Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân tích sinh hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH



TRƢƠNG MINH VŨ




NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN
TRONG MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SINH HÓA





LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC




Nghệ An, 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

TRƢƠNG MINH VŨ



NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN
TRONG MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SINH HÓA


Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Trần Đình Thắng


Nghệ An, 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định nồng độ cồn
trong máu bằng phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân
tích sinh hóa”. Tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của
Ban lãnh đạo Cơ quan tôi đang công tác; Thầy cô là giảng viên của Khoa Hóa
học trường Đại học Vinh, người đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt cho tôi
nhiều kiến thức chuyên sâu về hóa học; Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và
cảm ơn về sự giúp đỡ đó.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Đình Thắng,

giảng viên đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nơi tôi đang công tác
và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện hoàn thành luận văn này.


MỤC LỤC
Lời cảm ơn Trang
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục hình vẽ, đồ thị, phổ đồ, phiếu xét nghiệm
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu về cồn (ethanol) 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện 3
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4
1.1.2.1. Cấu tạo: 4
1.1.2.2. Tính chất vật lý: 4
1.1.2.3. Tính chất hóa học: 4
1.2. Giới thiệu về máu 6
1.2.1. Sơ lược về máu 6
1.2.2. Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu 6
1.3. Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ethanol trong máu 7
1.3.1. Phương pháp xét nghiệm sinh hóa: 7
1.3.1.1. Nguyên lý: 7
1.3.1.2. Thu mẫu: 7
1.3.1.3. Tiến hành xét nghiệm: 7
1.3.1.4. Xuất kết quả: 7
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí 8

1.3.2.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị: 8
1.3.2.2. Xử lý mẫu: 8
1.3.2.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí: 8
1.3.2.4. Kết quả: 9
1.3.3. Phương pháp sắc ký khí với hệ thống Headspace: 9
1.3.3.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị: 9
1.3.3.2. Xử lý mẫu: 9
1.3.3.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí: 10
1.3.3.4. Kết quả: 10
1.4. Giới thiệu về Sắc ký khí 11
1.4.1. Đại cương về sắc ký: 11
1.4.2. Các đại lượng cơ bản trong phương pháp sắc ký: 12
1.4.2.1. Hệ số phân bố: 12
1.4.2.2. Thời gian lưu (t
R
): 12
1.4.2.3. Hệ số dung lượng: 13
1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết của cột: 14
1.4.2.5. Độ chọn lọc: 14
1.4.2.6. Độ phân giải: 15
1.4.3. Các bộ phận chính của máy sắc ký khí: 15
1.4.3.1. Khí mang: 16
1.4.3.2. Buồng tiêm: 16
1.4.3.3. Cột tách Sắc ký khí: 17
1.4.3.4. Pha tĩnh trong sắc ký khí: 19
1.4.3.5. Đầu dò (detector): 20
1.5. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng 21
1.5.1. Phương pháp định tính: 21
1.5.2. Phương pháp định lượng: 21
1.5.2.1. Phương pháp ngoại chuẩn: 21

1.5.2.2. Phương pháp nội chuẩn: 21
1.6. Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn và Phƣơng pháp một điểm
chuẩn 22
1.6.1. Phương pháp xây dựng đường chuẩn: 22
1.6.1.1. Khoảng tuyến tính và cách xác định: 22
1.6.1.2. Các phương pháp xây dựng đường chuẩn: 23
1.6.1.3. Các lưu ý: 25
1.6.2. Phương pháp một điểm chuẩn: 27
1.7. Phƣơng pháp khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lƣợng (LOQ) 27
1.7.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 27
1.7.1.1. Định nghĩa: 27
1.7.1.2. Cách xác định: 27
1.7.2. Giới hạn định lượng: 28
1.7.2.1. Định nghĩa: 28
1.7.2.2. Cách xác định: 29
1.8. Phƣơng pháp khảo sát độ lập lại 29
1.9. Phƣơng pháp khảo sát hiệu suất thu hồi 30
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 32
2.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32
2.1.1. Dụng cụ: 32
2.1.2. Thiết bị: 32
2.2. Hóa chất 32
2.3. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu, khảo sát bằng máy sắc ký khí 33
2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu: 33
2.3.1.1. Dung dịch natri tungstat: 120g/l: 33
2.3.1.2. Dung dịch axit sulfuric 5%: 33
2.3.1.3. Dung dịch propanol 0,25g/l: 33
2.3.1.4. Các dung dịch ethanol: 33
2.3.1.5. Dung dịch máu có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu 33

