Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza.

1
I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM


B TH I


Tờn ti:
Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza


KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC



H o to : Chớnh quy
Chuyờn ngnh : Cụng ngh sinh hc
Lp : K42 - CNSH
Khoa : CNSH-CNTP
Khoỏ hc : 2010-2014
Ging viờn hng dn: TS. Dng Vn Cng
Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn
ThS. Lng Hựng Tin
Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn



Thỏi Nguyờn, nm 2014

2

LỜI CẢM ƠN!
Để thực hiện được đề tài này em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ, chỉ bảo
tận tình của thầy hướng dẫn và các thầy cô giáo, các bạn sinh viên.
Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Dương Văn Cường,
thầy Lương Hùng Tiến - giảng viên khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực
phẩm trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, thầy đã luôn quan tâm giúp đỡ và
chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tiếp theo em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ
Sinh học & Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện giúp đỡ em
hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã động viên,
giúp đỡ dành thời gian cho em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận trên.
Do trình độ và điều kiện thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không
tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô và các
bạn để đề tài hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, Ngày 30 tháng 5 năm 2014.
Sinh viên thực hiện


Bế Thị Đài

3
DANH MỤC BẢNG BIỂU
trang
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 20
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 21

Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza 26
Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 27
Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 28


4
DANH MỤC CÁC HÌNH
trang
Hình 2.1: Natto và enzyme Nattokinase 7
Hình 2.2: Các cơ chế tác động lên fibrin của Nattokinase 9
Hình 2.3. Hình ảnh sản phẩm Boza 16
Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 27
Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính Nattokinase của vi
khuẩn BL4 29
Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới hoạt tính sinh Nattokinase của vi khuẩn
BL4 30
Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp Nattokinase của vi
khuẩn BL4 31


5
DANH MỤC VIẾT TẮT

pI Điểm đẳng điện
Da Dalton
MW Khối lượng phân tử
B. subtilis Bacillus subtilis
TS Tiến sĩ
t-PA Tissue plasminogen activator
Bệnh viện TƯ Bệnh viện trung ương

cs Cộng sự



6
MỤC LỤC
trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Enzyme Nattokinase 3
2.1.1. Đậu tương 3
2.1.2. Natto và Nattokinase 6
2.2. Boza 16
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 17
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 18
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu 20
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 20
3.3.1. Hóa chất 20
3.3.2. Thiết bị sử dụng 21

3.3.3. Các môi trường sử dụng (Sambrook và Russel, 2006) 21
3.4. Nội dung nghiên cứu 22
3.5. Phương pháp nghiên cứu 22
3.5.1.Phương pháp phân lập 22
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn 22
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 23

7
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh
tổng hợp nattokinase của vi khuẩn 23
3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25
3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn 25
3.6. Phương pháp sử lý số liệu 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên
men Boza 26
4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên
men Boza 26
4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 26
4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4 28
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp
Nattokinase của vi khuẩn BL4 29
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng
hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 29
3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp
Nattokinase của vi khuẩn BL4 30
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 31
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33
4.1. Kết luận 33
4.2. Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông (trombus)
như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như
trên thế giới. Vì vậy enzyme Nattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuất và sử
dụng rộng rãi để phòng bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông. [1]
Nattokinase là serine protease gồm 275 axit amin, hoạt động ở pH tối ưu từ
8-10, nhiệt độ tối ưu từ 30 - 70
o
C, có trọng lượng phân tử từ 27,7 - 44kDa, điểm
đẳng điện (pI) 8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chế hoạt động của
nattokianse là trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách hoạt
hóa sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô. Sự tuần hoàn máu của người bị tác
động bởi một số enzyme đặc biệt. Nattokinase hỗ trợ cho máu có thể lưu thông tốt
hơn và giúp cho huyết áp ở mức bình thường.[32]
Nattokinase có thể được tổng hợp từ các vi sinh vật (nhân sơ và nhân thật)
như là Bacillus subtilis, Fusarium và Rhizomucor sp. và các enzyme tương tự có
thể được tổng hợp từ tuyến tụy của người (Trypsin và chymotrypsin). Vi sinh vật
có thể được dùng để sản xuất Nattokinase là Bacillus subtilis (Vi khuẩn) và
Rhizomucor sp. (Nấm mốc). Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể được phân lập từ
nhiều loại thực phẩm lên men truyền thống như: Natto của Nhật (Fujita M. và cs.,
1993); Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc (Peng Y. và cs.,
2003), Bacillus sp. CK 11-4 từ Chungkook-Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doc-Jang,
Hàn Quốc.[14][15]
Boza là đồ uống lên men truyền thống từ lúa mạch của nhiều nước đông Âu và

