Nghiên cứu chiết xuất ethyl p methoxycinnamat từ địa liền

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



CAO THỊ THƢƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ETHYL-P-METHOXYCINNAMAT
TỪ ĐỊA LIỀN


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




HÀ NỘI – 2015


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


CAO THỊ THƢƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ETHYL-P-METHOXYCINNAMAT
TỪ ĐỊA LIỀN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công Nghiệp Dược
2. Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian hoàn thành khóa luận này tại Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc
và Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc gia – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội , tôi
đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hƣớng dẫn của thầy cô, bạn bè và
gia đình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ
môn Công Nghiệp Dƣợc và Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc gia đã giúp đỡ
tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập tại
trƣờng.
Và cuối cùng, lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc gửi tới:
TS. Nguyễn Văn Hân – giảng viên Bộ môn Công Nghiêp Dƣợc – Trƣờng
Đại Học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, luôn nhắc nhở và bỏ qua
những sai sót của tôi, giúp tôi tự tin hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.


Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2015

Sinh viên
Cao Thị Thƣơng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Địa liền 2
1.1.1 Vị trí phân loại 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật 3
1.1.3 Phân bố và sinh thái 3
1.1.4 Cách trồng 4
1.1.5 Bộ phận dùng 5
1.1.6 Thành phần hóa học 5
1.1.7 Tác dụng dược lí 6
1.1.8 Tính vị, công năng 7
1.1.9 Công dụng 7
1.2 Tổng quan về Ethyl-p-methoxycinnanat 8
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8
1.2.2 Công dụng của Ethyl-p-methoxycinnamat 9
1.2.3 Các phương pháp chiết xuất EPMC từ Địa liền 11

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 13

2.1.1 Nguyên liệu 13
2.1.2 Hóa chất 13
2.1.3 Máy móc, thiết bị 13
2.2 Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1 Thu hái và xác định tên khoa học của cây 14
2.2.2 Khảo sát biến đổi hàm lượng EPMC trong quá trình làm khô liệu 14
2.2.3 So sánh các phương pháp chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền 15
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.3.1 Phương pháp xác định tên cây 116
2.3.2 Phương pháp chiết tinh dầu bằng cất kéo hơi nước 17
2.3.3 Chiết xuất trong thân rễ Địa liền bằng Soxhlet 18
2.3.4 Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền 19

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xác định tên khoa học mẫu cây 21
3.2 Xác định hàm lƣợng EPMC trong dƣợc liệu 22
3.3 Chiết xuất EPMC bằng cất kéo hơi nƣớc 25
3.4 Chiết xuất EPMC bằng Soxhlet 28
3.5 So sánh các phƣơng pháp chiết xuất 30

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

COX
:
Cyclooxygendase

13
C-NMR
:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13
DĐVN
:
Dƣợc điển Việt Nam
ESI-MS
:
Electro Spray Ionization - Mass spectrometry
(Khối phổ - Ion hóa bằng phƣơng pháp phun mù điện tử)
EPMC
:
Ethyl-p-methoxycinnamat
1
H-NMR
:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
HPLC
:
High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IR
:
Infrared (Hồng ngoại)
MAO
:
Monoaminoxydase
MITF
:

Microphthalmia-associated transcription factor
(yếu tố chính phiên mã và kiểm soát biểu hiện của tyrosinase)
α-MSH
:
α -melanocyte stimulating hormon
(enzym tổng hợp sắc tố da melamin)
NMR
:
Nuclear magnetic resonanc
(Cộng hƣởng từ hạt nhân)
NSAIDs

:

Non-steroidal anti-inflammatory drugs
(Các thuốc chống viêm không steroid)
TLC
:
Thin Layer Chromatography
(Sắc ký bản mỏng)
UV-VIS
:
Ultraviolet – visible (Tử ngoại khả kiến)
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Vị trí phân loại của Địa liền (Kaempferia galaga L.) 2
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất dùng trong thí nghiệm 13
Bảng 3.1 Kết quả thu đƣợc khi đo 6 mẫu chuẩn 23
Bảng 3.2 Kết quả định lƣợng của mẫu tƣơi và mẫu khô 24
Bảng 3.3 Kết quả phân tích và so sánh
13

C NMR và
1
H NMR 27
Bảng 3.4 Kết quả của phƣơng pháp Soxhlet bằng 2 dung môi n-hexan và ethyl
acetat 30
Bảng 3.5 Bảng so sánh các phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất EPMC từ Địa
liền 30

