1.2.3. Tái sinh cây khoai tây 8
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 8
1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật 11
1.3.1. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 11
1.3.2. Hệ thống vector chuyển gen 21
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 23
1.4.1. Các nghiên cứu sản xuất, nhân giống khoai tây 23
1.4.2. Một số thành tựu về cây trồng biến đổi gen 25
Chƣơng 2 29
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. Vật liệu nghiên cứu 29


v

2.1.1 Vật liệu thực vật 29
2.2.2 Vật liệu di truyền 29
2.2. Nội dung nghiên cứu 30
2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi 30
2.2.2. Nghiên cứu tái sinh chồi 30
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.3.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 31

2.3.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu thực vật 32
2.3.3 Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn 32
2.3.4. Phương pháp chuyển gen 33
2.3.5. Môi trường nuôi cấy 34
2.3.6. Phương pháp đánh giá biểu hiện gen gus tạm thời 35
2.4. Bố trí thí nghiệm 35
2.4.1. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 35
2.4.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium
tumefaciens 37
2.5. Các chỉ tiêu đánh giá 39
2.6. Xử lý số liệu 39
2.7. Thiết bị nghiên cứu 39
2.8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Xây dựng quy trình tạo callus và tái sinh cây ở khoai tây 40
3.1.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng
mô khác nhau ở cây khoai tây 40
3.1.2. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 42
3.1.3. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 46
3.1.4. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus ở khoai tây 49
3.1.5. Ảnh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus 52
3.1.6. Nghiên cứu tái sinh chồi 55


vi

3.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium
tumefaciens 56
3.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ở
giống khoai tây Atlantic. 56

3.2.2. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào cây khoai tây thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens 59
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD
600nm
) lên tỉ lệ biểu
hiện tạm thời của gen gus 61
3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ
biểu hiện tạm thời của gen gus 62
63
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
Phụ lục1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige and Skoogs, 1972) 73
Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng N6 (Chu và cộng sự, 1975) 74
Phụ lục 3: Môi trƣờng nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu 76




vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
& cs
và cộng sự
2,4D
Dichlorophenoxy acetic acid
AS
Acetosyringone
BAP
6- Benzyl amino purin
bar

Gen mã hóa tổng hợp phosphinothricin acetyl transferase
ĐHST
Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật
GA
Gibberellic Acid
gus
Gen mã hóa tổng hợp β-glucuronidase
IAA
β- Indole- Acetic Acid
Kinetin
6- furfuryl amino purin
LB
Luria Bertani Medium
MS
Murahige and Skoogs, (1962)
NAA
Napthalene acetic acid
N6
Chu & cs, 1975



viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây
khoai tây. 40
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân 41
cây khoai tây 41

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây. 43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây
45
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây. 48
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây. 51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 54
Bảng 3.12. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở giống khoai tây
Atlantic. 56
Bảng 3.13. 59
cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 59
Bảng 3.14. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào đoạn thân 60
cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 60
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
ở cây khoai tây chuyển gen 61
64


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Cấu trúc Ti-plasmid 18
Hình 1.2. Cấu trúc đoạn T-DNA 18
Hình 1.3. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 19
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 21
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 23
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 29

Hình 2.2. Cấu trúc vector p6d35S-GUS 30
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá 41
cây khoai tây (1.Môi trường: N6; 2. Môi trường: MS) 41
Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
khoai tây (3. Môi trường: N6; 4. Môi trường: MS) 42
Hình 3.3. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 44
CT1(1); CT9(2); CT(7) 44
Hình 3.4. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây
CT1(1); CT9(2); CT(6) 46
Hình 3.5. Ảnh hưởng của xytokinin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 48
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây khoai tây
51
Hình 3.8. Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai
tây 52
Hình 3.9. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây
khoai tây 53
Hình 3.10. Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 54


x

Hình3.11. Tái sinh chồi từ mẫu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây
Attlantic 56
Hình 3.12. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mẫu lá khoai tây Atlantic sau khi lây
nhiễm với các chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác nhau. 58
Hình 3.13. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi
lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác nhau. 58

Hình 3.14. Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào mẫu lá khoai tây
Atlantic(AA39: p6d35S-GUS; AA43: pCAMBIA1301) 60
Hình 3.15. Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic
(AA39: pCAMBIA1301; AA43: p6d35S-GUS) 60
Hình 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
lên mẫu lá khoai tây 63
Hình 3.17. Ảnh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở
thân khoai tây 63
Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở đoạn thân khoai tây 65


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đứng
hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô. Ở một số nước, khoai tây được xem là thực
phẩm chính hàng ngày mặc dù giá thành thấp nhưng có giá trị dinh dưỡng cao.
Việt Nam, có thời kỳ coi khoai tây là nhóm cây lương thực có tầm quan
trọng thứ ba sau lúa và ngô. Cây con được nhân giống in vitro thường được dùng để
sản xuất khoai tây giống phục vụ cho việc tạo củ in vitro [10]. Hiện nay, nhiều cơ
quan như Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cây lương thực và
Cây thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Công ty Giống cây trồng
Trung ương đã đầu tư cho việc nghiên cứu, sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh,
tuy nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có hệ thống sản xuất, xác nhận giống và
cung ứng giống khoai tây hoàn chỉnh [53].
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chúng ta đã chứng kiến các bước phát
triển vượt bậc của công nghệ sinh học. Từ những nghiên cứu cơ bản trong những
năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng

chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng
thuốc diệt cỏ, chịu hạn, mặn, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường
chất lượng dinh dưỡng, tăng cường hoạt chất sinh học và ứng dụng trong sản xuất.
Một trong những phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật
là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin,
các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như:
kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine [35].
Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp vaccine ở
thực vật như lúa, thuốc lá, khoai tây, cà rốt, rau diếp, chuối, cà chua [20], [32], [33],
[34], [41], [45], [47]. Các nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine
uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, nó không những sẽ
góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới
trong việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật cho mọi mặt của đời sống. Cây


2

khoai tây là một trong những đối tượng thực vật có vai trò quan trọng trong thành
công của lĩnh vực này.
Việt Nam có khả năng phát triển mạnh cây khoai tây, nhất là ở vùng đồng
bằng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc trung Bộ và Tây Nguyên, ước tính, ít nhất có
khoảng 200.000 ha đất có thể trồng được khoai tây. Tuy nhiên trong những năm gần
đây, diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng 30.000-35.000 ha với năng
suất bình quân khoảng từ 10-11 tấn/ha. Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn
đến năng suất thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt. Củ
giống trồng phổ biến là loại củ giống chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao,
già sinh lý và độ thuần chủng thấp) [53].
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:“ Nghiên cứu xây
dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens“.

2. Mục đích nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô
khác nhau của cây khoai tây.
- Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình tạo callus và
tái sinh cây như: nền khoáng, chất ĐHST, xaccarozơ, casein hydrolysate
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình biến nạp gen
vào cây khoai tây thông qua A. tumefacines như: Chủng vi khuẩn Agrobacterium
thích hợp cho biến nạp gen, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, AS
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
*Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái sinh,
khả năng tiếp nhận gen từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống
khoai tây.



3


* Ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở để áp dụng chuyển gen quan tâm vào cây khoai tây nhằm tạo ra các
giống khoai tây biến đổi gen.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào
( theo quy trình của Yee shirley và cộng sự, 2001)
 Phương pháp chuyển gen (theo quy trình của De Block, 1988)
 Phương pháp đánh giá biểu hiện gen gus tạm thời

(theo Jefferson và cộng sự 1987).
6. Giả thuyết khoa học
- Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô
khác nhau của cây khoai tây.
- Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.


4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây
1.1.1. Hệ thống phân loại cây khoai tây
Khoai tây - Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà - Solanaceae
Giới (regnum):
Plant
ae
Bộ
(ordo):
Solan
ales
Họ
(familia):
Solan
aceae
Chi
(genus):
Solan
um

Loài
(species):
S.
tuberosum

1.1.2. Đặc điểm hình thái
a) Bộ rễ
Rễ khoai tây thuộc loại rễ chùm (trồng từ củ), có rễ cọc (khi trồng bằng hạt),
từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác. Phần lớn rễ tập trung ở độ sâu 30-40 cm,
nhưng cũng có những rễ ăn sâu tới 1,5-2m. Ngoài ra rễ còn phát triển ở trên củ
nhưng ngắn, ít phân nhánh và cũng có chức năng giống các rễ khác.
Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kỳ ra hoa (ở dưới mặt đất lúc này đã hình
thành củ và củ bắt đầu lớn lên).
b) Thân
Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo dích dắc, có 3-4 cạnh, cao
trung bình từ 40-70 cm đến 1-1,2 m. Phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm
sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau. Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt


5

hay đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím tuỳ thuộc vào từng giống. Trên thân
có lớp lông tơ mềm (khi cây còn non) cứng dần và rụng theo thời gian sinh trưởng.
c) Lá
Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng khác một số điểm- thuộc lá phức
tạp, bản lá to, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và 1 lá lẻ trên cùng thường lớn hơn
được gọi là lá chét đỉnh. Lá khoai tây dài khoảng 10-15 cm, mặt lá phẳng hoặc gợn
sóng, lá bản to hơn lá cà chua. Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện
chăm sóc mà có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt
d) Hoa

Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên 1 chùm hoa. Nó thuộc loại hoa
lưỡng tính và có cấu tạo 5:5:5; cuống ngắn. Màu sắc hoa thường trắng, cũng có thể
là phớt hồng, hồng, tím hoặc màu đỏ phụ thuộc vào từng loại và giống
e) Quả
Quả thuộc loại quả mọng. Hình dạng quả tròn hoặc trái xoan. Khi chín, quả
màu trắng bạc hoặc phớt hồng, mùi vị dễ chịu. Quả có từ 2-3 ngăn, trong đó có chứa
nhiều hạt (30-300 hạt).
f) Hạt
Hạt khoai tây có dạng hình dẹt, màu cà phê sáng hoặc màu đen. Khối lượng
1000 hạt khoảng 0,5 g. Thời gian ngủ nghỉ hạt lâu.
g) Củ
Củ là bộ phận làm thực phẩm cho con người. Củ khoai tây còn có tên gọi là
thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành là do thân phát triển dưới mặt đất,
trong điều kiện bóng tối. Hình dạng củ khoai tây có thể tròn, elip, tròn dài, đôi khi
hình vuông. Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt,
vàng, vàng nhạt trên củ có nhiều mắt củ, nhưng phân bố không đều. Số lượng mắt
củ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng giống. Trên mắt củ có mi mắt và mắt. Mi mắt dài
hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính di truyền của giống. Trên mỗi mắt
thường có 2-3 mầm ngủ và thường tập trung nhiều trên đỉnh củ [7].
1.2. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào


6

1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính toàn
năng của tế bào do nhà thực vật học người Đức Haberland đưa ra vào năm 1902. Kế
thừa quan điểm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng tất cả các tế bào cấu tạo
nên cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền đủ để mã hoá hình thành

một cơ thể, các nhà nghiên cứu cho rằng mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thể
nếu được nuôi trong điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Từ đó đến nay, rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan. Điều đó
khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế
bào thực vật [2], [5], [18].
1.2.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan
khác nhau, có chức năng khác nhau và được hình thành từ nhiều loại tế bào khác
nhau. Tuy nhiên mọi tế bào đều bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu. Tế bào hợp
tử đầu tiên lúc đầu phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hoá. Các tế bào chưa
chuyên hoá này tiếp tục phân chia và biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc
trưng cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Đó là hiện tượng phân hoá tế
bào. Tuy nhiên, các tế bào chuyên hoá thành các tế bào chuyên biệt lại không mất
hoàn toàn sự biến đổi của mình. Trong những điều kiện thích hợp nhất định chúng
có thể trở thành dạng tế bào chưa chuyên hoá. Hiện tượng này gọi là hiện tượng
phản phân hoá tế bào [2], [5].
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt
động của các gen. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số gen nào
đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho ra một tính trạng
biểu hiện mới. Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình
hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ
gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà.


7

Sự hoạt hoá mô, cơ quan của cơ thể. Khi tách riêng từng tế bào, hoặc làm giảm kích
thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [5].
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh

hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa và sự phân hoá và phản
phân hoá tế bào thực vật. Để điều khiển được phát sinh hình thái của tế bào, người
ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật
chính là auxin và xytokinin. Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất điều hoà sinh
trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh
hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc callus) của mô nuôi cấy khác nhau. Trong môi
trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/xytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo
hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo callus [5], [18].
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật
Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và phát sinh cây hoàn chỉnh đạt hiệu xuất
cao là tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chuyển gen. Đối với mỗi loài thực vật, nhất
thiết phải nghiên cứu tối ưu hoá kỹ thuật nuôi cấy thích hợp. Sau đây là các hướng
tái sinh cây từ mô thực vật có thể được sử dụng để biến nạp gen :
Nuôi cấy callus: Callus là khối tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền
thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao.
Callus thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như thân, lá, rễ, hoa
trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin
và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Callus có thể được duy trì liên tục trên môi trường
nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ. Callus khi cấy chuyển lên môi trường thích
hợp có thể phát sinh chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma và nảy mầm thành cây hoàn
chỉnh. Đây là hệ thống nuôi cấy có thể được sử dụng để biến nạp gen đạt hiệu quả cao.
Cây chuyển gen phát triển từ một tế bào callus không bị thể khảm [2].
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế
bào trong môi trường lỏng. Các tế bào này cũng được tạo ra từ callus có nguồn gốc
từ thân, lá, rễ, hoa phôi Tuy nhiên trở ngại của phương pháp này cần thời gian
nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây [52].


8

Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ
còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh được gọi là tế
bào trần (protoplast). Các tế bào trần sau khi được nuôi cấy trên môi trường thích
hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối callus và tái sinh thành cây hoàn
chỉnh. Ứng dụng có ý nghĩa nhất ở phương pháp này là tạo cây lai tế bào chất thông
qua dung hợp protoplast và úng dụng để biến nạp gen [11].
Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn
thân không có chồi bên, cũng có thể được sử dụng để chuyển gen.
1.2.3. Tái sinh cây khoai tây
Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu chốt quyết định đến
sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gen. Nhiều nhà nghiên cứu thực
nghiệm đã thu được tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc nhưng lại không tái
sinh được cây hoàn chỉnh. Do vậy hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh được
cây hoàn chỉnh là công việc quan trọng đầu tiên khi tiến hành biến nạp gen. Một
trong yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy và tái sinh cây như: Nguồn mẫu vật nuôi cấy,
môi trường và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng và
các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc.
Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tái sinh thành công cây khoai
tây in vitro từ các nguyên liệu như thân, lá thông qua con đường nuôi cấy thuỷ canh
in vitro phục vụ sản xuất củ bi khoai tây (Solanum tuberosum L.) và vi ghép in vitro
cây cà chua (Lycopersicum esculentum) và cây khoai tây(Solanum tuberosum) [10].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
Môi trường nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in
vitro. Ngoài chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có nhiệm
vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá
và phát triển. Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi
trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá
trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể.

9

- Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự
sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Thành phần
của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy
nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2].
+ Nhóm nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là nguyên tố muối khoáng
được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg
và Ca. Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế
bào và có chức năng xây nên thành tế bào.
+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là nguyên tố khoáng được
sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo tuy chỉ cần
một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu
cho sự sinh trưởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị
rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển callus rất nhanh, nhưng có hiệu xuất tái sinh
thấp. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào
từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.
+ Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất
yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được
các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn cacbon bổ sung là
đường xaccarozơ và glucozơ với liều lượng 20-30g/lít. Guatheret (1959) cho thấy
đối với phần lớn các mô, đường xaccarozơ và glucozơ là nguồn cacbon tốt nhất
[13]. Trong trường hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như:
maltozơ, lactozơ hay fructozơ.
+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng
tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh
trưởng và phát triển nhanh của chúng. Các vitamin thường được sử dụng như: B
1
(thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào
thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng

độ thường dùng từ 0,1-10 mg/l. B
6
(piridoxin) tham gia vào thành phần các enzim
khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin, nồng độ thường dùng


10

từ 0,1-1 mg/l. B
5
(axit nicotinic) đi vào thành phần các enzim oxy hóa khử
dehydrrogenase xúc tác việc tách hydro khỏi các axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng
từ 0,5-1 mg/l. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong
sinh tổng hợp thành tế bào thực vật [13].
+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi
cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của callus và các cơ quan như: nước dừa, khoai
tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần nước dừa chứa các axit amin, axit
hữu cơ, đường, myo-inositol và các chất hoạt tính auxin, các gluoxit của xytokinin.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết
sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ
quá trình nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng
của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất điều
hoà sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì
vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm
ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy
mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất là auxin, xytokinin và gibberellin. .
Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự dãn tế bào, sự hình
thành rễ bất định và callus. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng các loại auxin
là: IAA, NAA và 2,4-D. Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-0,5
mg/l tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy.

Các chất thuộc nhóm xytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và
hình thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là: Kinetin và
BAP. Tỉ lệ giữa auxin và xytokinin quy định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng
tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành callus. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi
trường nuôi cấy nếu tỉ lệ auxin/xytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ,
nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu
nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo callus.
+ Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới
quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế đã chứng


11

minh pH thấp (pH<4,5) hoặc cao (pH>7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển
của mô và tế bào nuôi cấy. Cụ thể, nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối
loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu
cấy. Thông thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5-6,5 trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật.
- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng
cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.
+ Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế
bào và các quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự
hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của mô nuôi
cấy. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25±2
o
C.
+ Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát
triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu
sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu sáng
phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian

chiếu sáng thường biến động từ 12-16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn huỳnh quang với
cường độ 2000-3000 Lux, tương đương với khoảng cách 30cm từ đèn chiếu sáng tới
mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường độ thấp là phù hợp với nuôi
cấy in vitro. Nuôi cấy callus có thể không cần ánh sáng. Chất lượng ánh sáng cũng
ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân,
chồi hơn so với ánh sáng trắng. Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có
ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của callus. Nguồn chiếu sáng bằng đèn Compact 3U
có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây và cây hoa
chuông [10].
1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật
1.3.1. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
1.3.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp
 Chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện (electroporation)


12

Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Người ta chuẩn bị
một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen
chọn lọc. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200-600 V/cm trong
khoảng thời gian ngắn 4-5 phần nghìn giây. Kết quả làm cho màng tế bào trần xuất
hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 30 m, mà qua đó các DNA
biến nạp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào trong tế bào. Quá trình biến nạp được
thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc các “buồng xung điện” có các tấm cực
bằng kim loại đặt cách nhau 1 – 4 mm. Sau quá trình điện xung, tế bào trần được
nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc để tách các tế bào
trần đă thu nhận DNA. Sau đó các tế bào trần này được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp
tục chọn lọc. Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung điện bao
gồm: cường độ điện trường, điện dung, tính chất ion và nồng độ đệm, thời gian tiền
xử lý.

 Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide
Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi
silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 m và dài khoảng 10 - 80 m.
Khi lắc một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn và
gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị
thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào. Sau đó các tế bào này được nuôi cấy
tạo callus, tái sinh cây và chọn lọc để tách ra những cây mang gen chuyển [14].
Huyền phù tế bào đơn thường được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi
cấy chuyển là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen.
Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kích thước sợi silicon carbide, thông số
vortex, dụng cụ chứa mẫu, nguyên liệu thực vật và đặc điểm tế bào thực vật, đặc
biệt là độ dày của thành tế bào.
Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chi phí thấp và áp dụng được cho
nhiều loài thực vật. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là hiệu quả chuyển gen thấp và
tổn thương gây ra cho tế bào có thể ảnh hưởng tới khả năng tái sinh sau này [46].
 Chuyển gen bằng súng bắn gen


13

Chuyển gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là các
phần tử kim loại nặng (wonfam hay vàng) có kích thước hiển vi (0,5 - 5 m) có
tỷ trọng cao để đạt được gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA
bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào [14], [42].
Ưu điểm:
- Có thể áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào.
- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh.
- Dễ sử dụng, quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được xử lý
trong thời gian ngắn.
- Các vector được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho

đoạn T-DNA như chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Cần một lượng nhỏ DNA plasmid.
- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vòng vài
ngày sau biến nạp.
Nhược điểm:
- Nhiều bản sao được chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho
việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không
bền vững.
- Tần số biến nạp thấp, thường xuyên nhận được thể khảm.
- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thể mua
được, giá thành vật tư đắt.
 Biến nạp bằng hoá chất PEG (polyethylene glycol)
Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp
chuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần.
Ở nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan
nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý
nồng độ cao của Ca
2+
hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào
trong tế bào trần [14].
Ưu điểm:


14

- Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.
- Có thể chuyển gen vào tế bào trần của bất kỳ loài thực vật nào
- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

15

Nhược điểm:
- Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản sao của gen trong tế bào biến
nạp có thể lớn.
- Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm.
- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc
phân tích biểu hiện của gen.
- Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tế bào trần vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài
cây trồng do phụ thuộc vào các yếu tố ngoài thí nghiệm như: loài, kiểu gen trong
loài, phản ứng tổn thương và tái sinh.
 Phương pháp vi tiêm
Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết bị
hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Kỹ thuật này có ưu
điểm là: lượng DNA được biến nạp là tuỳ ý và xác định, DNA được đưa vào đúng
vị trí mong muốn, thậm trí là nhân tế bào. Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích
thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thể thực hiện đ-
ược và có thể biến nạp vào các loài cây trồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các
tế bào vi tiêm. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi
lần biến nạp chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi
các kỹ thuật viên có kỹ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [14].
 Phương pháp vĩ tiêm
Sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa DNA
vào tế bào. Các tế bào này bị phá vỡ và DNA xâm nhập vào các tế bào bị tổn
thương, sau đó được chuyển vào các tế bào bên cạnh. Kỹ thuật này đơn giản nhưng
hiệu quả chuyển gen thấp [24]. Chuyển gen bằng vĩ tiêm thường áp dụng cho những
đối tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác.
 Phương pháp Agrolistic
Phương pháp Agrolistic kết hợp ưu điểm của hai phương pháp bắn gen và
chuyển gen thông qua Agrobacterium. Trong phương pháp này, vector thiết kế có

đoạn T-DNA mang gen quan tâm được chuyển đồng thời với các gen mã hoá protein