Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng bacterial cellulose của vi khuẩn gluconacetobacter

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phương pháp nghiên cứu 3
6. Điểm mới của đề tài 3
NỘI DUNG 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter 4
1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter 5
1.3. Bacterial cellulose (BC) 5
1.3.1. Cấu trúc 5
1.3.2. Một số tính chất của màng BC 6
1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 6
1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter 8
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC 9
1.4.1. Nguồn cacbon 9
1.4.2. Nguồn nitơ 9
1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng 10
1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng 10
1.4.5. Điều kiện nuôi cấy 11
1.4.5.1. Độ pH 11
1.4.5.2. Nhiệt độ 11
1.4.5.3. Độ thông khí 11
1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy 11
1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) 12

1.5. Ứng dụng của màng BC 12

1.5.1. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 12
1.5.2. Ứng dụng trong y học 13
1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 13
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay 15
1.6.1. Trên thế giới 15
1.6.2. Tại Việt Nam 17
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 20
2.1.1. Giống 20
2.1.2. Thiết bị và hóa chất 20
2.1.2.1. Thiết bị 20
2.1.2.2. Hóa chất 20
2.1.3. Môi trường 21
2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1) 21
2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) 21
2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3) 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Phương pháp vi sinh 21
2.2.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng G. xylinus theo phương pháp truyền
thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) 21
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép 23
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch
nghiêng 23
2.2.2. Phương pháp hóa sinh 23
2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase 23
2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol thành axit
acetic 23
2.2.2.3. Xác định khả năng oxy hóa axit acetic 24

2.2.2.4. Xác định khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton 24
2.2.2.5. Xác định khả năng tổng hợp cellulose 24
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh
dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng
Gluconacetobacter 25
2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường 25
2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ 25
2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
khoáng 25
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 26
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial
cellulose trên một số nguồn nguyên liệu 27
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC 27
3.1.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu 28
3.1.1.2. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng
BC 28
3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC của một số chủng
Gluconacetobacter 31
3.1.3. Tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng 34
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng BC từ
chủng G. xylinus BHN
2
36
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo màng
BC từ chủng G. xylinus 36
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)

2
SO
4
tới khả năng lên men tạo
màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 38
3.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH
2
PO
4
tới khả năng lên men tạo màng
BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 40
3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O

tới khả năng lên men tạo
màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 42

3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ
chủng vi khuẩn G. xylinus 43
3.2.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men tạo màng
BC 45
3.2.7. Môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa cho chủng G.
xylinus BHN
2
lên men tạo màng BC 49
3.2.7.1. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng
Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo 50

3.2.7.2. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên
môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước
dừa 52
3.3. Khảo sát định hƣớng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 53
3.3.1. Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 53
3.3.2. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
1. Kết luận 58
2. Kiến nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60












DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter 4
Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter 7
Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 8
Hình 1.4. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong điều trị bỏng 19
Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter 27
Hình 3.2. Một số mẫu màng BC thu được sau khi làm giàu nguyên liệu 28
Hình 3.3. Vòng phân giải CaCO

3
29
Hình 3.4. Chuyển hóa ethanol thành axit acetic của vi khuẩn acetic 30
Hình 3.5. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter 31
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram 32
Hình 3.7. Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trênbề mặt môi
trường dịch thể 33
Hình 3.8. Khả năng tạo cellulose của các chủng G. xylinus 33
Hình 3.9. Hoạt tính catalase 34
Hình 3.10. Màng BC sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter 35
Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khối lượng tươi màng BC 37
Hình 3.12. Ảnh hưởng hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
đến độ dày màng BC 39
Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O tới độ dày màng BC 43
Hình 3.14.A. Quá trình lên men tĩnh 47
Hình 3.14.B. Thu màng sau 5 ngày lên men 47
Hình 3.15. Màng BC thu được sau 5 ngày lên men 48
Hình 3.16. Lên men tạo màng trên môi trường nước gạo 50

Hình 3.17. Khối lượng màng BC thu được khi thay thế nước dừa bằng nước gạo 51
Hình 3.18. Màng BC tươi của môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay

thế nước dừa 52
Hình 3.19.A. Cà chua bọc bằng màng BC 56
Hình 3.19.B. Cà chua hỏng sau 7 ngày 56
Hình 3.20.A. Cà chua bọc túi nilông hỏng sau 12 ngày 56
Hình 3.20.B. Cà chua bọc hỏng màng BC hỏng sau 23 ngày 56
Hình 3.21.A. Roi hỏng sau 4 ngày 56
Hình 3.21.B. Roi hỏng sau 12 ngày 56
Hình 3.22.A. Bảo quản dưa chuột 57
Hình 3.22.B. Dưa chuột hỏng sau 5 ngày 57
Hình 3.23.A. Cam hỏng sau 12 ngày 57
Hình 3.23.B. Cà rốt hỏng sau 5 ngày 57

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC 9
Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau 14
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC 34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC 36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
đến khối lượng tươi của màng
BC 38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH
2
PO
4
đến khối lượng tươi của màng BC.40
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO

4
.7H
2
O đến khối lượng tươi của màng
BC 42
Bảng 3.6. Khối lượng tươi của màng BC qua thời gian nuôi cấy 44
Bảng 3.7. Thành phần hóa học của nước dừa già 45

Bảng 3.8. Thành phần vitamin có trong nước dừa 46
Bảng 3.9. Thành phần axit amin của nước dừa 46
Bảng 3.10. Khối lượng tươi màng BC 47
Bảng 3.11. Thành phần dinh dưỡng có trong cám gạo 50
Bảng 3.12. Khối lượng màng BC tươi khi lên men ở môi trường dinh dưỡng nước
gạo thay thế nước dừa 51
Bảng 3.13. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi
trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa 52
Bảng 3.14. So sánh bảo quản cà chua bằng màng BC với túi ni lông thông thường
và không bảo quản 53
Bảng 3.15. So sánh bảo quản một số loại quả bằng màng BC, túi ni lông và không
bảo quản 55

Biểu đồ 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng glucose và khối lượng màng BC 37
Biểu đồ 3.2. Mối tương quan giữa hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
và khối lượng màng BC 39
Biểu đồ 3.3. Mối tương quan giữa hàm lượng KH

2
PO
4
và khối lượng màng BC 41
Biểu đồ 3.4. Mối tương quan giữa hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O

và khối lượng màng
BC 42
Biểu đồ 3.5. Khối lượng màng BC qua các thời gian nuôi cấy 44
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới khối lượng màng BC 48



1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong quá trình phát triển của lịch sử nhân loại, con người không
ngừng tìm kiếm, nghiên cứu những nguồn nguyên liệu mới. Ngày nay, nhờ có
sự phát triển mạnh mẽ như vũ bão của khoa học công nghệ mà việc nghiên
cứu, tìm kiếm trở nên dễ dàng hơn. Các nhà khoa học đã phát hiện ra rất
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng chúng trong thực tiễn cuộc
sống. Một trong những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây
đó là cellulose vi khuẩn hay Bacterial cellulose (BC).
BC được cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch
thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn

Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [17]. Khi nuôi cấy trên môi trường
dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, G. xylinus sẽ hình thành một lớp
màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn.
Màng BC do G. xylinus tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với
cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ
học và khả năng thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao,
khả năng polymer lớn. Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu
mới có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng
dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo [8].
Trên thế giới việc nghiên cứu G. xylinus và quá trình sinh tổng hợp BC
cũng như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên là
của Brown A.J và cộng sự năm (1886) [18]. Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho
đến nay G. xylinus và màng BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều
nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, nghiên cứu về G. xylinus, màng BC
2

và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần
đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên
cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng dụng trong sản
xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng
[20].
Nhằm bổ sung những hiểu biết về G. xylinus và quá trình tạo màng BC
định hướng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC sau này, tôi lựa chọn
đề tài: “Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo
màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khu hệ vi khuẩn Gluconacetobacter từ một số nguồn
nguyên liệu ở Việt Nam, nhằm bổ sung vào bộ sưu tập các chủng vi khuẩn có

khả năng sinh màng BC. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng,
sự đa dạng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial
cellulose trên một số nguồn nguyên liệu
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng
BC của vi khuẩn G. xylinus BHN
2

3.3. Khảo sát định hướng ứng dụng cho sản phẩm màng BC
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
4.2. Phạm vi nghiên cứu: khả năng lên men tạo màng của các chủng
Gluconacetobacter, ứng dụng trong thực tiễn
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp vi sinh
3

5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng
khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter
5.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC
5.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Điểm mới của đề tài
Đề tài tập trung thực hiện từ nuôi cấy, tuyển chọn, tìm môi trường dinh
dưỡng nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn G. xylinus BHN
2,
đồng thời
định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu.

4

NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì
Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi:
Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và
Kozakia [20]. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn
tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể
chuyển hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ.
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm,
nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều
kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Trên môi
trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, Gluconacetobacter dễ
dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào có thể phình to hoặc

kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh). Tế bào thường được tìm thấy nhiều
trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất…[17].

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước nhỏ (đường kính
khuẩn lạc đạt 1 - 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc
5

lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc
nhẵn.
1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35
0
C, pH = 4 –
6. Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường
bổ sung thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn
lạ [8].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của Gluconacetobacter bao
gồm: oxy hóa ethanol thành axit acetic, CO
2
, H
2
O; phản ứng catalase dương
tính; không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; chuyển hóa glucose thành
axit; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton; không sinh sắc tố nâu; tổng
hợp cellulose [3].
1.3. Bacterial cellulose (BC)
1.3.1. Cấu trúc
BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC –
plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4

glucopynanose. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật,
nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [17].
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô ( microfibril) ( Jonas and Farah, 1998) [29], những sợi
này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka
et.al 2000) [40]. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 - 9nm. Những dải
ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào
khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng
lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
6

1.3.2. Một số tính chất của màng BC
Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là
hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước
nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [18].
Một số tính chất của màng BC:
Độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng
lượng thấp, ổn định về kích thước.
Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%),
có tính xốp, độ ẩm cao.
1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn
dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B
1
, B

2
, B
12
… và các
chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của
mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một
phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và
thải ra môi trường thành các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy
lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22]. Thiaman (1962) đã giải thích cách
tạo thành cellulose như sau: các tế bào G. xylinus khi sống trong môi trường
lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường
glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào.
Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng
với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
7









Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa ( hình 1.3).
Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzyme tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm [15]:

1PFK: Fructose-1-phosphate kinase.
PGI: Phosphoglucoisomerase
PGM: Phosphoglucomutase
PTS: Hệ thống phosphotransferrase
UGP:UDP-glucose pyrophosphorylase.
Fru-bi-P:Fructose-1,6–bi-phosphate
Fru-6-P: Fructose-6-phosphate.
Glc-6-P: Glucose–6-phosphate.
Glc-1-P: Glucose-1-phosphate.
PGA: Phosphogluconic acid acid.
UDPGlc: Uridine diphosphoglucose
CS: Cellulose synthase.
GK: glucokinase.
FK: fructokinase.
FBP: fructose -1,6 - biphosphate phosphatase.
G6PDH: glucose – 6 - phosphate dehydrogenase.
8


Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter
1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như
một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước các nhân tố
có hại của môi trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi
khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào
Gluconacetobacter được bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia
cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể,
chỉ còn 3% [31].
Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn
đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ

dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
9

1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC
1.4.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử
enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp
chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh
vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC được thể
hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Nguồn cacbon
Monosaccharide
Năng suất
tổng hợp
cellulose
Nguồn cacbon
Disaccharide
Năng suất
tổng hợp
cellulose
D-Glucose
D-Fructose
D-Galactose
D-Xylose
D-Arabinos
D-Sorbose
100
92
15

11
14
11
Lactose
Maltose
Sucrose
Cellobiose
16
7
33
7-11

1.4.2. Nguồn nitơ
Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên
liệu để hình thành các nhóm amin (-NH
2
và -NH-) trong các phân tử
aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên
sinh chất [31].
Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4
+
. Vi sinh
vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó
khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn
nitơ vô cơ là (NH
4
)

2
SO
4
, NH
4
NO
3
, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao
nấm men [31].
10

1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố
khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần
của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại
phospho vô cơ như KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, KNO
3
…[31]. Việc bổ sung phosphat
(nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra
tính đệm của môi trường [31].
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng

BC như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi
lượng thì vi khuẩn Gluconacetobacter không thể sinh trưởng và phát triển
bình thường được.
Đối với Gluconacetobacter,

nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử
dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường…, khi nuôi cấy không cần phải
bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [31].
1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng
Các vitamin pyrodoxine, axit nicotinic, p–aminobenzoic axit (pABA),
biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp
cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại.
Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy
Gluconacetobacter thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà
các thành phần hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng
và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng
thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay
sorbitol. Ngoài ra, trong nước dừa còn có nhiều khoáng chất, vitamin, axit
amin… phù hợp cho quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành màng BC
11

của vi khuẩn Gluconacetobacter [31].
1.4.5. Điều kiện nuôi cấy
1.4.5.1. Độ pH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có
pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm axit acetic nhằm
axit hóa môi trường. Đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp
ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại [31].
1.4.5.2. Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter vào

khoảng 25 - 30
0
C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ
đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [19].
1.4.5.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [19]. Do đó,
điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong
thực tế độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp BC.
1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện
một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 –
48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày.
Theo Thesis Holmes (2004) [37], hàm lượng glucose trong môi trường
giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi
khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 – keto axit gluconic trong quá trình
trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng
thái tốt nhất.
12

1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành
màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên
men h =1,25 cm [10].
1.5. Ứng dụng của màng BC
Màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học
trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi
trường, các nhà khoa học đã dùng màng BC làm màng phân tách để xử lý
nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown. E. (2007)
[21], Jonas và Farad (1998) [29] đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến
đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học.

Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có
chất lượng cao Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản
xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á…
1.5.1. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông
Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân làm cho thực phẩm bị hư
hỏng và làm giảm thời gian sử dụng của sản phẩm thực phẩm. Vấn đề bảo
quản sản phẩm thực phẩm tránh khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng được đặc
biệt quan tâm. Có nhiều cách để bảo quản sản phẩm, như dùng các loại hóa
chất bảo quản là một cách khá phổ biến và cũng gây nhiều nhức nhối cho xã
hội do tính độc hại của chúng. Theo nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân
(2009) [14] màng BC sau khi xử lý có độ dẻo dai cao, hút ẩm tốt, ngăn cản sự
xâm nhập của vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc do đó có thể ứng dụng làm màng
bao chống vi sinh vật, đồng thời giảm lượng hóa chất bảo quản trong thực
phẩm. Ứng dụng làm màng bảo quản thực phẩm là một trong những ứng dụng
13

quan trọng của cellulose vi khuẩn trong ngành công nghệ bao bì trong những
năm gần đây (Yoshinaga 1997) [41].
1.5.2. Ứng dụng trong y học
Nhờ những đặc tính độc đáo mà màng BC đã được xem là một nguồn
polymer sinh học mới. Trong y học, màng BC đã được sử dụng như vật liệu
sinh học che phủ vết thương nhờ khả năng bền trong môi trường ẩm, thấm hút
dịch, không gây kích ứng da [35]. Tuy nhiên, giá thành màng BC nhập ngoại
khá đắt (35 – 40 nghìn đồng/1 chiếc có kích thước 15×10cm). Ở Việt Nam,
mới đây tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự (2012) đã chế tạo thành
công chế phẩm màng BC trị bỏng có tẩm dung dịch Becberin clorid 0,1% có
tác dụng kháng khuẩn và tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc kích ứng
da, không gây các rối loạn toàn thân [11].
Tác giả Wan đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ
Gluconacetobacter

dùng trong trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czaija và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da
cho phụ nữ [26], [29].
1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
Màng BC (cellulose vi khuẩn) được sử dụng thay thế cho cellulose thực
vật trong sản xuất cellulose có độ tinh khiết cao, góp phần giảm bớt nguồn
nguyên liệu từ thực vật (Sherif. 2008) [35]. Những nghiên cứu tìm nguồn thay
thế bằng cellulose vi khuẩn, Barbara et al., (2008) [20] tạo ra giấy từ cellulose
vi khuẩn với sự vượt trội về độ dẻo dai, bền, chắc. Sản xuất giấy điện tử từ
cellulose vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R. 2005) [28]
Cellulose vi khuẩn hiện được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với
những ứng dụng thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển sản xuất hàng
loạt. Các lĩnh vực ứng dụng cellulose vi khuẩn được trình bày trong bảng 1.2
14

Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau
Lĩnh vực
Sản phẩm
Thực phẩm
Thực phẩm tráng miệng (Nata de coco, kem, kẹo, snack, khoai tây
chiên ít calorie)
Thực phẩm giảm cân
Thịt nhân tạo
Bao bọc thịt và xúc xích
Giảm huyết thanh cholesterol
Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian
Y tế
Màng trị thương, màng trị phỏng
Tác nhân vận chuyển thuốc

Da nhân tạo
Mạch máu nhân tạo
Màng bao sụn
Mỹ phẩm
Kem thoa da
Chất làm se, chất ổn định
Màng nhân tạo
Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh bóng móng tay
Môi trường
Vật liệu hút vết dầu tràn hay chất độc hại
Màng siêu lọc làm sạch nguồn nước
Dầu mỏ
Vật liệu thu hồi và tái sinh khoáng chất và dầu
Da giầy
Da nhân tạo
Thể thao ngoài
trời
Lều dùng một lần và đồ dùng cắm trại
Tiện ích công
cộng
Màng thẩm thấu ngược
Chăm sóc trẻ
em
Tã giấy dùng một lần có khả năng tái sinh
Âm thanh
Màng rung chuyển đổi âm thanh
Công nghiệp gỗ
Chất tăng cứng cho gỗ nhân tạo
Chất bổ sung làm giấy
Thùng chứa chịu lực cao

Công nghiệp
giấy
Giấy lưu trữ hồ sơ
Giấy làm tiền tệ
Giấy điện tử
Máy móc tự
động và máy
bay
Thân xe hơi
Yếu tố cấu trúc cho máy bay
Màng bao tàu vũ trụ
Phòng thí
nghiệm
Giá thể nuôi cấy mô tế bào thực vật
Lĩnh vực khác
Màng composite
15

1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay
1.6.1. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC của chúng đã thu hút được
sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, trong công nghiệp giấy, trong công
nghiệp thực phẩm…[19]. Các nghiên cứu hiện nay về màng BC trên thế giới
đã tập trung vào vấn đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào
các lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn G. xylinus và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, [22],
[23], [24] dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown,

Jonas và Farad, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Jay shah, Brown. M. R. (2005) đã dùng BC làm
vải đặc biệt, Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và Farad, (1998), dùng
màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protein thay
cho sắc kí [20], [28], [29]. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức
chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc
cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh
tim mạch.
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong
phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ
dưỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng
chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ
gia, làm cơ chất để cố định protein thay cho sắc kí, .…
16

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh
hưởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose; nghiên cứu chế
tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng
dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah,
Brown. M. R, 2005) [28]; nghiên cứu của Alexander Steinbuchel, Sang Ki
Rhee (2005) [16] về con đường hình thành cellulose ở vi khuẩn, cấu trúc sợi
cellulose và đặc tính của màng celulose, mối quan hệ giữa khả năng hình
thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [16]; trong khi đó Alina
Krystynowicz và cộng sự, (2005) đã so sánh đặc điểm sinh học phân tử của
chủng G. xylinus dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến
(không có khả năng tổng hợp cellulose) [17]; năm 2006 đã có các nghiên cứu
về cấu trúc của màng BC sử dụng làm nanocomposit; Czafa, W., Young ;
Elvie Escoro Brown đã nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tương đồng về

cấu trúc giữa màng BC với collagen [26]. Năm 2007, Neelobon và cộng sự
[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình
thành màng trong điều kiện cụ thể là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi trong
bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng,
cấu trúc sợi cellulose của màng trong các điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong
sản xuất giấy [25]; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc
màng cellulose ứng dụng làm da nhân tạo [39]. Năm 2008, Barbara Surma-
S‟lusarska và cộng sự [20] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và nghiên
cứu đặc điểm màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và
xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng
trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng
sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công
nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Czaja và cs (2006), sử dụng màng
17

BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả
Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo,
làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [26], [29].
1.6.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter

và
màng BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới
quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng. Về ứng dụng thực tiễn,
mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, và
được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [6], [7], [10], [14]. Hiện nay việc
nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn
Gluconacetobacter chưa được thực hiện. Hầu như có rất ít các nghiên cứu

liên quan đến sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Năm 1997, có công
trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước
giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn G. xylinus.
Năm 1995- 2000 các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Gluconacetobacter
và khả năng lên men sinh axit acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhương,
Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình
mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng
BC, đặc tính cấu trúc màng BC [8]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng
màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn. Năm 2000,
nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc
Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi
trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn G. xylinus ứng dụng
vào làm thạch dừa. Năm 2003, có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thuý
Hường và Phạm Thành Hổ về chọn lọc dòng G. xylinus thích hợp cho các loại
môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn [5]. Năm 2006 nghiên cứu
của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về
màng BC từ G. xylinus tẩm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng [6]. Năm 2008,
18

có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuẩn G.
xylinus NH
1
, khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. Ngoài nguồn
nguyên liệu nước hoa quả dùng cho lên men giấm, còn có thể sử dụng nhiều
nguồn nguyên liệu khác như các loại bia, rượu nhạt, các nguyên liệu có chứa
đường, tinh bột, axit hữu cơ, giàu vi tamin , từ các vùng miền khác nhau ở
Việt Nam [7]. Nhiệm vụ tiếp theo là nghiên cứu định loại chủng G. xylinus có
khả năng cho màng BC có đặc tính mỏng, dai, đàn hồi, không gây kích ứng
cho da, khả năng kháng khuẩn tốt, kích thích mọc da non nhanh, giá thành rẻ,
dùng làm màng trị bỏng [8], [9], [10].

Việc nghiên cứu và ứng dụng sản phẩm màng BC từ chủng G. xylinus
ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, trường Đại học Y Dược học
Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng
phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và
trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da
tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn
gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da
[6], chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng
vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời
gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu
nhận màng BC từ vi khuẩn G. xylinus, ứng dụng màng BC trong điều trị
bỏng. Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu
thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch,
màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều
trị bỏng [11]. Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC
với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên
nhiên. Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực