Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa bacillus clausii dạng bào tử

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU
CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2015





BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN


NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU
CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
DS. Nguyễn Thị Thu Phương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI - 2015




LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Đàm Thanh Xuân và
DS. Nguyễn Thị Thu Phương là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên của bộ
môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và giúp đỡ

em trong suốt thời gian làm thực nghiệm.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà
Nội đã dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động
viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Phùng Thị Ngọc Huyền







MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2
1.1.1. Định nghĩa 2
1.1.2. Vai trò 3
1.1.3. Probiotic từ bào tử 4
1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii 5
1.2.1. Đặc điểm hình thái 6
1.2.2. Cấu trúc bộ gen 6

1.2.3. Đặc điểm sinh hóa 7
1.2.4. Đặc điểm sinh thái 7
1.2.5. Điều kiện nuôi cấy 7
1.2.6. Ứng dụng của B. clausii 7
1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii 8
1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN 8
1.3.1. Quá trình hình thành bào tử 11
1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13
2.1.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14
2.1.3. Thiết bị 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất 15




2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu
nguyên liệu trong quá trình bảo quản 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina 15
2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng 15
2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật 15
2.3.4. Phương pháp thu sinh khối 16
2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử 16
2.3.6. Phương pháp đông khô 17
2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska 17
2.3.8. Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên

tục…………………………………………………………………………… 18
2.3.9. Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất 21
3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất 21
3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường
nuôi cấy 23
3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu
nguyên liệu trong quá trình bảo quản 26
3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy 26
3.2.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản B. clausii 30
3.2.3. Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9% 33
3.2.4. Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản
phẩm tạo thành 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38








DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADN : Acid Deoxyribo Nucleic
ARN : Acid Ribonucleic
ATCC : American Type Culture Collection
(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì)
B. cereus : Bacillus cereus
B. clausii : Bacillus clausii

B. subtilis : Bacillus subtilis
Cfu : Colony - Forming Units (số đơn vị khuẩn lạc)
DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zelkulturen Gmbh
(Kí hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và
tế bào của Đức)
FAO : Food and Agriculture Organization
(Tổ chức nông lâm thế giới)
MT1 : Môi trường canh thang
OD : Optical Density (mật độ quang)
TB : Tế bào
V
/
P
: Vòng/phút
VSV : Vi sinh vật
WHO : World Health Organization
(Tổ chức y tế thế giới)








DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
TÊN BẢNG

Trang
2.1
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
13
2.2
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
14
3.1
Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ
quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska
22
3.2
Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii
trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ
glucose khác nhau
24
3.3
Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi
xử lý
27
3.4
Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska
28
3.5
Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska
sau các khoảng thời gian bảo quản
31
3.6
Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1
tháng bảo quản

32
3.7
Số lượng B. clausii sống sót tại các thời điểm trong quá trình bảo
quản
34
3.8
Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các
nồng độ pha loãng
36




DANH MỤC CÁC HÌNH

STT
TÊN HÌNH
Trang
1.1
Sản phẩm chứa B. clausii
5
1.2
Vi khuẩn B. clausii
6
1.3
Cấu tạo bào tử vi khuẩn
10
1.4
Sự hình thành bào tử
11

2.1
Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục
16
3.1
Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu
thụ của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy
24
3.2
Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các
mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau
28
3.3
Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính
100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng)
32
3.4
Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên số lượng VSV sau các khoảng
thời gian bảo quản
34
3.5
Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii
36
1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên
phục vụ cuộc sống đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các sản phẩm men vi sinh
(probiotic). Các chủng probiotic được sử dụng rất đa dạng. Các loài được nghiên

cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus
coagulans và Bacillus licheniformis bởi các ưu điểm riêng biệt của nó. Đó là khả
năng sinh bào tử, bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để chúng có thể tồn
tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng thành
sẽ bị giết chết [28].
Chế phẩm Enterogermina là một chế phẩm chứa Bacillus clausii dưới dạng bào
tử đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy,
khi ở dạng bào tử, lợi khuẩn B. clausii có thể an toàn vượt qua môi trường acid khắc
nghiệt của dịch dạ dày và đến được ruột với tỷ lệ sống cao hơn hẳn các loại lợi
khuẩn thông thường khác. Men vi sinh dạng bào tử lợi khuẩn B. clausii sẽ giúp bổ
sung các vi khuẩn có lợi lập lại sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, giúp phòng
ngừa và điều trị hiệu quả các rối loạn tiêu hóa. Trên thực tế, việc sản xuất ra nguyên
liệu chứa bào tử gặp rất nhiều vấn đề. Đó là phải thu được lượng bào tử tối đa và
tinh khiết không còn lẫn tế bào chất hay xác tế bào từ sinh khối thu được sau khi
nuôi cấy. Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng
bào tử” được thực hiện để giải quyết vấn đề trên với 2 mục tiêu sau:
1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất.
2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu
nguyên liệu trong quá trình bảo quản.




2



CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Định nghĩa

Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc,
"biotic" hay "biosis" từ chữ "life" là đời sống, và "pro" là thân thiện, nên probiotic
có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn,
đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích [27], [40].
Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh
được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật
đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc ở
Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên
nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông
báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể
nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về
probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về
probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp
được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối
tượng khác [41]. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu
những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là
những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với
mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ [41]. Vì vậy,
khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào
cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn
bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống
đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh
đường ruột” [35].
Theo định nghĩa của FAO và WHO năm 2002 “Probiotic là những vi sinh vật
sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức
3



khỏe vật chủ” [32], [41]. Nhưng không phải tất cả các vi sinh vật đều có thể đến

được vị trí tác dụng tạo ra hiệu quả. Trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải
đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các
sản phẩm probiotic phải chứa ít nhất 10
6
cfu/ml tế bào VSV sống cho đến hết ngày
hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị [22], [32].
1.1.2. Vai trò
 Điều trị một số bệnh tiêu hóa ở người
- Ngăn chặn bệnh tiêu chảy:
Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên
quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người du lịch và
tiêu chảy do không dung nạp lactose. Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng
chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn
Lactobacillus rhammosus GG và nấm men Saccharomyces boulardii [33]. Các tác
nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus plantarum… [12], [33].
- Tác dụng lên Helicobacter pylori:
Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm rất phổ biến trong dạ dày. Khoảng
50% dân số thế giới bị nhiễm vi khuẩn này. Sự tồn tại lâu dài của vi khuẩn này
trong dạ dày có thể là yếu tố tiềm tàng gây ung thư dạ dày [6]. Đã có nhiều phương
pháp dung để loại bỏ sự nhiễm H. pylori, trong đó có việc sử dụng các chế phẩm có
hoạt tính probiotic. Liệu pháp sinh học này thường được sử dụng như một chất bổ
sung cho các liệu pháp sử dụng kháng sinh truyền thống trong việc điều trị bệnh.
Các thử nghiệm y khoa đã xác nhận tỷ lệ chết của vi khuẩn H. pylori tăng lên khi
điều trị bằng phương pháp kháng sinh kết hợp với probiotic.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột.
Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây
cản trở cho hoạt động tiết ra enzym của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự
dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
4

những loại thức ăn có chứa nhiều lactose, làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn
gây hại [26].
 Hạ cholesterol máu:
Các bệnh về van tim thường liên quan đến lượng cholesterol cao trong huyết
thanh. Các nghiên cứu của Hepner và cộng sự (1979) khi nghiên cứu những người
khỏe mạnh không có tiền sử mắc bệnh tim mạch ăn bổ sung yogurt có chứa
Lactobacillus acidophilus kết quả cho thấy nồng độ cholesterol trong huyết thanh
giảm rõ rệt.
 Chống lại tác nhân gây ung thư:
Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác
nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như
nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải
phóng flavonoid, sản xuất các chất chống oxi hóa… [38].
 Một số tác dụng khác
+ Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ
thể, cung cấp nhiều chất quan trọng của cơ thể như (acid folic, niacin, riboflavin,
vitamin B6 và B12).
+ Giảm nguy cơ sỏi thận do ảnh hưởng đến sự bài tiết oxalat trong nước tiểu,
do đó giảm sự hình thành sỏi [24].
+ Tăng cường miễn dịch: vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch:
miễn dịch đặc hiệu (tăng sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho)
và miễn dịch không đặc hiệu – miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại
thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [27], [32].
1.1.3. Probiotic từ bào tử
Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm
bổ sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh
tranh với vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và

dùng để phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam,
5



nhiều sản phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các
loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus
cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis. Sản phẩm đầu tiên chứa bào
tử của vi khuẩn B. clausii là Enterogermina được sản xuất tại Ý (năm 1958) [21].
Các ưu điểm của probiotic từ bào tử:
+ Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở
điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.
+ Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ
dày [14], [36], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt
[39]. Chính vì vậy một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời
hạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào
ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng.
+ Kháng đa kháng sinh (đặc biệt là Bacillus clausii trong chế phẩm
Enterogermina) [30], [37].
+ Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,
các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B.
licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau.


Hình 1.1. Sản phẩm chứa B. clausii
1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii
Theo khóa phân loại của Bergey (1994) B. clausii thuộc:
6

Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus clausii
Bacillus clausii cũng như các loài trong chi Bacillus có thể hình thành bào tử,
có nghĩa là tạo ra một vách dày bao quanh ADN và các cấu trúc nội tế bào của
chúng. Do đó chúng rất khỏe mạnh và không bị phá hủy bởi nhiệt độ khắc nghiệt,
hóa chất, các yếu tố môi trường, thậm chí một số loại bức xạ. Đây là đặc tính rất tốt
để sử dụng trong công nghiệp và bào chế dược phẩm.
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành chuỗi, là vi
khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục. Bacillus
clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm [9].

Hình 1.2. Vi khuẩn B. clausii
1.2.2. Cấu trúc bộ gen
B. clausii có cấu trúc bộ gen là một vòng tròn nhiễm sắc thể, nhiễm sắc thể này
gồm 4.303.871 nucleotid, gen này chứa 4.204 gen, trong đó 4.096 là protein mã hóa
và mã hóa cho 96 ARN.
Các nucleotid loại cytosin và guanin trong ADN của B. clausii chiếm tỷ lệ cao
nhất so với Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM-K16 và chiếm khoảng 42,8 -
45,5% với chủng DSM 8716 [9], [29].
7



1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn B. clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột
nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho phản ứng

oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit [29].
1.2.4. Đặc điểm sinh thái
B. clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất sét
(B. clausii ATCC 31084, B. clausii DSM 8716…) [29]. Ngoài ra có thể tìm thấy B.
clausii ở trong nước, trong bùn (B. clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng
ven biển phía đông Ấn Độ) [13].
1.2.5. Điều kiện nuôi cấy
B. clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình nuôi cấy cần cấp khí.
Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC [29]. Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích
hợp khác nhau, ví dụ: chủng B. clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30ºC,
chủng B. clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40ºC…
Khoảng pH nuôi cấy thích hợp từ 7-10. Chủng B. clausii KSM-K16 có pH thích
hợp là 9,0.
Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon bao gồm: L-aribose,
xylitol, galactose, dulcitol, sorbitol, methyl AD-mannoside, mannose, N-
acetylglucosamine, D-tagose, 2-ketogluconate [29].
1.2.6. Ứng dụng của B. clausii
Bacillus clausii là vi khuẩn an toàn, có ứng dụng chủ yếu trong chế phẩm
probiotic và sản xuất enzym đặc biệt là protease.
 Chế phẩm probiotic
Nghiên cứu của Marseglia và đồng sự năm 2007 chỉ ra rằng Bacillus clausii
không gây nên tác dụng phụ và độc tính đối với trẻ em trong quá trình điều trị [25].
Bacillus clausii là loài vi khuẩn hiếu khí, có khả năng tạo bào tử và bền vững
trong môi trường acid của dịch vị dạ dày, vì thế sẽ đi qua dạ dày một cách an toàn;
8



tới ruột nảy mầm thành vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa ngay cả khi có mặt các
kháng sinh như ampicillin, cephalosporin, erythromycin, lincomycin và

chloramphenicol [15], [19].
Việc uống đủ một lượng nhất định bào tử sống sẽ giúp tạo ra hệ vi khuẩn có lợi
cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm chất dinh dưỡng. Bacillus clausii là lợi khuẩn không
sản sinh bất cứ độc tố hay chất nào gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người sử
dụng. Vì vậy Bacillus clausii thường được dùng làm thực phẩm chức năng để bổ
sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, giúp phòng ngừa và phối hợp điều trị rối
loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng kháng sinh kéo dài
[20].
Một số chế phẩm probiotic chứa B. clausii như: Enterogermina, Erceflora,
Bazivic, Enterobio, Spobio CL giúp hỗ trợ đắc lực cho đường tiêu hóa.
 Sản xuất enzym
+ Một số chủng B. clausii ví dụ: B. clausii KSM-K16 được sử dụng trong sản
xuất protease đặc biệt hữu ích, đó là M, H và N-protease. Protease là một enzym
quan trọng chiếm trên 65% thị trường các enzym công nghiệp. Protease có ứng
dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da… [31].
Cũng giống như các sinh vật Bacillus khác, B. clausii KSM-K16 tiết ra protease
trực tiếp vào môi trường, đặc biệt là trong thời kỳ dinh dưỡng thấp, cùng với quá
trình hình thành bào tử. Hoạt tính enzym M-protease đạt được ở 55ºC và pH là 12,3
[34].
1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii
Trên thế giới:
+ Gabriella Casuala and Simon M. Cutting tiến hành nghiên cứu tác dụng của
Enterogermina tới thành ruột của chuột cho thấy chế phẩm Enterogermina chỉ trong
thời gian ngắn đã gây đáp ứng miễn dịch ở chuột và loại bỏ vi khuẩn gây bệnh trong
thành ruột của chuột [15].
9



+ Bacillus clausii còn được chứng minh có tác dụng tích cực, giúp điều hòa

miễn dịch với trẻ em bị dị ứng và nhiễm trùng đường hô hấp tái phát [16], [17].
+ Nghiên cứu của Kobayashi cho kết quả enzym M-protease sinh ra từ B.
clausii KSM-K16 có khả năng chịu nhiệt và tồn tại được ở pH cao [23].
Tại Việt Nam:
+ Trong tạp chí khoa học của đại học Huế năm 2010 đã đưa ra B. clausii B2/2
có khả năng bám dính đồng thời với vi khuẩn B. cereus và B. clausii B1 không bám
dính với B. cereus nhưng lại bám dính với Escherichia coli [3].
+ Tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy vi
khuẩn B. clausii [9].
+ Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền cho kết quả 4 ngày là thời điểm
Bacillus clausii hình thành bào tử nhiều nhất [5].
+ Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Ngọc Bích cho thấy xử lý sinh khối B. clausii
bằng lysozyme thu được lượng bào tử tinh khiết và lớn [1].
1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN
Bào tử (nha bào – spore – endospore): một số vi khuẩn vào cuối thời kì sinh
trưởng khi điều kiện phát triển không thuận lợi sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể
nghỉ có dạng hình cầu hay elipsoic, có bề mặt tích điện âm và hơi kỵ nước, được gọi
là bào tử. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi điều kiện thuận lợi bào tử nảy
mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng [4], [11], [18].Vi khuẩn có khả năng tạo
bào tử thông thường thuộc hai chi là Bacillus và chi Clostridia kỵ khí bắt buộc, mặc
dù nhiều chi khác ít được biết đến hơn cũng có những vi khuẩn tạo bào tử.





10

Hình 1.3. Cấu tạo bào tử vi khuẩn [11]
Cấu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa
ADN, ADN nằm trong thể bào tử chất trong cùng, màng bào tử bao ngoài bào tử
chất, tiếp đến là thành bào tử, tiếp theo là vỏ bào tử, rồi đến áo bào tử hai lớp và áo
ngoài. Các lớp bao bọc chiếm 50% thể tích của nha bào, bao bọc bào tử chất và
nhân [11].
Màng bào tử rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein.
Vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt các lớp này xù xì, thành phần hóa học của các
lớp vỏ bao là protein, hydratcacbon, lipid, peptidoglycan và calci dipicolinat (Ca –
DPA), không chứa acid teichoic và có sự tham gia của keratin. Đây là những lớp có
khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước, chúng
có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi [7], [18].
Bào tử chất và vùng nhân bào tử tạo thành một khối tế bào đồng nhất. Trong
các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất vì vậy có thể giữ trạng thái tiềm sinh
trong nhiều năm [7].
Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp cùng với Ca – DPA [4], [11].