Thổ Nhĩ Kỳ. Trong Boza có hệ vi sinh đa dạng, bao gồm nhiều loại lợi khuẩn như là
vi khuẩn lactic như: Lactobacillus brevis, Lb. platarum, Lb. graminis, Lb.
paraplantarum, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis [18]. Các chủng vi khuẩn trong
Boza không chỉ lên men tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng từ lúa mạch mà có thể tổng

2
hợp sinh Nattokinase trong sản phẩm. Để đánh giá được điều này, chúng tôi lựa chọn
đề tài “Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
enzyme nattokinase từ boza” là đề tài nghiên cứu.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và nghiên cứu được khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase
của các chủng vi khuẩn từ Boza.
1.3. Yêu cầu
- Phân lập được các chủng có khả năng sinh enzyme phân hủy máu đông
Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng đã phân lập được.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
Nattokinase của các chủng đã phân lập.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân hùy máu
đông từ Boza, làm cơ sở để nghiên cứu tiếp theo trong thực tiễn.
- Giúp sinh viên tiếp cận với thực tế nghiên cứu khoa học, thành thạo các
thao tác phòng thí nghiệm vi sinh.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Phân lập được chủng vi khuẩn từ Boza có khả năng ứng dụng trong sản
xuất chế phẩm phân hủy huyết khối trong phòng, chữa các bệnh tim mạch.

3
PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme Nattokinase
2.1.1. Đậu tương
Đậu nành còn có tên là đậu tương. Nguồn gốc từ Trung Quốc, sau lan sang
Việt Nam, Nhật Bản, Triều Tiên. Châu Âu mới biết đến đậu nành từ thế kỷ 18. Từ
cổ xưa, đậu nành dùng làm thực phẩm, nhưng gần đây y học thế giới phát hiện ra
nhiều tác dụng chữa bệnh của nó.
Đây là kết luận được các chuyên gia Mỹ đưa ra trong hội nghị về khai thác
giá trị dinh dưỡng từ đậu nành đối với sức khỏe con người tại Viện Dinh dưỡng
thuộc Đại học Columbia (Mỹ).
- Ngừa ung thư vú ở phụ nữ
Một cuộc khảo sát của các nhà khoa học thuộc Đại học Georgetown (Mỹ)
cho thấy bổ sung đậu nành ở mức độ vừa phải giúp giảm nguy cơ bị ung thư vú.
Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ, dùng 3 khẩu phần đậu nành mỗi ngày đem lại nhiều
ích lợi cho phụ nữ có nguy cơ hoặc có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư vú.
[33]

-Tác dụng trên tim mạch
Theo một cuộc khảo sát, bổ sung 20-133g protein từ đậu nành mỗi ngày có
thể giúp giảm 7-10% hàm lượng cholesterol xấu LDL trong cơ thể. “Dùng đậu
nành là một phần của chế độ dinh dưỡng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim”,
Wahida Karmally – Giám đốc dinh dưỡng tại Viện Nghiên cứu Irving nói.
Còn theo Cơ quan Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA), thêm 25g
protein từ đậu nành mỗi ngày có tác dụng giảm lượng chất béo bão hòa, qua đó
giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch.
Các nhà khoa học thuộc Hội mãn kinh ở Bắc Mỹ đã kết luận: Đậu nành và
các chất chiết từ đậu nành có tác dụng giảm huyết áp tâm trương, giảm cholesterol
toàn phần, giảm cholesterol xấu (tức LDL-cholesterol), ngăn chặn sự tiến triển của

4

các mảng xơ vữa, cải thiện tính đàn hồi của động mạch. Do đó, ở Mỹ, cơ quan quản
lý thực phẩm và thuốc (FDA) từ năm 1999 đã cho phép dùng đậu nành để làm giảm
nguy cơ động mạch vành.
- Cung cấp đủ dưỡng chất
Các chuyên gia dinh dưỡng Mỹ khẳng định chế phẩm từ đậu nành rất giàu dinh
dưỡng và ăn một khẩu phần đậu nành mỗi ngày giúp bổ sung đầy đủ dưỡng chất.
“Đậu nành cung cấp nhiều chất quan trọng như kali, ma-giê, chất xơ, chất chống ô-xy
hóa”, hãng tin New Kerala dẫn lời chuyên gia Katherine Tucker cho biết.
- Điều trị chứng mãn kinh
Gần đây, người ta phát hiện thấy trong hạt đậu nành có isoflarm còn gọi là
estrogen thực vật (phytoestrogen); hoạt chất này góp phần làm cân bằng hormon ở
phụ nữ mãn kinh, cải thiện rõ rệt các triệu chứng khác của tuổi mãn kinh như: Bốc
hỏa, đổ mồ hôi đêm, trầm cảm, khô âm đạo…
[33]