MỤC LỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1 Sơ đồ phƣơng pháp nghiên cứu 16
Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nƣớc 17
Hình 2.3 Bộ chiết Soxhlet 18
Hình 3.1 Mẫu cây tƣơi Địa liền 21
Hình 3.2 Đƣờng chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính 23
Hình 3.3 Công thức cấu tạo của EPMC 26


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nƣớc Việt Nam ta đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với những cánh rừng nguyên
sinh chạy dọc đất nƣớc. Thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều
cây có tiềm năng rất to lớn trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân.
Trong hệ thống đa dạng và phong phú cây thuốc Nam, Địa liền đƣợc xem là một
cây thuốc quý đƣợc dân gian, cộng đồng sử dụng nhiều để dùng chữa ngực bụng
lạnh đau, tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu,
đau dạ dày, cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn và một số tác dụng khác [2].
Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 -3,9% tinh dầu. Thành phần chủ yếu là
acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và ethyl-p-methoxycinnamat [2]. Trong

đó, ethyl p-methoxycinnamat (EPMC) chiếm chủ yếu và có nhiều tác dụng có
ứng dụng lớn trong việc chữa bệnh và mỹ phẩm, nổi bật là tác dụng chống viêm
tƣơng tự non-steroidal anti-inflammatory drugs (các thuốc chống viêm không
steroid) do ức chế cyclooxygendase và tác dụng làm trắng da [2],[8], chống
nắng do ức chế enzyme tổng hợp sắc tố da melamin-tyrosinase và có khả năng
hấp phụ UV-VIS [12]. Ngoài ra, chất EPMC còn có tác dụng nhƣ một chất ức
chế men monoaminoxydase, có thể dùng làm thuốc chữa trầm cảm, gây giãn khí
phế quản, có phổ kháng nấm khá rộng [2].
Từ những ứng dụng quan trọng đó của EPMC, việc chiết xuất EPMC từ
Địa liền là cần thiết nhằm phục vụ nhu cầu phòng và chữa bệnh của cộng đồng.
Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Chiết xuất EPMC từ Địa liền” với mục tiêu:
Khảo sát và so sánh được hiệu quả chiết xuất EPMC từ Địa liền bằng
phương pháp cất kéo hơi nước và phương pháp Soxhlet.

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Địa liền
1.1.1 Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của cây Địa liền trong hệ thống phân loại thực vật của
Takhtajan 1987 [2] đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.1 Vị trí phân loại của Địa liền (Kaempferia galaga L.)
Giới
Thực vật – Plantae
Không phân hạng
Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae
Lớp
Lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida)
Phân lớp

Phân lớp Gừng (Zingiberidae )
Bộ
Bộ Gừng (Zingiberales)
Họ
Họ Gừng (Zingiberaceae)
Phân họ
Phân họ Gừng (Zingiberoideae)
Chi
Chi Địa liền (Kaempferia)
Loài
Kaempferia galanga L.

 Tên khoa học của vị thuốc: Rhizoma Kaempferia [3], [6].
 Tên đồng nghĩa: Kaempferia rotunda Ridl [3].
 Tên khác: sơn nại, tam nại, thiền liền, sa khƣơng, faux galanga,
co xá choóng (Thái) [1], [3], [4], [5], [6].


3

1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống lâu năm, không có thân. Thân rễ gồm nhiều củ nhỏ, hình
trứng mọc nối tiếp nhau, có nhiều vân ngang. Lá, 2-3 cái hình trứng gần tròn,
xòe rộng sát mặt đất, đầu tù rồi thuôn nhọn, gốc thuôn hẹp thành một cuống
ngắn rộng có rãnh, mặt trên nhẵn bóng, mặt dƣới hơi có lông mịn, mép lông
màu đỏ, hai mặt có nhiều chấm hình vòng tròn, phiến lá dài 8-10 cm, rộng 6-7
cm [1], [6].
Cụm hoa không cuống, nằm ẩn trong bẻ lá; lá bắc hình mũi mác nhọn;
hoa 6-12 cái, xếp thành hình bánh xe, màu trắng có đốm tím ở giữa; đài có 3
răng dài, hẹp và nhọn; tràng có ống dài, mang 3 thùy; nhị không có chỉ nhị, bao

phấn có 2 ô song song; có nhị lép, cánh môi to chẻ đôi thành 2 thùy. Toàn cây
nhất là thân rễ có mùi thơm và vị nóng [1], [4], [6].
Mùa hoa quả: tháng 5-7 [1].
Tránh nhầm lẫn với cây Kaempferia angustifolia Roscoe mà nhân dân
Phú Thọ cũng gọi là Địa liền [2].
1.1.3 Phân bố và sinh thái
Chi Kaempferia L. có 9-10 loài ở Việt Nam. Loài Địa liền phân bố ở Ấn
Độ, Malaysia, Indonesia, Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia và Trung Quốc.
Ở Việt Nam có, loài Địa liền lá hẹp mọc tự nhiên dƣới các rừng thƣa, rụng lá
hoặc nựa rụng lá ở Đắc Lắc, Đồng Nai và ngoại thành thành phố Hồ Chí Minh.
Địa liền là cây vốn mọc tự nhiên ở Tây Nguyên, một số tỉnh miền núi nhƣ Hà
Giang, Yên Bái, Sơn La. Cây đã đƣợc trồng ở nhiều nơi vùng đồng bằng sông
Hồng (Hƣng Yên, Hải Dƣơng, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Bắc Giang ), Nghệ An
và Thanh Hóa. Địa liền là cây ƣa sáng, ƣa ẩm và có khả năng chịu hạn. Hằng
năm, cây mọc lá non vào tháng 4-5, sinh trƣởng nhanh trong mùa hè và sau đó
ra hoa. Hoa nở mỗi ngày một cái vào lúc sáng sớm, rồi tàn lúc 10 giờ. Địa liền
4

có khả năng đẻ nhánh khỏe. Từ một củ con (mẫu thân rễ) lúc mới trồng, sau đó
một năm đã tạo thành một khóm lớn. Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa
đông.
Đầu những năm 90, các tỉnh phía Bắc trồng nhiều Địa liền để xuất khẩu.
Hiện nay, cây trồng chủ yếu cho nhu cầu sử dụng trong nƣớc. Nguồn Địa liền tự
nhiên ở Tây Nguyên cũng cần đƣợc chú ý để tận thu [1].
1.1.4 Cách trồng
Địa liền là loại cây quen thuộc và đƣợc trồng ở khắp nơi để làm thuốc.
Thông thƣờng, cây đƣợc trồng phân tán ở các vƣờn gia đình. Gần đây, khi thị
trƣờng có nhu cầu, cây mới đƣợc trồng trên quy mô sản xuất Nông trƣờng Hữu
Nghị (Hoành Bồ - Quảng Ninh) và Trại nghiên cứu kỹ thuật trồng Địa liền.
Cây đƣợc nhân giống bằng rễ củ. Khả năng tái sinh của rễ củ Địa liền rất

mạnh. Chỉ cần một nhánh nhỏ cũng có thể mọc thành cây. Tuy nhiên, để đảm
bảo năng suất, cần chọn những nhánh củ chƣa mọc thành cây, có đƣờng kính
1,5-2 cm, không bị nhiễm bệnh, không dập nát.
Địa liền trồng đƣợc trên nhiều loại đất, nhƣng phải tơi xốp, cao ráo, thoát
nƣớc, đủ ánh sáng. Cây hơi chịu bóng nên có thể trồng xen với các cây khác. Ở
các vƣờn gia đình, trong điều kiện bị che bóng một phần, cây vẫn sinh trƣởng
tốt. Đất cần làm cho nhỏ, để ải, vơ sạch cỏ, bón phân lót, lên luống rồi trồng. Củ
Địa liền ăn nông trên mặt đất nên luống chỉ cần cao 20 - 30 cm. Mặt luống rộng
hay hẹp tùy theo việc chăm sóc. Trung bình, mỗi hécta dùng 20 - 25 tấn phân
chuồng hoai mục, 250 kg supe lân, 150 kg kali và có thể thêm 3 -5 tạ tro bếp để
bón lót. Riêng đối với kali bón lót một nửa và một nửa để bón thúc. Phân có thể
bón lót theo hốc, theo hàng hay trộn đều với đất trên mặt luống. Mầm đƣợc
trồng với mật độ 15×20 hoặc 20×20 (cm) phủ đất dày 1-2 cm, cho trấu hoặc rơm
rạ lên trên rồi tƣới nƣớc giữ ẩm hàng ngày. Mỗi hecta cần 1,5- 2 tấn củ giống.
5