2.3.2. Chuẩn bị mẫu: 34
2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử: 34
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn: 34
2.3.2.3. Chuẩn bị mẫu chuẩn: 34
2.3.2.4. Chuẩn bị mẫu trắng: 35
2.3.3. Thiết bị, điều kiện phân tích và trình tự tiêm mẫu 35
2.3.3.1. Thiết bị phân tích: 35
2.3.3.2. Điều kiện phân tích: 35
2.3.3.3. Trình tự tiêm mẫu: 36
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Khảo sát các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn 37
3.1.1. Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1): 37
3.1.2. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng (PP 2): 38
3.1.3. Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết, không xử lý
chuẩn mẫu (PP 3): 39
3.1.4. So sánh kết quả các phương pháp xây dựng đường chuẩn 40
3.2. Khảo sát phƣơng pháp một điểm chuẩn 41
3.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi 42
3.4. Khảo sát độ lặp lại 43
3.4.1. Độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị: 43
3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp: 43
3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng 44
3.5.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD): 44
3.5.2. Tính giới hạn định lượng (LOQ): 46
3.6. So sánh kết quả thực nghiệm bằng Phƣơng pháp sắc ký khí và
Phƣơng pháp xét nghiệm (phân tích) sinh hóa 46
3.7. Khảo sát một số phƣơng pháp bảo quản mẫu ảnh hƣởng đến
nồng độ cồn trong máu theo thời gian bằng Phƣơng pháp sắc ký khí 48
KẾT LUẬN 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 54-87
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
- ĐC : Đường chuẩn
- C : Nồng độ
- C
PP
: Nồng độ theo phương pháp
- FID : Đầu dò ion hóa ngọn lửa
- GC : Sắc ký khí
- H : Hiệu suất thu hồi
- LOD : Giới hạn phát hiện
- LOQ : Giới hạn định lượng
- MS : Đầu dò khối phổ
- PP : Phương pháp
- RSD : Độ lệch chuẩn tương đối
- SD : Độ lệch chuẩn
- S/N : Tỷ lệ chiều cao tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu đường nền
- S
c
/S
nc
: Tỷ lệ diện tích chất chuẩn chia cho nội chuẩn
- S
m
/S
nc
: Tỷ lệ diện tích chất phân tích chia cho nội chuẩn
-

,


: Ký hiệu tăng hay giảm.

DANH MỤC CÁC BẢNG
- Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S
c
/S
nc
) các
điểm chuẩn theo PP 1
- Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S
c
/S
nc
) các
điểm chuẩn theo PP 2
- Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (S
c
/S
nc
) các
điểm chuẩn theo PP 3
- Bảng 3.4: Tỉ lệ diện tích peak và nồng độ của các mẫu M
1
và M
2
tính theo 3
phương pháp xây dựng đường chuẩn
- Bảng 3.5: Kết quả nồng độ trung bình mẫu M
2-TB

và độ sai lệch giữa phương
pháp đường chuẩn (PP 1) và phương pháp một điểm chuẩn
- Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi (H%)
- Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của thiết bị
- Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
- Bảng 3.9: Xác định chiều cao của nhiễu đường nền (N) ở nồng độ
4mg/100ml
- Bảng 3.10: Xác định độ lặp lại của chiều cao mẫu chuẩn (S) ở nồng độ
4mg/100ml
- Bảng 3.11: Kết quả phương pháp GC và phương pháp xét nghiệm sinh hóa
- Bảng 3.12: Kết quả các phương pháp bảo quản mẫu ảnh hưởng đến nồng
độ.