- Tác dụng chuyển hoá xương
Thống kê dịch tễ học cho thấy: Tỷ lệ gãy xương ở phụ nữ châu Á thấp hơn rõ
rệt so với phụ nữ ở các nước phương Tây. Kết quả này có liên quan tới sử dụng
nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành. SI (isoflarm của đậu nành) làm tăng mật độ
khoáng tại các đốt sống 1,2 đến 1,4 lần (so sánh với phụ nữ dùng thức ăn ít có đậu
nành). Ở chuột thực nghiệm, SI làm giảm nguy cơ loãng xương do ức chế hoạt tính
của hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương.
- Tác dụng trên các khối u phụ thuộc và hormon
Thống kê dịch tễ học cũng cho thấy một số loại khối u phụ thuộc vào
hormon (ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng…) có tỷ lệ rất thấp ở phụ nữ
châu Á. Nhận xét này có liên quan tới chế độ ăn giàu đậu nành ở công dân châu Á.
Kết quả nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng cho thấy SI (isoflarm ở đậu nành)
có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư ở tử cung, vú và buồng trứng.

5
- Ung thư
Genistein trong đậu nành làm giảm nguy cơ ung thư bằng cách giảm sự tổn
thương tế bào, và chất ức chế Protease BowmanBirk có trong Protein đậu nành cũng
có thể ức chế sự khởi phát ung thư. Chất Daidzein trong Protein đậu nành, nếu được
sử dụng với liều cao sẽ có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch, để phá hủy những
chất có hại cho cơ thể, do đó có tác động lên việc giảm nguy cơ bị ung thư.
[33]

- Xương khớp
Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng những phụ nữ dùng nhiều đạm động vật
sẽ gây mất Calcium qua nước tiểu, do đó sẽ có nguy cơ gãy xương nhiều hơn là
những phụ nữ dùng Protein thực vật. Nghiên cứu cho thấy rằng dùng Protein đậu
nành, đặc biệt là Isoflavones có thể có tác động tốt lên đậm độ khoáng trong xương
ở những phụ nữ mãn kinh mà không dùng Ostrogen thay thế.
- Đậu nành dùng trong dinh dưỡng và công nghiệp
Trong dinh dưỡng bột đậu nành trộn với bột ngũ cốc, dùng làm thức ăn cho
trẻ sơ sinh, người bị bệnh đái tháo đường, bệnh gút… Trong công nghiệp dược, bột
đậu nành dùng trong môi trường nuôi cấy kháng sinh.
Những sản phẩm đi từ đậu nành như Tàu hủ, tương, chao, sữa, natto… là
những thực phẩm giàu protein (đạm) cung cấp nhiều loại acid amin cần thiết cho cơ
thể. Những acid amin của đậu nành kết hợp rất tốt với các loại acid amin của những
ngũ cốc khác. Đậu nành còn là nguồn của Lecithin và Vitamin E là những hoạt chất
chống oxy- hóa thiên nhiên ngăn chận tác hại của Cholesterol nồng độ thấp (LDL)
mặt khác đậu nành lại giàu Magnesium giữ vai trò quan trọng cho xương, tim mạch
và chống xơ vữa động mạch. Hơn thế nữa đậu nành còn có tác dụng rất tốt cho
Thận thực hiện chức năng của mình (phế thải chất bã do chuyển hóa của đạm, phế
thải nước, khoáng chất dư thừa trong cơ thể, độc tố trong thực phẩm…). Đạm thực
vật có trong đậu nành thay thế đạm động vật (từ thịt) làm cho Thận làm việc ít hơn,
lượng protein trong nước tiểu giảm, ngăn ngừa nguy cơ sạn thận. Tại hội nghị quốc

tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/4-3/5/2006) GS Masafumi Kitakaze
đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng Mỡ (Triglyceride và