Thời kì đầu, cần xới xáo nhẹ để giữ cho mặt luống thông thoáng. Từ
tháng 5 đến tháng 8, dùng nƣớc phân, nƣớc giải hoặc đạm pha loãng để bón thúc
cho cây, cứ 25 - 30 ngày bón một lần.
Địa liền ít bị sâu bệnh. Tuy nhiên, cần đặc biệt lƣu ý thoát nƣớc sau mƣa.
Cây bị úng dễ thối cả củ.
Sau tháng mƣời hai, cây bắt đầu tàn lụi. Lúc này có thể thu hoạch củ
hoạch để đến tháng giêng. Củ đào về, rửa sạch, thái nhỏ, sấy lƣu huỳnh qua một
đêm rồi phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. Năng suất củ tƣơi đạt trung bình 15- 20
tấn/ha. Tỷ lệ tƣơi/ khô dao động trong khoảng 3,5- 4 [1].
1.1.5 Bộ phận dùng
Thân rễ, thu hái vào mùa đông xuân, rửa sạch phơi khô hoặc sấy [1].
1.1.6 Thành phần hóa học
Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 -3,9% tinh dầu. Thành phần chủ yếu là
acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và p-methoxy ethylcinamat. Hợp chất p-

methoxy ethylcinamat chiếm tới 30% dễ dàng kết tinh khi bảo quản lạnh. Phần
lỏng còn lại sau khi tách khỏi phần kết tinh có hằng số vật lý sau: Trọng lƣợng
riêng 0,8792 – 0,8914, chỉ số acid 0,5 – 1,3, chỉ số xà phòng 99,7 – 109, [α]
D
30
-
2,6
0
– 4,5
0
,
30
D
14773- 14855.
Ngoài ra, thân rễ còn có các hợp chất n- pentadecan, A
3
– caren, o-
methoxy ethylcinamat, borneol, p-methoxystyren, acid transcinamic, aldehyd
cinamic, cineol, kaempferol và kaempferid, monotepen keton: 3-caren-5-on,
carvon, eucalyptol [1].

6


1.1.7 Tác dụng dược lí
- Tác dụng hạ Giảm đau
Trên mô hình gây đau nội tạng bằng cách tiêm dung dịch acid acetic 0,6%
vào xoang bụng chuột nhắt trắng để tạo nên những cơn đau quặn, Địa liền dùng
với liều 5g/kg thể trọng, bằng đƣờng uống, một giờ sau khi dùng thuốc làm giảm
69% số lần xuất hiện cơn đau. Còn trên mô hình gây đau bằng sức nóng, Địa

liền không thể hiện tác dụng giảm đau kiểu morphin [1].
- Tác dụng chống viêm
Trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng cách tiêm nhũ dịch
kaolin 10%, Địa liền có tác dụng chống viêm rõ rệt, dạng cao cồn với liều
10g/kg thể trọng ức chế viêm 63,8%, dạng cao nƣớc với liều 10g/kg thể trọng
cũng ức chế viêm 60%. Tinh dầu và dạng tinh thể chiết từ Địa liền cũng có tác
dụng chống viêm tƣơng tự [1].
“Kapurkachari” là một loại thuốc Ayurvedic (thảo dƣợc Ấn Độ) nổi tiếng
với việc điều trị các bệnh khác nhau nhƣ ho, viêm loét, Ngoài ra, chúng còn
đƣợc sử dụng để chữa đầy hơi, chƣớng bụng và dùng làm mỹ phẩm, bao gồm
thân rễ của ba cây cụ thể là: Hedychium spicatum Buch. Ham. ex Smith.,
Kaempferia galanga Linn. và Curcuma zedoaria Rosc. (nghệ đen). Tất cả ba
cây trên đều thuộc một phân lớp Scitaminae, họ Zingiberaceae. Tất cả các cây
này đều chứa các loại tinh dầu, nhựa, tinh bột nhƣ phytoconsituents. Trong số
ba cây, hoạt động chống viêm của hedychium spicatum đƣợc nghiên cứu chi
tiết hơn cả. Trong khi hai cây khác cũng đƣợc bán tại các thị trƣờng dƣới tên
thƣơng mại, ngƣời ta nghĩ đến việc đánh giá để xác định hiệu quả chống viêm
7

của các loại thuốc Thí nghiệm đã chứng tỏ rằng dịch chiết ethanol của tất cả ba
thân rễ ức chế sự hình thành phù nề chân có ý nghĩa trong điều trị cấp với tác
nhân carageenan gây phù nề ở chuột. Hedychium spicatum ức chế 55,54%,
Kaempferia galanga 50,98% trong khi Curcuma zedoaria là 39,78%. Kết quả
cho thấy rằng, dịch chiết ethanol của Kapurkachari có khả năng kháng viêm
mạnh, có thể ức chế đợt viêm cấp tính ở chân chuột gây ra bởi carageenan [8].
- Tác dụng hạ sốt
Trên thỏ gây sốt thực nghiệm bằng pyrogen chuẩn (natri nucleinat). Địa
liền với liều 5g/kg bằng đƣờng uống, 2 giờ sau khi dùng thuốc, làm hạ sốt 0,4 –
0,5
0

C so với lô đối chứng.
Theo tài liệu nƣớc ngoài, Địa liền còn có một số tác dụng khác.Trên ống
nghiệm, nƣớc sắc thân rễ có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm
thƣờng gây bệnh ngoài da; chất EPMC có phổ kháng nấm khá rộng. Cao chiết
bằng cloroform từ thân rễ trên ống kính có tác dụng ức chế co thắt giải động
mạch chủ chuột cống trắng gây nên do K+ hoặc do phenylephrin. Thí nghiệm
trên chuột lang, chất EPMC gây giãn khí phế quản, chứng tỏ việc sự dụng Địa
liền trong điều trị bệnh hen suyễn là có cơ sở. Chất EPMC còn có tác dụng nhƣ
một chất ức chế men MAO, có thể dùng làm thuốc chữa trầm cảm.
Cao chiết bằng ethanol từ Địa liền có tác dụng độc tế bào đối với tế bào
carcinom cổ tử cung (Hela) và diệt amip. Các thành phần ethyl cinnamat, p-
methoxy cinnamat và acid p-methoxy cinnamic, có tác dụng diệt dòi bọ. Borneol
có tác dụng làm ra mồ hôi, gây hƣng phấn, giải co thắt [1].
1.1.8 Tính vị, công năng
Theo tài liệu cổ, Địa liền có vị cay, tính ôn, vào các kinh tâm, tỳ, vị, có
tác dụng ôn trung, tán hàn, trừ thấp, tiêu thực, bạt khí độc [1].
1.1.9 Công dụng
8

Theo kinh nghiệm dân gian, Địa liền đƣợc dùng chữa ngực bụng lạnh đau,
tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu, đau dạ dày,
cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn.
Liều dùng: ngày 3-6 g dƣới dạng thuốc sắc, thuốc bột, thuốc viên, thuốc
hãm [1]. Rƣợu Địa liền (ngâm củ Địa liền trong rƣợu 40 – 50
0
, trong 5 – 7 ngày)
có thể dùng xoa bóp hoặc uống làm bớt nhức mỏi gân cốt, đau lƣng và làm cho
máu huyết thông hoạt. Cũng dùng trị nhức đầu và phù thũng. Nƣớc chiết củ
dùng trị ho, làm bớt hôi miệng, làm cao dán trị nhức mỏi. Lá và củ cũng dùng
ngậm cho bớt ho và làm hết hôi miệng. Rễ còn dùng chế mỡ xức tóc cho thơm

[6].
Ngoài ra, tinh dầu Địa liền để chế nƣớc hoa, mỹ phẩm, làm vị điều hƣơng
trong thực phẩm. Bột Địa liền có tác dụng bảo vệ quần áo chống nhậy cắn.
Ở Philippin, nƣớc sắc Địa liền chữa ăn uống khó tiêu, sốt rét. Lá Địa liền
giã nát hơ nóng, đắp chữa tê thấp. Ở Malaysia, thân rễ Địa liền đƣợc dùng chữa
cao huyết áp, lở loét, hen suyễn. Lá và thân rễ nhai ngậm chữa ho và đau họng.
Thân rễ dùng riêng chữa cảm lạnh. Một vài nơi dùng lá và thân rễ Địa liền làm
rau ăn sống [1].
1.2 Tổng quan về Ethyl–p-methoxycinnanat
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa

9

Công thức cấu tạo:

Danh pháp hóa học: ethyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat; ethyl(E)-4-
methoxycinnamat; ethyl-4-methoxycinnamat; ethyl-p-methoxycinnamat; (E)-3-
(4-methoxyphenyl)-2-propenoic acidethyl ester; 3-(4'-methoxyphenyl)-(E)-
propenoic acid ethyl ester; (E)-3-(4-methoxyphenyl) propenoic acid ethyl ester.
Tên IUPAC: ethyl 3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat.
Chỉ số CAS: 24393-56-4.
Công thức phân tử : CH
3
OC
6
H
4
CHCHC(O)OC
2
H

5
hay C
12
H
14
O
3.
Khối lƣợng phân tử: 206.241.
EPMC là một ester của acid p-methoxycinnamic, là sản phẩm của phản
ứng ester hóa acid p-methoxycinnamic với acol ethylic xúc tác acid, base mạnh
hoặc các enzym.
Tỷ trọng: 1,205g/cm
3
[14].
Nhiệt độ nóng chảy: 48 - 50
0
C [15], 39,35
0
C [14].
1.2.2 Tác dụng của Ethyl-p-methoxycinnamat
EPMC có nhiều tác dụng đã và đang đƣợc nghiên cứu và chứng minh:
- Gây độc cho tế bào gây bệnh bạch cầu promyelocytic HL-60 ở ngƣời
với IC
50
= 35,69 μmol/l, gây độc cho tế bào gây bệnh bạch cầu cấp tính
monocytic THP-1 ở ngƣời với IC
50
= 41.23 μmol/l, tế bào u ác tính A375 ở
ngƣời IC
50

= 31.59 μmol/l, tế bào gây ung thƣ phổi A-549 ở ngƣời với IC
50
=
50.35 μmol/l [17], [9].
10

- Ức chế 1 số loại nấm: Candida albicans [21], Trichophyton rubum, Trichophyton
mentagrophytes, Microsporum gypseum…[9]; vi khuẩn: Mycobacterium tuberculosi…[13].
- Ức chế 1 số loại enzym: COX1, COX2 [21], MAO [16], nấm men bánh
mì α-glucosidase…[7].
- Ức chế tổng hợp melamin do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da melamin:
α-melanocyte stimulating hormon (α-MSH), tyrosinase. Ngoài ra, EPMC cấu tạo
hóa học có chứa nhân thơm và nối đôi dễ bị oxy hóa có khả năng hấp thụ UV-
VIS. Vì vậy, EPMC là thành phần hay đƣợc sử dụng trong kem chống nắng và
làm trắng da [22], [12], [9].
- Cảm ứng enzym gan cytP450s: CYP1A và CYP2B [19].
Trong đó, nổi bật là tác dụng chống viêm tƣơng tự NSAIDs do ức chế
COX và tác dụng làm trắng da, chống nắng do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da
melamin – tyrosinase và có khả năng hấp phụ UV-VIS.
Trong một nghiên cứu invitro chống viêm, EPMC đã đƣợc tìm thấy để ức
chế cả COX-1 và COX-2 không chọn lọc. Tuy nhiên, sự ức chế COX-2 là rõ rệt
hơn (57,82%) so với COX-1 (42,9%). Indomethacin là một chất ức chế COX
không chọn lọc, chống viêm bằng cách ức chế cả COX-1 và COX-2. Tuy nhiên,
indomethacin đã đƣợc ghi nhận là có tác dụng ức chế trên COX-1 là tƣơng đối
mạnh và sâu sắc hơn tác động của nó trên COX-2. Ví dụ, trong một nghiên cứu
trƣớc đây, IC
50
của indomethacin đã đƣợc tìm thấy là 18 ± 3 nM cho COX-1 và
26 ± 6 nM cho COX-2. Indomethacin cho thấy xu hƣớng tƣơng tự trong ức chế
COX-1 và COX-2 trong điều kiện thử nghiệm với sự ức chế mạnh hơn của

COX-1 (82,8%) so với COX-2 (54,6%). Ngoài các prostaglandin gây viêm,
COX-1 có vai trò trong tổng hợp những prostaglandin cần thiết cho việc duy trì
tính toàn vẹn của niêm mạc dạ dày và ruột. Sự ức chế cao hơn của COX-1 làm
tăng nguy cơ gây viêm loét dạ dày và các biến chứng liên quan của một số
thuốc. Theo các kết quả ức chế COX-2 bởi EPMC trong bài bào này, theo các
11

điều kiện tƣơng tự, là tốt hơn so với indomethacin, trong khi sự ức chế COX-1
bởi EPMC (42,9%) cũng đã ít hơn bởi indomethacin (82,8%). Thay thế
indomethacin bằng EPMC, cho thấy EPMC có lợi thế hơn indomethacin, trong
điều trị viêm, đặc biệt ở bệnh nhân loét dạ dày [20].
Cơ chế ức chế sự tổng hợp melamin của EPMC: trong một hệ thống tế
bào tự do, EPMC không có tác dụng trực tiếp trên hoạt động oxy hóa của enzym
tyrosinase, trong khi axit kojic ức chế đáng kể hoạt động tyrosinase. Tuy nhiên,
EPMC ức chế hoạt động tyrosinase trong B16F10- tế bào hắc tố phụ thuộc liều.
Do đó, phân tích đƣợc thực hiện để kiểm tra ảnh hƣởng của EPMC trên
Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) là yếu tố chính phiên
mã và kiểm soát biểu hiện của tyrosinase. Điều trị bằng 25 mg/ml ethyl p-
methoxycinnamat trong 24 giờ giảm đáng kể mức MITF và tyrosinase trong tế
bào α-MSH-stimulated B16F10 [12].
1.2.3 Các phương pháp chiết xuất EPMC từ Địa liền
Một số phƣơng pháp chiết EPMC từ Địa liền đƣợc sử dụng trong các
nghiên cứu thử nghiệm về tác dụng dƣợc lí của EPMC cũng nhƣ Địa liền. Sau
đây là một số phƣơng pháp và kết quả.
- Chiết bằng dung môi:
Theo Huyn Ju Ko (2014), thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: xay Địa
liền, cân nguyên liệu khô (2,5 kg) chiết xuất với ethanol 100% trong hơn một
ngày, lọc, lặp lại sáu lần. Gộp dịch thu đƣợc và cô quay chân không đƣợc dịch
chiết ethanol (109 g). Sau đó, dịch chiết đƣợc phân tán trong nƣớc và chiết bằng
chloroform tạo phần không phân cực. Làm lạnh phần không phân cực này hình

thành tinh thể đƣợc xác định là một hợp chất duy nhất (49 g). Từ phân tích cộng
hƣởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy các cấu trúc hóa học của hợp chất là EPMC.
Hiệu suất quá trình chiết và phân lập này là gần 1,96% [12].
12

Còn theo Wanna S. (2011), quá trình thực hiện nhƣ sau: bột thân rễ khô
của K. galanga L. ngâm với dichloromethan (1 kg/ 2,5 lít) trong 7 ngày. Sau đó
lọc qua giấy lọc Whatman 1, bốc hơi dung môi bằng máy cô quay (Eyela, SB-
1000, Nhật Bản). Đƣợc dịch chiết xuất dichloromethan của K. galanga L. (DEK)
màu nâu thạch đƣợc bảo quản ở 4
0
C đến khi sử dụng. Để có đƣợc hợp chất
EPMC, DEK đƣợc sắc ký cột silica gel (70-230 mesh) và tách rửa với gradient
dichloromethan: hexan (70:30 đến 95:5). Các phần tách rửa đƣợc thu thập và
kiểm tra bởi TLC (silica gel, GF 254) với dung môi là dichloromethan: hexan
(95:5). Các đoạn có chứa EPMC đƣợc gộp chung và sấy khô. Độ tinh khiết của
EPMC đƣợc kiểm tra bằng cách sử dụng phƣơng pháp HPLC nhƣ sau; HPLC
(Agilent 1100 series và UV-VWD, Agilent Nhật Bản), sử dụng hệ dung môi,
acetronitril: methanol: 20 mM NaH2PO4 (30:40:30 v / v / v) với tốc độ dòng
chảy 1ml/phút, 5micron, 4.6x250mm (Agilent, Đức) và cột bảo vệ, μBondpack
10 micromet C18 (nƣớc, U.S.A.). Tại bƣớc sóng UV 270 nm. DEK đã cho thấy
đỉnh lớn có chứa 80 mg% EPMC [19].
- Cất kéo tinh dầu bằng hơi nước:
Phƣơng pháp này đƣợc Luger P. thực hiện năm 1996 có nội dung sau.
Các cây đƣợc thu hoạch vào tháng mƣời năm 1994, tại Đắc Lắc, Việt Nam. Cất
kéo tinh dầu bằng hơi nƣớc từ thân rễ tƣơi trong 6 giờ với thiết bị, dụng cụ thủy
tinh (hàm lƣợng dầu 3,1%). Tinh dầu hòa tan đƣợc cả trong chloroform và
ethanol. Dung dịch chloroform giữ tại nhiệt độ 277-279
0
K (4- 6

0
C) từ đó EPMC
kết tinh. Trong ethanol cho tinh thể hình đĩa không màu (mp 322,5
0
K- 49,5
0
C).
Các sắc ký khí cho thấy tinh dầu thân rễ có chứa khoảng 66% EPMC [14].

13

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
Thân rễ Địa liền đƣợc thu hái ở xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc
Giang, thu hoạch vào tháng 12 năm 2014, đƣợc rửa sạch.
2.1.2 Hóa chất
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất dùng trong thí nghiệm
STT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
1
N-hexan
Trung Quốc
2
Ethanol 96%
Việt Nam
3
Aceton

Trung Quốc
4
Ethyl acetat
Trung Quốc
5
Acid sulfuric
Việt Nam
6
Ceri sulfat
Việt Nam

2.1.3 Máy móc, thiết bị
Máy móc
- Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ).
- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
- Tủ sấy MEMMERT (Đức).
14

- Bể siêu âm
- Bộ cất tinh dầu
- Bộ chiết Shoxlet
- Dụng cụ thái dƣợc liệu: dao thái
- Máy sắc khí bản mỏng CAMAG
- Máy xay
Dụng cụ
- Bình nón: 100ml.
- Ống đong : 100ml, 500ml.
- Bình định mức 10ml.
- Cốc có mỏ: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.

- Pipet: 1ml, 10ml.
- Phễu lọc.
- Bản mỏng silicagel
- Mao quản chính xác 5 microlit
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Thu hái và xác định tên khoa học của cây
Mẫu cây đƣợc lấy ở xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang.
Mô tả mẫu: Mẫu gồm cây tƣơi mang lá.
Quá trình giám định tại bộ môn Thực vật, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội
xác định tên khoa học của mẫu cây.
2.2.2 Khảo sát biến đổi hàm lượng EPMC trong quá trình làm khô liệu
Để kiểm tra sự biến đổi về khối lƣợng khi sấy, từ dƣợc liệu tƣơi thành
dƣợc liệu khô. Cân dƣợc liệu tƣơi, sấy, cân lại, và xác định khối lƣợng.
15

Đồng thời với việc kiểm tra biến đổi về khối lƣợng, ta còn xét thêm sự
biến đổi về hàm lƣợng EPMC trong thân rễ Địa liền từ tƣơi thành khô. Định
lƣợng EPMC trong thân rễ Địa liền tƣơi và khô bằng phƣơng pháp sắc ký lớp
mỏng TLC, xây dựng đƣờng chuẩn và xác định đƣợc khoảng tuyến tính phù hợp
để xác định chính xác hàm lƣợng của 2 mẫu thử tƣơi và khô.
2.2.3 So sánh các phương pháp chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền
Ta thực hiện 2 phƣơng pháp để chiết xuất EPMC là cất kéo hơi nƣớc và
chiết Soxhlet với dung môi là n-hexan và ethyl acetat. Từ kết quả thực nghiệm,
ta xác định hiệu suất EPMC thu đƣợc của từng phƣơng pháp. So sánh ƣu,
nhƣợc, đánh giá các phƣơng pháp.
Xác định một số tính chất của sản phẩm: điểm chảy, phổ IR, phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân, phổ khối MS.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

Từ những nghiên cứu đã đƣợc thực hiện, chúng tôi đã xây dựng phƣơng

pháp chiết xuất EPMC theo sơ đồ hình 2.1:









16











Phƣơng pháp Phƣơng pháp Soxhlet
Cất kéo hơi nƣớc



Kết tinh Kết tinh

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xác định tên cây
Để xác định đƣợc tên khoa học của cây, ta tiến hành thu hái mẫu cây tƣơi
tại tại xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang. Mẫu cây thu hái tốt nhất
là có đầy đủ: lá, hoa, quả (nếu có). Tuy nhiên do điều kiện thực nghiệm, chúng
tôi chỉ tìm đƣợc mẫu gồm cây tƣơi mang lá. Lấy nguyên liệu để làm thực
nghiệm.
Phƣơng pháp xác định tên khoa học của mẫu cây: Căn cứ vào các tài liệu
có tại trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội (bao gồm: Cây cỏ Việt Nam - Phạm Hoàng
Bột Địa liền
Hỗn hợp
tinh dầu

Dịch chiết
EPMC
EPMC thô
EPMC
Củ Địa liền
Định lƣợng
EPMC
Kiểm
nghiệm
Kết tinh lại

17

Hộ, tập 3; Từ điển thực vật thông dụng – Võ Văn Chi, tập 2; Flora of China,
Vol. 24) và các mẫu lƣu tại phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris – Muséum
National d’ Histoire Naturelle (P) với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, để
xác định mẫu cây. Quá trình xác định đƣợc thực hiện tại Bộ môn thực vật,
trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Đƣợc tiến hành bởi Ths. Nghiêm Đức Trọng.
2.3.2 Phương pháp chiết tinh dầu bằng cất kéo hơi nước
- Xử lý dƣợc liệu, cân dƣợc liệu
- Lắp bộ cất, cất tinh dầu bằng hơi nƣớc
- Xử lý hỗn hợp tinh dầu thu đƣợc
- Kết tinh dịch vừa xử lý, lọc thu tủa, xác định khối lƣợng tủa thu đƣợc
- Xác định phổ, nhiệt độ nóng chảy chất thu đƣợc.


Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nước
1. Bình cất dung dịch: bình cầu 2000 ml
2. Bầu bảo hiểm
3 Ống sinh hàn
4. Bình hứng 500 ml
5. Nƣớc làm lạnh