11



1.3.1. Quá trình hình thành bào tử


Hình 1.4. Sự hình thành bào tử
Pha 1: Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng
biệt.
Pha 2: Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không

đều nhau.
Pha 3: Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất.
Pha 4: Vỏ bào tử được hình thành.
Pha 5: Áo bào tử được hình thành.
Pha 6: Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử.
Quá trình hình thành bào tử mất khoảng 6 – 8 tiếng, là quá trình tương đối phức
tạp để tạo ra được cấu trúc vững bền, chịu được các điều kiện khắc nghiệt [11].
1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng
Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm
thấu. Bào tử của vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum đun sôi ở 100ºC
trong 5,0 – 9,5 giờ mới chết, hấp ở 121ºC sau 10 phút mới chết [11].
12



Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những thông
báo tìm thấy được những bào tử trong các tiêu bản khảo cổ cách đây 3000 năm mà
vẫn duy trì sự sống.
Bào tử có khả năng đề kháng mạnh với điều kiện khắc nghiệt của môi trường
nhờ:
- Phức hợp acid dipicolinic-calcium có thể ổn định thành phần acid nucleic của
bào tử.
- Nước trong bào tử ở trạng thái liên kết nên không thể làm biến tính protein khi
tăng nhiệt độ môi trường.
- Các enzym và chất hoạt động sinh học trong bào tử đều tồn tại ở trạng thái
không hoạt động nên hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với môi trường ngoài.
- Với cấu trúc có nhiều lớp màng bọc và tính ít thấm của các lớp màng, làm cho
các hóa chất độc, chất sát trùng khó có thể xâm nhập vào và gây tác động cho bào
tử.
Khi gặp điều kiện thuận lợi và được hoạt hóa bởi một số yếu tố làm tổn thương

các lớp bao như nhiệt độ cao, hóa chất (acid, các chất chứa nhóm –SH tự do) thì vỏ
bào tử bị phân hủy, bào tử hấp thụ nước, phục hồi hoạt động trở thành tế bào sinh
dưỡng [11].
Do những đặc điểm nổi trội đó mà ngày nay rất nhiều sản phẩm probiotic được
sản xuất từ bào tử vi khuẩn như: Progemila, Probacin, Bazivic, Anabio…






13



CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng vi sinh vật: Bacillus clausii
Nguồn gốc: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi-Aventis
 Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất pha môi trường
Hóa chất sử dụng thu bào tử
Hóa chất
Xuất xứ
Hóa chất
Xuất xứ
Pepton
Ấn Độ

Lysozym
Viện kiểm nghiệm
Cao thịt
Merck – Đức
KH
2
PO
4
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
NaOH
Trung Quốc
Thạch bột
Việt Nam
KCl
Trung Quốc
Glucose
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
 Các dung dịch sử dụng trong đề tài: Pha theo DĐVN IV [2].
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,6:
Pha dung dịch KH
2
PO
4
0,2M (100ml): 0,2 × 0,1 × 136 = 2,72 g
Pha dung dịch NaOH 0,2M (100ml): 0,2 × 0,1 × 40 = 8,0 g
Trộn 50,0ml dung dịch KH

2
PO
4
0,2M với 42,8ml dung dịch NaOH 0,2M rồi thêm
nước vừa đủ 200ml.
- Dung dịch KCl 1M: Hòa tan 7,45g KCl trong vừa đủ 100ml nước.
- Dung dịch NaCl 1M: Hòa tan 5,84g NaCl trong vừa đủ 100ml nước.
- Dung dịch lysozym 1mg/ml: Hòa tan 0,100g lysozym trong vừa đủ 100ml
nước cất tiệt trùng.
- Dung dịch NaCl 0,9%: Hòa tan 9,0g NaCl trong vừa đủ 100ml nước.
- Ngoài ra còn 1 số dung dịch: Na
2
S
2
O
3
0,1M, dung dịch đỏ Fuchsin, dung dịch
Xanhmethylen, dung dịch HCl 0,5%, dung dịch H
2
SO
4
1%.
14



2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
 Môi trường canh thang (MT1)
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g

NaCl 0,5g
Nước máy vđ 100ml
 Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + 1,8g thạch
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Tủ cấy vô trùng
Bioair (Italy)
Tủ ấm
Memmert (Đức)
Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh
Toshiba (Nhật)
Tủ sấy
Memmert (Đức)
Tủ lắc
Bioshake (Đức)
Máy ly tâm
Rotofix (Đức)
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP – Nhật
Máy vortex
IKA (Đức)
Lò vi sóng
Daewoo (Hàn Quốc)
Cân kĩ thuật
Đức
Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu

côn, pipet, cốc có mỏ, ống ly tâm, giấy
lọc…

15



2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất
 Xác định thời điểm hình thành lượng sinh khối và bào tử nhiều nhất
 Khảo sát sự sinh trưởng của VSV khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy
2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu
nguyên liệu trong quá trình bảo quản
 Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy
 Lựa chọn điều kiện bảo quản B. clausii
 Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9%
 Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm
tạo thành
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina
Pha 100ml môi trường canh thang (MT1) (theo mục 2.1.2) trong bình nón dung
tích 250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20
phút, để nguội. Tiến hành cấy giống B. clausii từ chế phẩm vào bình nón trong tủ
cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở 37ºC, với tốc độ 110
v
/p
trong 24 giờ.
Sau 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường.
2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng
Chuẩn bị 100ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml. Hấp

tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút. Cấy 10ml dung dịch giống đã được hoạt hóa vào.
Ủ trong máy lắc 37ºC với tốc độ 110
v
/
p
trong các thời gian xác định. Sau đó tiến
hành xử lý mẫu sau thời gian thích hợp.
2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật
Nguyên tắc:
Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi
trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa vi sinh vật trong nước tỷ lệ
tuyến tính với độ đục của môi trường. Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng
máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm [4].
16




Hình 2.1. Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục [4]
Tiến hành:
Vi khuẩn được nuôi cấy trong dung dịch môi trường sẽ phát triển, tăng sinh
khối. Hỗn dịch tế bào vi khuẩn trong các bình nón được ly tâm với tốc độ 4000
v
/
p

trong 15 phút. Pha loãng hỗn dịch chứa vi sinh vật bằng NaCl 0,9% đến nồng độ
thích hợp sao cho khi đo trên máy so màu ở bước sóng thích hợp được các trị số OD
nhỏ hơn 1. Lấy mẫu tiến hành đo quang với bước sóng 600nm.
Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử.

2.3.4. Phương pháp thu sinh khối
Hỗn dịch tế bào vi khuẩn trong các bình nón sau khi nuôi cấy theo phương
pháp đã nêu trong mục 2.3.2 được ly tâm với tốc độ 4000
v
/
p
trong 15 phút. Thu và
hòa cắn trong NaCl 0,9% để rửa sạch môi trường nuôi cấy, ly tâm lặp lại 3 lần.
2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử
Tiến hành xử lý nhiệt dịch nuôi cấy VSV bằng cách đun cách thủy ở 100ºC/1h.
Phá vỡ màng tế bào bằng lysozym [1]:
+ Ly tâm dịch sau khi xử lý nhiệt, thu cắn (4000
v
/
p
trong 15 phút).
+ Cắn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng 15-
20ml dung dịch lysozym (1mg/ml), ủ 37ºC trong 120 phút để phá vỡ vỏ bọc tế bào,
giải phóng bào tử.
+ Ly tâm dịch thu cắn ( 4000
v
/
p
trong 15 phút).
17



+ Hòa cắn trong 30ml dung dịch KCl 1M để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn
(4000

v
/
p
trong 15 phút).
+ Tiếp tục hòa cắn trong 30ml dung dịch NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bào,
ly tâm dịch thu cắn (4000
v
/
p
trong 15 phút).
+ Thu cắn và rửa bằng nước cất 3 lần thu được bào tử.
2.3.6. Phương pháp đông khô
a. Chuẩn bị mẫu
Nuôi cấy VSV (như phương pháp nêu ở mục 2.3.2). Ly tâm thu sinh khối (4000
vòng/phút), rửa sinh khối nhiều lần bằng nước cất đã hấp tiệt trùng. Sinh khối thu
được hòa vào khoảng 10-15ml nước cất tiệt trùng. Đổ hỗn dịch này ra các đĩa petri
đã được làm sạch và hấp tiệt trùng từ trước, đậy kín bằng giấy nhôm [6].
b. Tiền đông
Cho mẫu vào trong tủ lạnh sâu -80ºC cho tới khi mẫu đông rắn hoàn toàn [6].
c. Làm khô
Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô nhiệt độ
khoảng -50ºC, 0,055 mbar.
Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị chuyển vào bao polymer,
lấy mẫu xác định số vi sinh vật sống sót hoặc đậy kín rồi bảo quản trong tủ lạnh ở
nhiệt độ 4-6ºC [6].
2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska
Nguyên tắc:
Màng bào tử: dày, chắc, chứa nhiều lipid khó bắt màu nên phải xử lý để tế bào
chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của tế bào
và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào đi

nhuộm bằng thuốc nhuộm màu. Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bào có
màu phân biệt [5].