6
Cholesterols) trong máu cao qua nghiên cứu chung của 4 cơ quan y tế Nhật Bản,
kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sinh hoạt (Lifestyle) và tiêu thụ Natto
thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm
nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng khắp nơi trên thế giới.[3]
2.1.2. Natto và Nattokinase
Natto còn được gọi là pho mai thực vật là những hạt đậu nành đã luộc chín
được ủ với men (Bacillus natto) ở một môi trường 40
o
C trong vòng 14-18 giờ để
lên men thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao, có mùi nồng nặc rất
khó chịu với người không quen. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ
nhớt càng cao thì chất lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt. Là một món ăn dân dã
rất phổ biến ở nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương
với rong biển phơi khô (Nori) và trứng gà sống. Natto có chứa nhiều chất bổ dưỡng
cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình
lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng
bệnh tim mạch-một phát hiện vô cùng lý thú bởi nhà nghiên cứu sinh lý học Nhật
bản nổi tiếng, giáo sư Sumi Hiroyuki vào năm 1980.
Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP. Nattokinase là
một enzym có hoạt động fibrinolytic rất mạnh mẽ, được chiết xuất và tinh chế từ
natto. Do đó Nattokinase có nghĩa là “enzym trong natto”.


7

Hình 2.1: Natto và enzyme Nattokinase

2.1.2.1. Nguồn gốc của Natto và Nattokinase
Natto là một món ăn truyền thống từ hàng ngàn năm của Nhật Bản
được làm từ những hạt đậu tương đã luộc chín lên men với Bacillus subtilis natto.
Nó được biết đến như là bí quyết giúp người Nhật sống lâu, khỏe mạnh, kéo dài
tuổi thọ. Người ta cho rằng natto rất hữu hiệu trong việc phòng chống bệnh
cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp…), làm chắc xương, tiêu diệt vi
trùng gây bệnh cũng như giúp cho phụ nữ mang thai sinh con khỏe khoắn. Trong
suốt thời kì chiến tranh Nhật-Nga (1904-1905), quân đội Nhật Bản đã phải ăn ngày
3 bữa bằng natto với cơm nhờ vậy binh lính gìn giữ được sức khỏe không bị đau
bụng, tiêu chảy hay táo bón trên đường hành quân. Natto đã trở thành một đề tài
nóng hổi khi TS Sumi Hiroyuki đưa ra những kết quả bất ngờ về hiệu quả của natto
trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch, một trong những nguyên nhân
suy tim và tử vong của bệnh nhân bị các chứng xơ vữa động mạch vành hay đột quị
vì nghẽn hay xuất huyết não vào năm 1980.
Trong bữa cơm trưa tại nhà ăn của đại học Y khoa Chicago, Sumi lấy một
mẫu natto đặt vào khay thủy tinh có cục máu đông thì 18 giờ sau cục máu đông này

8
tan rã hoàn toàn, điều đó gợi ý rằng trong natto có thể có một hay nhiều hoạt chất
có thể phân hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin có khả năng làm đông máu (tụ
máu) để ngăn chứng xuất huyết nội. Sumi bắt đầu lưu ý tới vai trò của
“Nattokinase” và Vitamin K2 có trong natto để chứng minh nó là hoạt chất giúp
cho người Nhật Bản sống lâu, làm tăng khả năng tạo ra plasmin nội sinh giúp
cho cơ thể tránh được tai biến hay đột quị bởi huyết khối hay các chứng xơ
vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên. Theo kết quả nghiên cứu của 3 cơ
quan y tế đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR Pharmaceuticals (N) và Trường
Y khoa Miyazaki phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người bằng cách cho ăn natto
200 g/ngày và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện
lượng plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết
khối, vón cục trong động mạch thì hiệu quả càng rõ rệt.[24]

Năm 1987, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng
của Nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so
sánh, xác định Nattokinase là một loại enzyme mang khả năng phân hủy huyết khối
một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzym, gấp 4 lần plasmin,enzym
nội sinh làm tan máu đông, đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua
đường ăn uống [27].

9
2.1.2.2. Cơ chế tác động của Nattokinase [27]
Hình 2.2: Các cơ chế tác động lên fibrin của Nattokinase
(Nattokinase thủy phân fibrin trực tiếp (A), Thay đổi chuyển hóa prourokinase
thành Urokinase (B), Tăng chất hoạt hóa plasminogen mô (tPA))

Nattokinase, hoạt chất chính chiết xuất từ Natto,là một enzyme tìm thấy
trong tự nhiên có trọng lượng phân tử 20,000 ± 5000. Nó bền với nhiệt đến 60ºC
với pH 6–12. Mặc dù cơ thể con người có vài loại enzyme tạo ra cục máu đông
nhưng chỉ có một enzyme duy nhất là “plasmin” để phá hủy và hòa tan nó. Đặc tính
của Nattokinase gần giống với plasmin. Nattokinase chiết xuất từ Natto, là một
enzyme thủy phân hiệu quả các mảng bám và huyết khối khi các sợi fibrin này kết
hợp lại với nhau. Nattokinase có cấu trúc của một protein, được tạo ra bởi chuỗi
đơn polypeptide có 275 phân tử, có Ala ở N-cuối cùng. Nó thủy phân sợi huyết
mạnh mẽ. Nattokinase là một enzyme thủy phân fibrin mạnh nhất trong gần 200
loại thực phẩm bổ xung qua đường ăn uống được nghiên cứu [25].
10
Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh, một loại enzyme
làm tan fibrin trong cơ thể. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin
càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng giúp tăng
cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase
tăng cường lưu thông máu, ngăn chặn xơ vữa mạch. Không giống như aspirin và
hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực

tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những nơi máu bị cản trở
lưu thông [27].
Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin, Nattokinase không
những giúp làm tan cục máu đông đã hình thành mà còn hoạt động như một thành
phần chống hình thành cục máu đông
Các tác dụng của Nattokinase:
- Làm tan cục máu đông: Nattokinase làm tan cục máu đông bằng cách làm
tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu
đông). Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy
nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin
này. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ
hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và
các thành phần chống đông máu khác như urokinase.[27]
- Huyết áp: Nattokinase làm giảm huyết áp. Người Nhật ăn loại đậu lên men
đã hơn 1000 năm vì mục đích này. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó làm giảm huyết
áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE). ACE khiến mạch máu
bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. Nattokinase có khả năng ức chế ACE, ngăn cản dầy
nội mạc mạch.[17]
- Tăng cường lưu thông máu: Nattokinase trợ giúp máu lưu thông bằng cách
hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn. Nó cũng được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn
xơ vữa mạch.
- Các lợi ích khác: làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu,
kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn, bệnh lị.
11
Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí
nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ
Nattokinase hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người bệnh này.
* Nghiên cứu lâm sàng
- Hoạt động tiêu huyết khối
Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá ra Nattokinase vào năm 1980 trong khi tiến

hành nghiên cứu tại Đại học Chicago. Tiến sĩ thử nghiệm với gần 200 loại thực
phẩm và phát hiện ra tiềm năng của đậu natto khi cho nó vào cục máu nhân tạo và
giữ ở nhiệt độ cơ thể. Ông nhận thấy huyết khối bị tan dần và hoàn toàn biến mất
sau 18 tiếng.
TS Sumi kế tiếp thử nghiệm lâm sàng với con người và động vật. Trong
nghiên cứu đầu tiên, 12 tình nguyện viên được cho sử dụng 200g Natto hàng ngày.
Các hoạt động Fibrinolytic máu của họ được đo theo 2 cách. Lấy mẫu máu và kích
thích tạo một cục máu đông trong mẫu sau đó đo thời gian cục máu đông tan hoàn
toàn. Nhóm sử dụng Nattokinase mất một nửa thời gian so với nhóm đối chứng.
Bài kiểm tra thứ hai dùng máu cho vào đĩa với một loại polyme fibrinogen
đặc biệt. Mức độ tan được đo 4 tiếng 1 lần. Nhóm đối chứng cho thấy không tan
trong khi nhóm Nattokinase có tốc độ tan là 14mm/h.
Một thử nghiệm thứ ba sau đó được thực hiện để đo các mô hoạt hóa
plasminogen (t-PA) trong máu. Nhóm dùng Nattokinase cho thấy có sự tăng tPA.
tPA làm tăng plasmin, do đó các nghiện chỉ ra rằng ngoài khả năng trực tiếp tiêu sợi
Fibrin, nó còn tăng cường hoạt động chống hình thành cục máu đông của cơ thể.
TS Sumi cũng tiến hành một thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chó. Một
cục máu đông được tạo ra trong tĩnh mạch chân của chó gây tắc nghẽn hoàn toàn.
Sau 5h nhóm được cho ăn đậu Natto tĩnh mạch đã hoàn toàn lưu thông. Trong khi
đó nhóm dùng giả dược vẫn còn những cục máu đông gây tắc nghẽn 18 giờ sau đó
[27].
12
Năm 1995, nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh
học và JCR Pharmaceuticalscủa Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm hiệu quả của
Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch cảnh trên chuột. Một số chuột
được tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho não. Ba
enzym là Nattokinase, plasmin và elastase được dùng để thử nghiệm trên chuột.
Elastase cho thấy không mở lại các động mạch bị chặn. Nhóm ăn Plasmin cho thấy
lưu thông phục hồi 16% sau một giờ. Còn nhóm ăn Nattokinase cho thấy phục hồi
62% lưu thông trong cùng khoảng thời gian. Kết quả này giúp nhà nghiên cứu kết

luận rằng "các kết quả cho thấy các khả năng tiêu fibrin của Nattokinase là mạnh
hơn so với plasmin hoặc elastase trong cơ thể”.[28]
Các nhà nghiên cứu từ JCR Pharmaceuticals, Oklahoma State University và
Miyazaki Medical College tiến hành một nghiên cứu sâu hơn nữa trong đó có 12
tình nguyện viên được cho uống 200 mg Nattokinase và sau đó theo dõi khả năng
tiêu Fibrin của họ thông qua một loạt các xét nghiệm huyết tương. Các đối tượng
tham gia thí nghiệm cho thấy khả năng phân hủy cục máu đông cao trong 2-8 giờ.
Năm 2003, Cesarin và cộng sự đã làm thí nghiệm với Nattokinase và giả
dược đã được trao cho 184 tình nguyện viên trước khi lên một chuyến bay 7-8 giờ.
7 trong số 92 người trong nhóm dùng giả dược cho thấy cục máu đông hình thành.
Không ai trong số 92 người trong nhóm Nattokinase hình thành cục máu đông.
- Hoạt động huyết áp
Năm 1995, các nhà nghiên cứu từ Trường y khoa Miyazaki Kurashiki và
Đại học Khoa học và Nghệ thuật tại Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của
Nattokinase với huyết áp ở cả động vật và con người. Trong các thử nghiệm chuột
được cho uống một liều duy nhất 400-450 gam Nattokinase. Tính trung bình huyết
áp tâm thu (SBP) của chuột giảm 12,7% trong hai giờ.
Nhóm người tình nguyện tham gia có huyết áp cao được uống 30 gam
lyophilized trích xuất (tương đương 100 g natto). Trung bình huyết áp tâm thu SBP
giảm 10,9% và huyết áp tâm trương (DBP) giảm 9,7%. [29]
13
2.1.2.3. Cấu trúc của Nattokinase
Kí hiệu: EC = 3.4.21.62 [1]
Trong đó:
+ 3 (loại): Hydroxylase
+ 4 (nhóm): Protease
+ 21(dưới nhóm): protease serin
+ 62(enzyme): subtilisin
Nattokinase có cấu trúc protein tạo thành từ 1 chuỗi polypeptid duy
nhất bao gồm 275 gốc acid amin, có trọng lượng phân tử .

MW= 27728 Da, pI= 8,6+0,3, có tính chất tương đồng cao với cơ chất và
không có cầu disulfide.
Nattokinase thuộc họ subtilisin của protease serin, cũng có trung tâm hoạt
động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm
carboxyl của Asp-32.[1]
2.1.2.4. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase
Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua 3 con
đường khác nhau [32]:
Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin
từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp,
hòa tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa pro-
urokinase thành urokinase. Kết quả là thúc đẩy quá trình biến đổi plasminog
en thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh.
Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp
t- PA trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
14
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành
fibrin từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của
cơ thể. Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc
chống đông máu bình thường.
2.1.2.5. Tính an toàn của Nattokinase
Những thành quả của TS Sumi Hiroyuki cũng đã được hai vị chuyên gia ở
hai khu vực khác nhau phối hợp nghiên cứu, đó là bác sĩ Martin Milner ở Trung
tâm Y khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa Kỳ) và TS Kouhei Makise thuộc
bệnh viện Makise ở Kyoto, cùng công bố kết quả qua bài viết trên tạp chí chuyên
môn kết luận rằng “là chuyên gia lâu năm về tim mạch và hô hấp chúng tôi nhất trí
khẳng định rằng Nattokinase là một phát hiện đầy phấn chấn trong việc ngăn ngừa
và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, và “chúng tôi xác định
Nattokinase là một hoạt chất thiên nhiên có thể làm tan các huyết khối hữu hiệu,

không gây dị ứng và có độ an toàn cao” hơn cả tỏi , nhân sâm Triều Tiên hay
bromelain (từ quả Dứa) thiên nhiên thúc đẩy sản sinh ra plasmin trong quá trình
thủy phân sợi fibrin.
2.1.2.6 Các nguồn vi sinh vật tổng hợp Nattokinase
Vi sinh vật là nguồn sản xuất quan trọng để tạo ra các hợp chất có khả năng
phân hủy máu đông. Streptokinase từ Streptococus hemolyticus và Satphylokinase
từ Streptococus aureus đã sớm chứng minh được có hiệu quả trong liệu pháp tan
huyết khối. Nhiều năm qua, có thêm nhiều enzyme từ các loài vi sinh vật khác nhau
đã được khám phá như nattokinase từ Bacillus natto, Subtilisin DFE và Subtilisin
DJ-4 từ Bacillus myloliquefaciens.Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme thủy phân
fibrin bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và tảo.
15
Bảng 2.1: Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme fibrinase [14][15]
Nguồn vi sinh vật

Tài liệu tham khảo

-
Trực khuẩn

+ B. Subtilis BK.17

+ B. Subtilis A1

+ B. Subtilis 168

-
Actinomyces
thermovulgaris

-
Streptomyces

+ S. megaspores SD5

+ S. spheroids M8-2

+ Streptomyces sp. Y405

-
Nấm

+ Aspergillus ochraceus 513

+ Cochliobolus lunatus

+ Fusarium oxysporum

+ Fusariumpallidoroseum

+ Penicillin chrysogenum H9

+ Pleurotus ostreatus

+ Rhizopus chinensis 12

-
Tảo

+ C. intricatum

+ C. latum

+ C. divaricatum


Jeong et al. 2001

Jeong et al. 2004

Kho et al. 2005

Egorov et al.1976


Chitte and Dey 2000, 2002

Egorov et al.1985

Wang et al. 1999


Batomunkueva and Egorov
2001

Abdel-Fattah and Ismail 1984

Tao et al. 1997, 1998

El-Aassar 1995

El-Aassar et al. 1990

Choi and Shin 1998

Xiao-Lan et al. 2005


Matsubara et al. 1998

Matsubara et al. 1999

Matsubara et al. 2000

Streptomycesmegaspores SD5 được phân lập từ suối nước nóng có khả năng
tạo ra enzyme phân hủy fibrin chịu nhiệt . Một số loại nấm cũng có thể tạo ra
protease có hoạt tính thủy phân fibrin cao như Aspergillus ochraceus 513,
16
Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum H9,… Trong đó các chủng thuộc
chi Bacillus là nguồn vi sinh vật quan trọng để sản xuất enzyme thủy phân fibrin.
Vào năm 1987, Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp Nattokinase lần đầu tiên
được khảo sát từ thực phẩm lên men đậu tương truyền thống của Nhật là natto .
2.2. Boza
Hình 2.3. Hình ảnh sản phẩm Boza
Boza là một loại đồ uống lên men rất phổ biến ở các nước Đông Âu như
Bulgaria, Rumania, Albania và Thổ Nhĩ Kỳ. Nó là một sản phẩm làm từ lúa mì
hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp (thường là khoảng 0,5%), và có một
hương vị ngọt hơi chua. Nó chứa carbohydrate và nhiều vitamine.Boza được sản
xuất tại khu vực Balkan và hầu hết các khu vực gốc Thổ Nhĩ Kỳ, nó được sản xuất
từ kê và nhiều loại ngũ cốc khác. Các hương vị khác nhau tùy theo từng loại ngũ

cốc được sử dụng. Trong một nghiên cứu khoa học của Boza được thực hiện bởi
Viện Khoa học và Công nghệ Thổ Nhĩ Kỳ cho Vefa Bozacisi, boza đã được chứng
minh là một thức uống lành mạnh và bổ dưỡng. Một lít Boza chứa một kilo calo,
bốn loại vitamin A và B, và vitamin E. Trong quá trình lên men acid lactic hình
thành và điều này tạo điều kiện tốt cho tiêu hóa.
17
Hệ vi sinh trong Boza: Trong Boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm
men. Có khoảng 45 vi khuẩn lactic trong Boza có tính kháng khuẩn mạnh như
Lactobacillus brevis subsp. lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium,
Lactobacillus graminis, Pediococcus sp. và Lactobacillus paracasei
subsp.paracasei; Bacillus subtilis [18]; Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus
pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus [30].
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của enzym
Nattokinase đối với các bệnh về tim mạch, đột quỵ não.
Theo thông tin đăng trên tạp chí Y dược lâm sàng 108 tập 3 – tháng 11/2008
(bệnh viện TƯ Quân đội 108) về nghiên cứu “ Đánh giá hiệu quả điều trị của sản
phẩm Nattospes trên bệnh nhân đột quỵ thiếu máu não” (thành phần chính của
Nattospes là Nattokinase) do GS.TS Nguyễn Văn Thông - Chủ nhiệm Khoa Thần
kinh, Bệnh viện TƯ Quân đội 108 cùng các cộng sự thực hiện trên 64 bệnh nhân
đột quỵ thiếu máu não được chia thành 2 nhóm, điều trị trong 3 tháng: nhóm I gồm
30 bệnh nhân điều trị theo phác đồ thông thường (dùng thuốc aspirin 300mg/24
giờ); nhóm II có 34 bệnh nhân dùng Nattospes với liều dùng 2 viên/ ngày. Kết quả
cho thấy: Nhóm dùng Nattospes có tác dụng cải thiện hoạt động chức năng (vận
động và nhận thức), tái hòa nhập xã hội tương đương với nhóm dùng aspirin. Sản
phẩm giúp phòng ngừa tái phát đột quỵ não và không gây tác dụng phụ. Bên cạnh
nghiên cứu tại bệnh viện TƯ Quân đội 108, Nattospes cũng được khẳng định qua
nhiều nghiên cứu tại bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Quân y 103, và đều cho hiệu

quả tốt đối với bệnh nhân đột quỵ não. Rất nhiều thuốc chóng bệnh tim mạch và
đột quỵ não hiện nay có thành phàn chính là enzyme Nattokinase.
18
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Việc nghiên cứu enzyme Nattokinase ở nước ngoài rất được chú trọng được
nghiên cứu từ rất sớm và ngày càng được quan tâm vì những lợi ích mà nó mang lại.
Trong suốt những năm 1990, các nhà nghiên cứu báo cáo kết quả về các phương
pháp khác nhau để của tách và tinh chế Nattokinase và các tài liệu công bố về hoạt tính
tiêu sợi huyết của Nattokinase trong In-vitro. Năm 1990, Sumi và công sự, báo cáo hiệu
quả của viên nang Nattokinase trong thử nghiệm phân giải huyết khối ở chó [25]. Đã có ít
nhất ba nghiên cứu chứng minh hoạt tính của Nattokinase ở chuột [11][12][13].
Một trong những thử nghiệm hấp dẫn trên người tiến hành với 12 tình
nguyện viên khỏe mạnh người Nhật Bản [26]. Mỗi người tham gia sử dụng 200 g
Natto một lần mỗi ngày trước bữa ăn sáng, tiếp theo là kiểm tra định kỳ plasma
trong máu. Sau một khoảng thời gian 2 tuần, mỗi người lại ăn 200 g đậu nành luộc
vào trước bữa ăn sáng. Và lại kiểm tra định kỳ plasma trong máu. Chỉ có một biến
đổi nhỏ trong kết quả của nhóm kiểm chứng là những người ăn đậu nành luộc.
Ngược lại, nhóm ăn natto cho thấy thời gian thủy phân fibrin (euglobulin lysis
time-ELT) giảm đáng kể và hoạt độ cao enzyme tiêu sợi huyết tăng sau khi sử dụng
natto. Sự cải thiện hoạt tính của plasma tiêu sợi huyết được duy trì với giá trị p
<0.005 từ 2 đến 8 giờ sau khi sử dụng.
Đối với các thử nghiệm tương tự,sử dụng hai viên nang chứa 650 mg
Nattokinase , ba lần mỗi ngày trong 8 ngày liên tiếp . Máu được lấy mỗi buổi sáng
và các thông số tiêu sợi huyết được đo trong huyết thanh và plasma của các đối
tượng. Hoạt tính tiêu sợi huyết euglobin trong các đối tượng này tăng dần từ đầu
đến ngày thứ tám. Sản phẩm fibrin thủy phân của các đối tượng vào ngày đầu tiên
sử dụng cao hơn đáng kể so với mức trước khi dùng .
Trong một thử nghiệm khác trên người, Okamoto và cộng sự đã báo cáo sự
hiện diện của chất chống huyết áp cao của natto [21].Nhận định này được lặp lại
thành công bởi Murayama và Sumi (1998) [19]. Trong nghiên cứu này nhỏ, Natto

đông khô được chiết bằng ethanol 80% rồi cho 5 tình nguyện viên sử dụng. Có 4
trong 5 đối tượng, huyết áp tâm thu trung bình giảm từ 173,8 ± 20,5 mm Hg thành