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, PHỔ ĐỒ, PHIẾU XÉT NGHIỆM
- Hình 1.1: Thời gian lưu (t
R
) của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ
- Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết
- Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
- Hình 1.4: Mô tả khoảng tuyến tính và khoảng làm việc
- Hình 1.5: Mô tả cách xác định LOD bằng cách tính S/N
- Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính
- Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1
- Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP 2
- Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3
- Hình 3.4: Đồ thị nồng độ cồn trong máu mẫu M
9
giảm dần theo thời gian và
phương pháp bảo quản
- Phổ đồ 1-93: Các phổ đồ sắc ký khí ở phần phu lục

- Phiếu xét nghiệm 1-6: Các phiếu xét nghiệm sinh hóa ở hai bệnh viện.

1
MỞ ĐẦU
Thời gian qua, tình hình tai nạn giao thông xảy ra nhiều và diễn biến rất
phức tạp, làm chết và bị thương nhiều người, gây tổn thất kinh tế, tạo gánh
nặng cho gia đình và xã hội, Tai nạn giao thông xảy ra do nhiều nguyên
nhân, trong đó “Người điều khiển phương tiện giao thông sau khi uống rượu,
bia không làm chủ được phương tiện” là nguyên nhân chính dẫn đến tai nạn
giao thông.
Theo Ủy ban An toàn giao thông Quốc gia, năm 2013 cả nước đã xảy
ra 29.385 vụ tai nạn giao thông, làm chết 9.369 người, bị thương 29.500
người [9].
Theo Quyết định số: 933/QĐ-BYT ngày 23/3/2010 của Bộ Y tế ban
hành “Quy định về đo nồng độ cồn trong máu áp dựng trong các Bệnh viện
bằng máy xét nghiệm sinh hóa đối với người tham gia giao thông” [1].
Năm 2012, Chủ tịch Ủy ban An toàn giao thông Quốc gia đã chỉ đạo
Bộ Công an và Bộ Y tế xây dụng “Thông tư liên tịch quy định về xét nghiệm
nồng độ cồn trong máu của người điều khiển phương tiện giao thông cơ giới
đường bộ”.
Qua nghiên cứu một số tài liệu, tạp chí, quy trình về định lượng nồng
độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối
phổ (GC/MS) [2], [10], [11], [12], [13], [14], [15].
Vì các lý do trên, để có điều kiện nghiên cứu, khảo sát và so sánh các
phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu và được sự đồng ý của giáo
viên hướng dẫn, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xác định nồng độ cồn
trong máu bằng Phương pháp sắc ký khí và so sánh với Phương pháp phân
tích sinh hóa” áp dụng cho mẫu máu thu trên người sống và đã chết.
Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên
cứu và khảo sát một số nội dung sau:

2
- Nghiên cứu một số phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu.
- Nghiên cứu, khảo sát phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu
bằng sắc ký khí (GC-FID), cụ thể là:
+ Khảo sát một số phương pháp xây dựng đường chuẩn và so sánh
với phương pháp một điểm chuẩn.
+ Khảo sát giới hạn phát hiệnvà giới hạn định lượng.
+ Khảo sát độ ổn định của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp.
+ Khảo sát hiệu suất thu hồi.
- So sánh kết quả xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp
sắc ký khí với phương pháp phân tích sinh hóa.
- Khảo sát một số phương pháp bảo quản mẫu (không bảo quản, bảo
quản lạnh và bảo quản đông đá) và thời gian bảo quản mẫu ảnh hưởng đến
nồng độ cồn trong máu, từ đó rút ra phương pháp bảo quản mẫu hợp lý nhất.

3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cồn (ethanol)
1.1.1. Lịch sử phát hiện
- Ethanol còn được gọi là rượu etylic, rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp
chất hữu cơ, là một rượu thông thường có trong thành phần của các đồ uống
chứa cồn, trong dân gian nó được gọi đơn giản là rượu.
- Ethanol đã được con người sử dụng từ thời tiền sử như là thành phần
không độc hại trong đồ uống có cồn. Lượng cặn khô được tìm thấy trong các
đồ gốm cổ 9000 năm tuổi ở miền bắc Trung Quốc cho thấy đồ uống có cồn
thậm chí đã được sử dụng từ thời kỳ đồ đá mới.
- Ethanol tương đối tinh khiết lần đầu tiên được chiết tách thành công
bởi các nhà giả kim thuật Ba Tư, những người đã phát triển nghệ thuật chưng
cất dưới triều đại kha-lip Abbasid, đáng chú ý nhất trong số đó là Al-Razi.
Các bài viết của Jabir Ibn Hayyan (Geber) (721-815) đề cập đến hơi dễ cháy
của rượu khi đun sôi. Al-Kindi (801-873) mô tả cụ thể quá trình chưng cất
rượu, hiệu suất sản phẩm chưng cất ethanol từ hỗn hợp ethanol-nước
đạt 95,6% do ethanol tạo hỗn hợp đẳng khí với nước. Ethanol tuyệt đối thu
được lần đầu tiên vào năm 1796, do Johann Tobias Lowitz thực hiện bằng
cách lọc ethanol đã chưng cất qua than củi.
- Antoine Lavoisier đã mô tả ethanol như là một hợp chất của carbon,
hydro và oxy. Năm 1808 Nicolas-Théodore de Saussure đã xác định công
thức hóa học của ethanol. Đến năm 1858, Archibald Scott Couper đã công bố
công thức cấu trúc của ethanol, đây là một trong những hợp chất hóa học đầu
tiên có cấu trúc được xác định.
- Đa số ethanol thực phẩm được chiết xuất từ trái cây và ngũ cốc, còn
ethanol nhân tạo được tổng hợp bằng phương pháp hydrat hóa ethylene sử

4
dụng xúc tác axit, đây là một quy trình tương tự với phương pháp tổng hợp

ethanol công nghiệp hiện nay.
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học
1.1.2.1. Cấu tạo:
Ethanol thường được viết tắt là EtOH, là một ancol mạch thẳng, công
thức hóa học của nó là C
2
H
6
O hay C
2
H
5
OH hay CH
3
-CH
2
-OH. Nhóm metyl
(CH
3
-) liên kết với carbon ở nhóm metylen (-CH
2
-), nhóm này lại liên kết với
oxy của nhóm hydroxyl (-OH), nó là đồng phân hoá học của dimetyl ete.
1.1.2.2. Tính chất vật lý:
Ethanol là một chất lỏng, không màu, trong suốt, có mùi thơm dễ chịu
và đặc trưng, vị cay, nhẹ và dễ bay hơi hơn nước, tan vô hạn trong nước, tan
trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa
có màu xanh da trời.
Sở dĩ ethanol tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so
với este hay aldehyde (2 chất có khối lượng phân tửgần nhau) là do sự tạo

thành liên kết hydro giữa các phân tử rượu với nhau và với nước.
- Khối lượng phân tử: 46,06 g/mol.
- Khối lượng riêng: d = 0,793 g/ml (ở 20
0
C).
- Nhiệt độ sôi: t
s
= 78,39
0
C.
- Nhiệt độ nóng chảy: t
nc
= - 114,15
0
C.
1.1.2.3. Tính chất hóa học:
a)Ethanol có một số tính chất chungcủa một rượu đơn chức:
- Phản ứng thế với kim loại kiềm, kiềm thổ.
2C
2
H
5
OH + 2Na  2C
2
H
5
ONa + H
2

- Phản ứng este hóa, phản ứng giữa rượu và acid với môi trường là acid

sulfuric đặc nóng tạo ra este.
C
2
H
5
OH + CH
3
COOH  CH
3
COOC
2
H
5
+ H
2
O

5
- Phản ứng loại nước, tách nước trong một phân tử để tạo thành olefin,
trong môi trường acid sulfuric đặc ở 170
0
C.
C
2
H
5
OH  C
2
H
4

+ H
2
O
Hay tách nước giữa 2 phân tử rượu tạo thành ether.
C
2
H
5
OH + C
2
H
5
OH  C
2
H
5
-O-C
2
H
5
+ H
2
O
- Phản ứng oxi hóa, trong đó rượu bị oxi hóa theo 3 mức: Oxi hóa
không hoàn toàn thành aldehyde, acid hữu cơ và oxi hóa hoàn toàn thành CO
2

và H
2
O.

+ Mức 1, trong môi trường nhiệt độ cao:
CH
3
-CH
2
-OH + CuO  CH
3
-CHO + Cu + H
2
O
+ Mức 2, có xúc tác:
CH
3
-CH
2
-OH + O
2
 CH
3
-COOH + H
2
O
+ Mức 3, oxi hóa hoàn toàn:
C
2
H
5
OH + 3O
2
 2CO

2
+ 3 H
2
O
b) Ethanol có một số tính chất riêng:
- Phản ứng tạo ra butadien-1,3: Cho hơi rượu đi qua chất xúc tác hỗn
hợp, ví dụ như: Cu + Al
2
O
3
ở 380-400 độ C, lúc đó xảy ra phản ứng tách loại
nước.
2C
2
H
5
OH  CH
2
=CH-CH=CH
2
+ 2H
2
O + H
2

- Phản ứng lên men giấm: Oxi hóa rượu etylic 10 độ bằng oxi không
khí có mặt men giấm ở nhiệt độ khoảng 25 độ C.
CH
3
-CH

2
-OH + O
2
 CH
3
-COOH + H
2
O






6
1.2. Giới thiệu về máu
1.2.1. Sơ lƣợc về máu [5]
* Máu chiếm khoảng 7 - 9% khối lượng cơ thể, một người trung bình
có 4 - 5 lít máu (khoảng 75 - 80ml/kg).
- Tỷ trọng toàn phần của máu là 1,050 - 1,060 g/ml.
- Tỷ trọng trung bình của huyết tương là: 1,028 g/ml.
* Máu có 2 thành phần chính là huyết cầu (chiếm khoảng 40%) và
huyết tương (chiếm khoảng 60%).
- Huyết cầu gồm: Hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu
+ Hồng cầu chiếm khoảng 96%, hồng cầu chứa hemoglobin và
có nhiệm vụ chính là vận chuyển và phân phối oxy.
+ Bạch cầu chiếm khoảng 3%, bạch cầu là một phần quan trọng
của hệ miễn dịch có nhiệm vụ tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm trùng và phát
động đáp ứng miễn dịch của cơ thể.
+ Tiểu cầu chiếm khoảng 1%, tiểu cầu chịu trách nhiệm trong

quá trình đông máu. Tiểu cầu tham gia rất sớm vào việc hình thành các nút
tiểu cầu, là bước khởi đầu của quá trình hình thành cục máu đông trong các
chấn thương mạch máu nhỏ.
- Huyết tương là dung dịch chứa đến 96% là nước, 4% là các protein
huyết tương và rất nhiều chất khác với lượng nhỏ: Các hormone; các protein
khác; các chất thải của cơ thể; các chất điện giải như: Natri, clo, canxi, kali,
phosphate…
1.2.2. Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu [7]
- Rượu sau khi đưa vào cơ thể sẽ được hấp thu chủ yếu ở tá tràng, ruột
non và niêm mạc dạ dày. Rượu được hấp thu sẽ theo đường tĩnh mạch đến
gan. Tại gan, trên 90% lượng rượu hấp thu sẽ được chuyển hóa. Phần còn lại
sẽ được thải ra ngoài qua phổi và thận.

7
- Các giai đoạn chuyển hóa của rượu: Ở gan rượu được chuyển hóa
thành acetaldehyde, sau đó acetaldehyde sẽ được oxy hóa thành acetate (các
giai đoạn chuyển hóa được thực hiện bởi các men).
- Acetaldehyde là một chất độc, năng lực chuyển hóa thành acetate chỉ
có giới hạn, nên ở những người lạm dụng rượu thì lượng acetaldehyde được
sản sinh với một mức quá lớn sẽ không được chuyển hóa hết và gắn vào màng
tế bào gây tổn thương tế bào gan thông qua các cơ chế gây độc, viêm và miễn
dịch, hậu quả là quá trình tạo xơ.
Mặt dù ethanol không phải là một chất độc có độc tính cao, nhưng khi
nồng độ cồn trong máu vượt quá 0,5% (tương đương 500mg/100ml máu) thì
nguy cơ dẫn đến tử vong rất cao.
1.3. Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ethanol trong máu
1.3.1. Phƣơng pháp xét nghiệm sinh hóa [1]
1.3.1.1. Nguyên lý:
Cơ chế phân tích của máy xét nghiệm sinh hóa là phương pháp đo
quang (so màu).

1.3.1.2.Thu mẫu:
- Thu khoảng 3ml máu ở tĩnh mạch.
- Cho vào ống nghiệm có nắp đậy kín.
1.3.1.3. Tiến hành xét nghiệm:
- Ly tâm mẫu máu chứa trong ống nghiệm có nắp đậy kín với tốc độ
1000 vòng/phút.
- Lấy dịch chiết trong (huyết tương) ở lớp trên.
- Tiến hành phân tích dịch chiết và dãy chất chuẩn trên máy xét nghiệm
sinh hóa.
- Máy sẽ tự động tính toán kết quả.
1.3.1.4.Xuất kết quả:

8
- Đơn vị: …….mg/l hoặc ……. mmol/l.
- Hệ số chuyển đổi:
mmol/L x 4,608 = …… mg/100ml.
hoặc mmol/l x 0,04608 = …… g/l.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký khí [11], [12]
1.3.2.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị:
- Chuẩn ethanol, nồng độ 50 mg/100ml.
- Nội chuẩn isobutanol, nồng độ: 50mg/100ml (isobutanol hay 2-
methyl-1-propanol, có công thức cấu tạo: (CH
3
)
2
-CH-CH
2
-OH; nhiệt độ sôi t
s

= 108
0
C; tỉ trọng d = 0,802g/ml).
- Lọc syringe (loại dùng cho sắc ký).
- Thiết bị: Sắc ký khí, đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC - FID).
1.3.2.2. Xử lý mẫu:
- Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm (ký hiệu mẫu chuẩn và mẫu thử), cho vào
mỗi ống 0,5ml dung dịch nội chuẩn isobutanol.
- Bước 2: Hút 0,5ml chuẩn ethanol cho vào ống nghiệm ký hiệu mẫu
chuẩn, lắc đều, ta được mẫu chuẩn.
- Bước 3: Hút 0,5ml mẫu máu cho vào ống nghiệm ký hiệu mẫu thử,
lắc đều, lọc qua syringe, ta được mẫu thử.
1.3.2.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí:
- Cột Carbowax 20M.
- Nhiệt độ Injection: 160
0
C.
- Nhiệt độ lò cột: 100
0
C hoặc 130
0
C.
- Khí mang nitơ.
+ Nitơ: 35ml/min.
+ Hydro: 28ml/min.
+ Oxi: 100ml/min.

9
1.3.2.4. Kết quả:
Hàm lượng ethanol trong máu được tính dựa vào tỉ lệ chiều cao của

peak ethanol/isobutanol bằng phương pháp tam xuất, theo phương trình (1.1).
X (mg ethanol/100ml máu)
=
C
s

h
x
*
R
s

(1.1)
h
s

R
x

Trong đó:
+ X: là nồng độ ethanol trong mẫu máu (mẫu thử).
+ C
s
: là nồng độ nội chuẩn isobutanol (50mg/100ml).
+ h
x
; R
x
: là chiều cao của peak ethanol trong mẫu máu và mẫu
chuẩn.

+ h
s
; R
s
: là chiều cao của peak isobutanol trong mẫu máu và mẫu
chuẩn.
1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký khí với hệ thống Headspace [2], [10],
[13], [14], [15]
1.3.3.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị:
- Chuẩn ethanol các hàm lượng: 0,02%; 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,3%;
0,4%.
- Nội chuẩn 3 - butanol hàm lượng: 0,05%.
- Dung dịch NaCl bão hòa.
- Máy sắc ký khí.
- Hệ thống Headspace.
1.3.3.2. Xử lý mẫu:
*Chuẩn bị mẫu chuẩn:
- Lấy 6 lọ thủy tinh dung tích 20ml, cho vào mỗi lọ 200µl dung dịch
chuẩn ethanol với các nồng độ nêu trên.
- Thêm vào mỗi lọ 200µl nước muối NaCl bảo hòa và 100µl nội chuẩn
3 - butanol.

10
*Chuẩn bị mẫu thử:
- Lấy lọ thủy tinh dung tích 20ml, cho vào 200µl máu.
- Thêm 200µl nước muối NaCl bão hòa và 100µl nội chuẩn 3-butanol.
* Các lọ thủy tinh trên được đậy nắp kín, chuyển vào khây tự động của
máy Headspace.
1.3.3.3. Tiến hành phân tích sắc ký khí:
* Điều kiện sắc ký:

- Cột HPB ALC 7mm x 0,320mm.
- Khí mang nitơ, tốc độ dòng 1,5ml/phút.
- Nhiệt độ đầu cột: 250
0
C.
- Detector FID, nhiệt độ: 270
0
C.
- Chương trình nhiệt độ: Bắt đầu 120
0
C giữ 1 phút, tăng nhiệt
5
0
C/phút đến 130
0
C giữ 8 phút.
* Điều kiện Headspace:
- Nhiệt độ nung: 60
0
C, lắc nhẹ.
- Thời gian nung 15 phút.
* Kết quả:
- So sánh thời gian lưu peak của mẫu với chất chuẩn.
- Lập đường chuẩn và tính hàm lượng ethanol trong máu dựa vào
đường chuẩn.
1.3.3.4. Kết quả:
Hàm lượng ethanol trong máu được tính bằng phần trăm (%).

11
1.4. Giới thiệu về sắc ký khí [3], [4]
1.4.1. Đại cƣơng về sắc ký:
* Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích được ứng dụng
rộng rãi nhất hiện nay, vì nó là phương pháp có độ nhạy cao và khả năng định
lượng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó
hoặc dễ bay hơi, chất phân cực hoặc kém phân cực, Phương pháp này do
nhà bác học Nga M.X.Txvet phát minh ra vào năm 1930.
* Nguyên tắc cơ bản của sắc ký: Dựa vào sự khác biệt về ái lực của các
cấu tử trong hỗn hợp chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh. Pha động
có thể là chất lỏng hoặc khí, có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển
trong cột sắc ký có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề
mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào
cột có tác dụng giữ chất ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự
tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này là khác nhau đối với
từng cấu tử. Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích đi qua bề mặt pha tĩnh
thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau, từ đó có thể định tính cũng như định lượng
chúng.
Nói cách khác, sắc ký là một phương pháp phân tích có nguyên lý dựa
trên hai quá trình hấp thụ (hấp phụ) và giải hấp liên tục giữa pha tĩnh và pha
động.
* Phân loại: Tùy theo bản chất của pha động mà chúng ta chia thành
hai loại sắc ký:
- Sắc ký lỏng: Có pha động là chất lỏng, pha động có thể là một loại
dung môi hay hỗn hợp nhiều loại dung môi. Các phương pháp sắc ký lỏng
thông dụng gồm: Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố và sắc ký ion.
- Sắc ký khí: Có pha động là khí trơ, không có lực tương tác hóa học

hay vật lý với chất cần phân tích. Trong phương pháp sắc ký khí, dựa vào đầu

12
dò (detector) có thể phân loại thành các kỹ thuật sau:
+ Sắc ký khí đầu dò dẫn nhiệt (GC-TCD).
+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID).
+ Sắc ký khí đầu dò bắt điện tử (GC- ECD).
+ Sắc ký khí đầu dò quang hoá ngọn lửa (GC- FPD).
+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá phát xạ (GC- TID hoặc GC- NPD).
+ Sắc ký khí ghép khối phổ (GC- MS).
1.4.2. Các đại lƣợng cơ bản trong phƣơng pháp sắc ký:
1.4.2.1. Hệ số phân bố:
- Cân bằng của cấu tử trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình
sau:
X
pha động


X
pha tĩnh

- Hằng số cân bằng cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ
số phân
bố (partition coefficient), được tính như sau:
K = C
S
/ C
M
Với C
S

: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh; C
M
: nồng độ cấu tử trong pha
động.
Hệ số k phụ thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
1.4.2.2. Thời gian lưu (t
R
):
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích khi được nạp vào cột sắc ký
thì chúng sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh trong một thời gian nhất định gọi là thời
gian lưu. Thời gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho
đến lúc chất tan được rửa giải hoàn toàn ra khỏi cột, tại thời điểm đó chất
phân tích có nồng độ cực đại.
Với t
R
: thời gian lưu của cấu tử chất phân tích (min); t
0
: thời gian để
cho chất hoàn toàn không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột hay là thời gian từ
khi pha động đi vào cột đến khi ra khỏi cột và còn gọi là thời gian chết (min);

13
t
R’
: thời gian lưu hiệu chỉnh (min).
Ta có: t
R’
= t
R
- t

0


Hình 1.1: Thời gian lưu (t
R
) của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ.
1.4.2.3. Hệ số dung lượng:
Được định nghĩa theo công thức sau:
K’ =
C
S

V
S
C
M
V
M

Với V
S
, C
S
: thể tích và nồng độ pha tĩnh; V
M
, C
M
: thể tích và nồng độ
pha động; K’ là đại lượng quan trọng nhất trong sắc ký và được đo bằng thực
nghiệm, có thể tính theo công thức:

K’ =
t
R
-

t
0

t
0


Nếu K’ ~0t
R
~ t
0
: Chất ra sớm nhất, cột không có khả năng giữ chất
lại. Suy ra:
+ K’ càng nhỏ thì mũi các chất ra nhanh và khả năng tách kém.
+ K’ càng lớn (t
R
càng lớn) chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân
tích càng dài thì mũi sắc ký có khả năng bị tù.
+ Khoảng K’ lý tưởng là từ 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức
tạp thì K’ có thể chấp nhận 1-20.

14
1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết của cột:
Số đĩa lý thuyết (N) của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của
các cấu tử trên cột.

Với W
b
: bề rộng đáy của mũi sắc ký; W
1/2
: bề rộng đáy của mũi sắc ký
ở phân nữa chiều cao.

Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng W
b
càng nhỏ thì mũi sắc ký càng
nhọn.
Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng
tách của cột càng cao.
1.4.2.5. Độ chọn lọc:
Độ chọn lọc α là đại lượng biễu diễn sự khác nhau của các mũi kề nhau
trong 1 hệ sắc ký đã chọn. Khi α càng khác 1 thì sự tách của hai chất càng rõ.
Độ chọn lọc α thay đổi theo sự thay đổi của thành phần pha động và
pha tĩnh.

15

1.4.2.6. Độ phân giải:
Độ phân giải (R
S
) được dùng để đánh giá khả năng tách hai mũi sắc ký
gầnnhau.

Với: t

R1
và t
R2
: thời gian lưu của cấu tử thứ nhất và thứ hai;
W
1
và W
2
: bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ nhất và thứ hai;
α: độ chọn lọc của cột sắc ký cho hai cấu tử 1 và 2.
Trường hợp R
S
= 1 thì hai mũi có độ lớn tương tự nhau sẽ được phân
tách khỏi nhau khoảng 95%.
Nếu R
S
= 1,5 thì sự phân giải được coi là hoàn toàn (99,7%).
1.4.3. Các bộ phận chính của máy sắc ký khí:

Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí.