Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến lượng sinh khối của saccharomyces boulardii

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI








BICH THARATH

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA
MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG ĐẾN
LƢỢNG SINH KHỐI CỦA
Saccharomyces boulardii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


HÀ NỘI – 2015




BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BICH THARATH

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA
MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG ĐẾN
LƢỢNG SINH KHỐI CỦA
Saccharomyces boulardii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược



HÀ NỘI – 2015




LỜI CẢM ƠN

Vơi sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành đếnThS. Kiều Thị Hồng vàTS. Đàm Thanh Xuân, người thầy đã tận
tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đếnDS.Lê Ngọc Khánh, cùng các

thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, đóng
góp ý kiến quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị kỹ
thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy
cô giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và
hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên


BICH THARATH









MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1.Probiotics 3

1.1.1.Khái niệm probiotics 3
1.1.1.1. Lịch sử probiotics 3
1.1.1.2. Các vi sinh vật được sử dụng làm probiotics 4
1.1.2. Phân bố 5
1.1.2.1. Trong thiên nhiên 5
1.1.2.2. Trong đường tiêu hóa của con người 6
1.1.3. Vai trò của probiotics 7
1.1.3.1. Vai trò của probiotics trong tiêu hóa thức ăn 7
1.1.3.2. Probiotics và bệnh tiêu chảy 7
1.1.3.3. Probiotics và sự kích thích hệ miễn dịch 8
1.1.3.4. Một số tác dụng khác của probiotics 8
1.2. Nấm men 9
1.2.1. Đặc điểm chung của nấm men 9
1.2.2. Vai trò của nấm men 11
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men 11
1.2.4. Đặc điểm S. boulardii 14
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điềukiện
nuôi cấy thu sinh khối tế bào 15
1.2.5.1. Môi trường nuôi cấy 15
1.2.5.2. Nhiệt độ 17
1.2.5.3. pH của môi trường 17
1.2.5.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn 18
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19




2.1. Nguyên liệu và thiết bị 19
2.1.1. Nguyên liệu. 19
2.1.2. Thiết bị 19

2.1.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men 20
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S. boulardii. 21
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng đến lượng sinh
khốinấm men S. boulardii. 21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 21
2.3.2. Phương pháp nhân giống 21
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu dịch lên men 22
2.3.4. Phương phápthu sinh khối 22
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23
3.1. Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men S. boulardii 23
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các môi trƣờng dinh dƣỡng lƣợng sinh khối
nấm men S. boulardii 24
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn hydrat cacbon đến lượng sinh khối
nấm men S.boulardii 24
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ đường glucose đến lượng sinh
khối nấm men S. boulardii 26
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn nitơ đến lượng sinh khối nấm men
S.boulardii 27
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ cao nấm men đến lượng sinh 28
khối nấm men S. boulardii 28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông Lương thế giới
WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế thế giới
S. boulardii Saccharomyces boulardii
NKC (Natural Killer Cell) Tế bào NK
IgA (Immunoglobulin A) IgA
IgM (Immunoglobulin M) IgM
IgG (Immunoglobulin G) IgG
PMN(Poly Morphonuclear Neutrophil) Bạch cầu đa nhân trung tính

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1. Một số tác động tăng cường hệ miễn dịch của probiotics ở người.
2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu.
2.2. Thiết bị, dụng cụ.
3.1. Khối lượng sinh khối nấm men S. boulardii thu được từ 20 ml môi
trường nuôi cấy tại các thời điểm đã cố định.
3.2. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
hydratcacbon.
3.3. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ của đường glucose.
3.4. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
nitơ.
3.5. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ của cao nấm men.

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1. Phân bố vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người.
1.2. Hình ảnh tế bào S. Boulardii qua kính hiển vi điện tử.
3.1. Đường cong sinh trường biểu diễn khối lượng sinh khối nấm men S.
boulardii thu được từ 20 ml môi trường nuôi cấy theo các thời điểm đã cố
định.
3.2. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
hydratcacbon.
3.3. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ đường glucose.
3.4. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
nitơ.
3.5. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ cao nấm men.









1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Cuộc sống của con người ngày càng được hoàn thiện nhờ sự phát triển
của khoa học công nghệ. Cùng với sự phát triển chung của công nghệ, công
nghệ sinh học cũng đang phát triển mạnh mẽ và được coi là ngành khoa học

của thế kỷ XXI. Công nghệ sinh học đã mang lại những hiệu quả to lớn cho
con người, đặc biệt trong lĩnh vực y tế, sức khỏe.
Hiện nay các chế phẩm sinh học được sản xuất và sử dụng ngày càng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Giáo sư Miqinihafu thuộc viện
nghiên cứu Pasteur phát hiện ra rằng: “Nếu cơ thể hấp thu loại vi khuẩn đặc
biệt nào đó thì có thể ức chế sự sinh sôi của các vi khuẩn có hại trong ruột,
tránh việc sản sinh ra chất độc. Như vậy không những khó mắc bệnh mà còn
có thể tránh lão hóa và kéo dài tuổi thọ”.Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ
ra rằng các vi sinh vật có lợi có tác động trong việc cải thiện tiêu hóa, mang
đến nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.Ngoài ra, những vi sinh vật này còn
đóng vai trò trong việc cải thiện khả năng miễn dịch, sức khỏe tim mạch,
giảm nguy cơ ung thư
Probiotics từ lâu đã được biết đến là những vi khuẩn có lợi, sống và
giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột. Chúng có nhiều ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực như dược phẩm, chăn nuôi, thực phẩm Trong lĩnh vực dược phẩm
probiotics chủ yếu được sử dụng chữa trị các bệnh đường tiêu hóa, trong đó,
nấm thuộc chủng S. boulardii, có vai trò ngăn chặn và hạn chế sự hoạt động
của vi khuẩn bệnh như E. coli, Shigella và Samonella. Đặcbiệt S. boulardii là
loại probiotic an toàn, chịu nhiệt, có năng lực sống trong ống tiêu hoá, kháng
lại kháng sinh, phát triển nhanh trong một thời gian ngắn.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về nuôi cấy nấm men S.
boulardii còn ít,vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng
2



củamôi trƣờng dinh dƣỡng đến lƣợng sinh khối của Saccharomyces
boulardii”, với 2 mục tiêu là :
1. Xây dựng đường cong sinh trưởng củanấm men S. boulardii.
2. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn và các nồng độ của môi trường dinh

dưỡng đến lượng sinh khốinấm men S. boulardii.












3



CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Probiotics
1.1.1 Khái niệm probiotics
1.1.1.1.Lịch sử probiotics
Probiotics là thuật ngữ tương đối mới có nghĩa là “cho sự sống”, nó
được dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con
người và vật chủ[11].
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người
không phải là mới. Hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra
thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật
sống có lợi như các sản phẩm sữa lên men, đậu tương lên men Các nhà khoa
học đầu tiên, như Hippocrates và một số nhà khoa học khác cũng chỉ định sữa
lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó để chữa trị rối loạn ruột và

dạ dày[17].
Tuy nhiên phải tới đầu thế kỉ XX những nguyên cứu đầu tiên về vai trò
của một số vi khuẩn mới được tiến hành bởi Eli Metchnikoff. Ông đã đưa ra ý
kiến rằng: “Sự phụ thuộc của các vi khuẩn đường ruột vào thức ăn sẽ làm
đường ruột có thể dung nạp ở mức độ nào đó việc thay đổi các hệ vi khuẩn
trong cơ thể và thay thế các vi khuẩn có hại bằng các vi khuẩn có
lợi”[13],[17].
Vào thời điểm này Henry Tissier, một bác sỹ nhi khoa người Pháp nhận
thấy trẻ em bị tiêu chảy thường có một lượng nhỏ vi khuẩn hình chữ Y trong
phân. Những vi khuẩn này trái lại có số lượng lớn ở những đứa trẻ khỏe
mạnh. Ông đã đề xuất sử dụng hệ vi khuẩn này cho những bệnh nhân tiêu
chảy để giúp họ có được đường ruột khỏe mạnh.
Những công trình nghiên cứu của Metchnikoff và Tissier là những
nghiên cứu đầu tiên đưa ra giả thiết khoa học về việc dùng vi khuẩn một cách
4



hữu ích. Vào năm 1960 thuật ngữ probiotics mới được đề xuất để đặt tên cho
các chất do vi khuẩn sản sinh ra để thúc đẩy sự phát triển của các hệ vi cơ
khác. Để chỉ ra bản chất vi khuẩn của probiotics, Fuller (1989) đã định nghĩa
lại thuật ngữ này: “Probiotics là các sinh vật sống khi bổ sung theo đường tiêu
hóa có ảnh hưởng tích cực đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng đường
ruột của chúng”. Một định nghĩa gần tương tự đã được đề xuất bởi Havenaar
and Huis in „t Veld (1992): “Probiotics là các vi khuẩn đơn lẻ hoặc hỗn hợp
các vi khuẩn còn sống sót khi được dùng cho người hoặc động vật sẽ tác động
tích cực đến vật chủ bằng cách cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột”. Một định
nghĩa gần đây hơn nhưng chưa phải là cuối cùng: “Probiotics là các vi sinh
vật sống khi được dùng với số lượng thích hợp sẽ mang lại những lợi ích về
mặt sức khỏe cho vật chủ”.

Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) đã định nghĩa về probiotics như sau: “Hệ vi sinh vật sống khi được
dùng với số lượng thích hợp sẽ đem lại những lợi ích cho sức khỏe vật chủ”.
Số lượng thích hợp là năm tỷ đơn vị khuẩn lạc một ngày (5x10
9
CFU/ngày)
và được khuyến cáo là nên dùng liên tiếp trong năm ngày(FAO/WHO 2002).
Vi khuẩn chết, những sản phẩm chiết xuất từ vi khuẩn hay sản phẩm
trong quá trình tăng trưởng của vi khuẩn có thể có những tác động có lợi
nhưng không được xem như probiotics vì chúng không còn sống khi được
dùng.
1.1.1.2. Các vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotics
Phần lớn các probiotics là nhóm vi khuẩn lactic: gồm 2 chi phổ biến là
chi Lactobacillus và Bifidobacterium[7], [12].
 Nhóm vi khuẩn không phải vi khuẩn lactic:
Chi Propionibacterium: P. freudenreichii, P. cyclohexanicum
Chi Bacillus: B. subtilis, B.clausii
5



Chi Brevibacillus:B. laterosporus
Chi Sporolactobacillus:S. laevolacticus
Chi Escherichia: E. coli
 Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces gồm có S.boulardii và
S.cerevisae [7], [6].
1.1.2. Phân bố
1.1.2.1.Trong thiên nhiên
Trong tự nhiên probiotics có thể tồn tại ở bất kì đâu nhưng chúng tồn
tại nhiều trong các sản phẩm lên men như rau củ quả muối, sữa chua, rác

thải
Muối rau quả được xem như là một phương thức hữu hiệu bảo quản
thực phẩm bởi trong qua trình lên men tự phát rau củ quả, các vi khuẩn acid
lactic giữ vai trò lên men đường tạo acid lactic nâng cao độ ổn định của sản
phẩm, ngoài ra nhóm vi khuẩn này còn làm tăng lượng vitamin và sinh khả
dụng của vitamin giúp tiêu hóa thức ăn tốt hơn. Các loại rau củ quả hay dùng
để muối dưa là loại chứa lượng lớn các loài vi khuẩn có lợi trong lên men như
dưa chuột, các loại rau cải, cà rốt, ớt Các loài vi khuẩn tìm thấy nhiều trong
quá trình lên men này là: Lactobacillus sp. (L. plantarum, L.brevis),
Leuconostoc sp.(L. mesenteroides) và Pediococcus sp.(P. pentosaceus, P.
Cerevisiae)[10].
Trong sữa chua cũng tồn tại nhiều chủng như: Lactobacillus sp.(L
.bulgaricus), Bifidobacterium sp. (B.bifidum)[18].
Các nhà khoa học cũng đã phân lập được probiotics từ thịt gia súc sống
chủ yếu là chi Lactobacillusgồm các loài như: Lactobacillus lactis,
Lactobacillusfermentum,Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus.
Dựa vào nghiên cứu này có thể sử dụng vi khuẩn lactic làm chất bảo quản thịt
mà giảm chất phụ gia độc hại [8].
6



Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh sữa mẹ cũng chứa probiotics
trong đó gồm nhiều chủng Bifidibacterium giúp cân bằng hệ khuẩn ruột và
phát triển hệ miễn dịch ở trẻ em bú mẹ [7], [19].
1.1.2.2. Trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời
Vi khuẩn probiotics cư trú thường xuyên trên cơ thể con người (cả
động vật bậc cao và côn trùng).Có hơn 400 loài vi khuẩn được tìm thấy trong
đường tiêu hóa,một nửa khối lượng của vật chất ở đại tràng là vi khuẩn với số
lượng gấp 10 lần số lượng của các tế bào mô tạo nên cơ thể. Thông thường dạ

dày chỉ có một số ít các vi khuẩn (10
3
CFU/ml dịch dạ dày), mật độ vi khuẩn
tăng dần lên theo đường tiêu hóa, mật độ cuối cùng ở đại tràng là 10
12
vi
khuẩn/g niêm mạc. Việc hình thành khuẩn lạc vi khuẩn được bắt đầu từ khi
những đứa trẻ mới sinh còn ở trong trạng thái vô trùng đến suốt cuộc đời và
thay đổi ở một mốc tuổi nào đó [15].

Hình 1.1.Phân bố vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người.
Hệvi khuẩn đường ruột là hệ sinh thái phong phú và biến đổi không
ngừng của các cộng đồng vi khuẩn đã thích nghi với việc sống trên bề mặt
niêm mạc ruột và trong nhung mao. Hệ vi khuẩn đường ruột gồm các loài tự
7



nhiên khu trú lâu dài ở đó và rất nhiều các loài khác nhau di chuyển tạm thời
qua đường ruột. Các loài tự nhiên tồn tại từ khi sinh ra còn các loài di động
được đưa vào từ môi trường bên ngoài qua thức ăn, nước uống… Các loài tự
nhiên gồm các loài thì thuộc chiLactobacillus(L. acidophilus, L. rhamnosus ),
chi Bifidobacterium (B. longum, B. animalis…).Các loài này được mô tả ở
hình 1.1, còn các vi sinh vật từ môi trường ngoài vào gồm rất nhiều loài, gồm
cả các loài khu trú sẵn trong đường ruột và các loài khác như Vibrio cholera,
chiBacillus (B. subtilis, B. anthracis ,gồm cả các loài có lợi và các loài gây
bệnh.
1.1.3. Vai trò của probiotics
1.1.3.1.Vai trò của probiotics trong tiêu hóa thức ăn
Mỗi phần của đường tiêu hóa chứa các vi khuẩn khác nhau và chúng có

những nhiệm vụ riêng biệt. Vi khuẩn sống trong đường tiêu hóa bao gồm cả
vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại, điều đó không có nghĩa là khi loại trừ hết
vi khuẩn có hại cơ thể sẽ khỏe mạnh mà sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và
vi khuẩn có hại mới đem lại sự khỏe mạnh tốt nhất.
Vikhuẩn có lợi là những vi khuẩn như: Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum và một số vi khuẩn
khác.Chúng giúp ta tiêu hóa thức ăn, cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và cạnh
tranh với vikhuẩn có hại. Những vi khuẩn có lợi có thể được bổ sung qua
đường uống[4].
1.1.3.2. Probiotics và bệnh tiêu chảy
Theo thống kê, bệnh tiêu chảy ở người do các nguyên nhân sau:
75 - 80%dovi khuẩn
10% do kí sinh trùng
5% do virus
5% là do các nguyên nhân khác.
8



Probiotics được chứng minh là có tác dụng trong năm loại tiêu chảy:
tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn, tiêu chảy do
nhiễm virus, tiêu chảy ở người du lịch, tiêu chảy do bất dung nạp lactose [6,
7].
1.1.3.3. Probiotics và sự kích thích hệ miễn dịch
Các nghiên cứu in vivo và in vitro cho thấy rằng một vài chủng
probiotics chuyên biệt có khả năng biến đổi chức năng hệ miễn dịch, kích
thích hệ miễn dịch kháng lại các bệnh truyền nhiễm và ung thư, điều hòa các
phản ứng miễn dịch quá mẫn như dị ứng [7].
Bảng1.1.Một số tác động tăng cường hệ miễn dịch của probiotics ở người.
Chức năng

Tác động
Miễn dịch
Tăng khả năng thực bào của bạch cầu đơn nhân và
bạch cầu đa nhân trung tính (PMN).
Tăng biểu hiện của receptor thực bào (CRI và CR3
trong PMN).
Tăng tế bào NK.
Tăng hoạt tính oxi hóa.
Tăng huyết thanh và lượng IgA niêm mạc.
Miễn dịch dịch
thể
Tăng huyết thanh và/hoặc đáp ứng kháng thể niêm
mạc (IgG, IgA hoặc IgM) đối với miễn dịch toàn
thân hay đường miệng (ví dụ như Rotavirus, S.typhi,
Polio và hib vaccine).
Tăng tế bào che giấu globin miễn dịch IgG, IgM,
IgA.


Sự sản xuất
cytokine
Tăng nồng độ IFN- trong máu.
Tăng hoạt tính của enzyme 2-5A-synthetase trong
các tế bào đơn nhân trong máu.
Tăng IFN-α trong huyết thanh.
Tăng sản xuất các tiền Cytokine và Cytokine kháng
viêm in vitro và invivo sau khi hoạt hóa bằng tác
nhân phân bào.
1.1.3.4.Một số tác dụng khác của probiotics
a) Giảm lipid máu

9



Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học đã chứng minh được
tác dụng hạ lipid máu của probiotics. Dựa trên những quan sát ở bệnh nhân sử
dùng sản phẩm sữa lên men và một báo cáo về sự đồng hóa cholesterol bởi
chủng L. acidophilus người ta đã đề xuất rằng probiotics có thể ảnh hưởng có
lợi lên chuyển hóa lipid.Vi khuẩn probiotics có thể lên men hydratcacbon
không thể tiêu hóa được và tạo ra các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những
chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol trong gan hoặc tái phân phối
cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm lượng lipid trong máu.
Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở sự hấp thucholesterol
từ đường ruột [6], [9].
b) Tác dụng ngăn ngừa ungthƣ
Tác dụng chống khối u của probiotics có thể do một số cơ chế sau: gắn
với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế các enzym tiền
ung thư như nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-
glucosidase-1 chất giải phóng flavonids, sản xuất các chất chống oxy
hóa [6].
1.2.Nấm men
1.2.1. Đặc điểmchung của nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào,
sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính
chủ yếu bằng hình thức nảy chồi.
Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như: trong đất,nước,lương
thực,thực phẩm ,đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt.
Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều
kiện dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác.
10

Nấm men thường có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces
boulardii,Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus…),hình tròn
(Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dưa chuột(Saccharomyces
pastorianus),hình một đầu nhọn(Brettanonyces),hình tam giác (Trigonopsis)
và một số hình đặc biệt khác.
Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi
gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả(pseudomycelium).Ở khuẩn ty
giả,các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty. Khuẩn
ty và khuẩn ty giả thường quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida,
Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung
cấp đủ oxy.
Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và
điều kiện ngoại cảnh.Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong
môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng.Trong điều kiện yếm khí thường có
hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn.
Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và
từng giai đoạn phát triển. Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn
một cách rõ rệt, kích thước trung bình (3 – 5) x (10 – 12)µm. Kích thước
chiều ngang tế bào nấm men giống Torulopsis là 5 – 8µm, ở một số loại men
rượu là 10 – 11 µm, men bia là 6 – 8µm, nấm men gia súc thường nhỏ hơn.
Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men, người ta
thường sử dụng môi trường mạch nha dịch thể với nồng độ đường khoảng 10
– 15
o
B (độ Baumê, đơn vị thường sử dụng để tính hàm lượng đường) hoặc
môi trường thạch mạch nha, thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 30
o

C.
Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào,
nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi
(glycogen, lipid, volutin…) [5].
11



1.2.2. Vai trò của nấm men
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất
giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B).Chúng có khả năng lên
men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điền
kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lượng sinh khối tế bào.
Quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra
chất độc gây hại cho sức khỏe của người và vật nuôi nên chúng được sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như: sản xuất rượu, bia, nước
giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir,
johur….cho người và thức ăn gia súc.
Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất
vitamin, enzym… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử
dụng như một công cụ đắc lực để mang các ADN tái tổng hợp phục vụ cho
việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại
[5].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
Nấm men là vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng hô hấp như một
cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô
hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên men.Khi phản ứng lên men bắt đầu, tốc độ
sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu
như không còn nữa.Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không
hết năng lượng những chất dinh dưỡng của môi trường. Vì quá trình phân hủy

một phân tử gram đường bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng 28kcal, trong
khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn một gram đường ta sẽ có 674 kcal.Qúa trình lên
men tạm gọi là quá trình phosphoryl hóa.Vì có sự tham gia một cách tích cực
của các hợp chất ATP, ADP.
12



Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề
mặt tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong.Màng và lớp bao bọc nguyên
sinh chất của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hòa các chất
dinh dưỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài. Các chất
dinh dưỡng sau khi được hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng
hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất như protein, glucid, lipid…[5].
Nguồn cacbon:
Trước hết phải kể đến các loại đường, đường glucose được tất cả các
loài nấm men sử dụng.Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc
chiCandida, Torulopsis có thể đồng hóa được đường pentose.Vì vậy, các men
này có thể nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu
hemicellulose. Những disaccharid (maltose và saccarose) trước khi được nấm
men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzym tương
ứng của nấm men.
Như là một quy luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn
cacbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ
được sử dụng trước.Đường glucose và fructose được sử dụng trước hết, kết
tiếp là các acid béo (phụ thuộc vào chủng loài nấm men và thành phần của
acid này), những chất có nhiều cacbon trong phân tử được sử dụng sau cùng.
Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của
nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng nấm men. Chúng
có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất.

Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy
nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây.Trong đó parafin có thể
là nguồn cacbon dinh dưỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida
và Torulopsis[5].

13



Nguồn nitơ
Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amin,thành phần
protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ.
Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat (trừ giống Hasenula và
Pichia).
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của
acid vô cơ cũng như hữu cơ.Đó là amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối
acetat, lactat, malat…Trong môi trường có muối amoni, đặc biệt là sulfat, thì
nấm men sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử
dụng và sẽ làm môi trường bị acid hóa, giảm pH.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, peptid,
nucleotid… Trong thực tế, người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch
thủy phân đậu tương làm nguồn nitơ hữu cơ.Nấm men tiêu hóa rất tốt các
amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein.Các
muối amoni được nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin.Trong quá trình
nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh
dưỡng.Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng được acid amin ở dạng L-acid amin.
Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt, trong môi trường nuôi cấy
nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ [5].
Các nguyên tố vô cơ:
Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho được

quan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh
Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoprotein,
acid nucleic, phospholipid…).Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định
trong các phản ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và
vận chuyển năng lượng.
14



Trong phòng thí nghiệm visinh, người ta thường dùng muối KH
2
PO
4
và
K
2
HPO
4
làm nguồn phospho và kali.Còn trong sản xuất, thường dùng dịch
chiết từ superphosphat làm nguồn phospho [5].
Các chất kích thích sinh trƣởng:
Để cho nấm men phát triển và lên men được bình thường cần phải có
các vitamin làm cofactor trong nhiều enzym của tế bào nấm men.Nấm men có
thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ
biotin.Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần phải bổ sung vitamin này.
Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là
6 vitamin nhóm B: inozit (vitamin B
8
), biotin (vitamin B
7

), acid pantotenic
(vitamin B
5
), thiamin (vitamin B
1
),pyridoxyn (vitamin B
6
),acid nicotinic
(vitamin B
3
).
Trong công nghiệp, thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao
nấm men, nước chiết cám, dịch thủy phân đậu tương, rỉ đường.Trong các thí
nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải,
cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường [5].
1.2.4. Đặc điểm S. boulardii
Được Herry Boulardii phát hiện vào năm 1923 trong vỏ trái cây chín, tế
bào có dạng hình tròn, bầu dục, kích thước (4–6)x (6–9) µm, sinh sản bằng
hình thức nảy chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí không bắt buộc.

Hình 1.2.hình ảnh tế bàoS. boulardii qua kính hiển vi điện tử
15



Có khả năng lên men đường glucose, saccharose, rafinose, xylose,
không lên men lactose, manitol, maltose , không hình thành hợp chất phân
giải tinh bột.
Là loài nấm men không mang mầm bệnh, được sử dụng như một chất
điều trị sinh học để ngăn cản bệnh tiêu chảy.

Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột tương tự vi
khuẩn lactic, S. boulardii còn có một ưu điểm vượt trội là khả năng đề kháng
với kháng sinh và sulfamid (trừ kháng sinh kháng nấm).
Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi
khuẩn gây viêm ruột kết tràng giả cũng như trung hòa được nội độc tố của
E.coli và Vibrio cholera nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính
[5].
1.2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong
điềukiện nuôi cấy thusinh khối tế bào
1.2.5.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn
hydratcacbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như
kali,natri,magie,canxi và vitamin.
Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất
tốt. Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải thủy
phân bằng acid hoặc enzym của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các
polysaccharid thành dạng đường mà nấm men đồng hóa được.
Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà
nguồn cacbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường
với nguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn.Một số giống nấm men phân
lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trường đường và môi
trường tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt.
16



Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số lượng nấm men có thểđạt
hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy [2].
Môi trường rỉ đường hoặc dung dịch đường được acid hóa với pH=4 ,
bổ sung thành phần dinh dưỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 30

o
C, lượng sinh khối
thu được khoảng 25 – 50g/l.
Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuôi cấp nấm
men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm
men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1,B1,B2,C,E,K và các chất kích thích tố
tăng trưởng khác.Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu có thể hạn
chế sự phát triển của nấm men.
Ngoài ra, môi trường thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm
rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy
nấm men.
Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng được môi trường dịch kiềm
sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đường
pentose.Người ta tính được rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất
giấy sẽ thải một lượng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 189 kg đường.Dịch này
hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy
tới 60% so với bình thường[3].
Hiện nay, môi trường được sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến
nhất vẫn là môi trường rỉ đường.90% lượng sinh khối nấm men dùng bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới được sản xuất từ rỉ đường mía và củ cải
đường.Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 –
40%.Trong đường mía chứa các chất sinh trưởng (biotin, acid pantotenic,
inozit) với hàm lượng lớn,nhưng chứa ít chất khoáng và các acid amin. Vì
vậy, khi sử dụng đường mía làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men cần phải
loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng
17



cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân

vào giai đoạn nhân giống. Lượng đường trong môi trường khoảng 2– 3%,
không nên nhiều hơn hay ít hơn.Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa
tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo
sinh khối.Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn cacbon cần thiết cho
sự tạo sinh khối. Một điểm đáng lưu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật
rỉ.Hệ keo có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin, nó thường có
độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện
tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém,dẫn đến hiệu suất sinh
khối thu được thấp.Các chất màu có trong rỉ đường như hợp chất caramen,
melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hưởng đến cảm
quan.Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì người ta phải xử lý rỉ đường
trước khi nuôi cấy [5].
1.2.5.2.Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và
phát triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 –
30
o
C, trên 43
o
C và dưới 28
o
C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng
hằn.
Ở 30
o
C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S.cerevisiae 2–3lần,
ở 35–38
o
C chúng phát triển nhanh hơn 6–8 lần.Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của
nấm men giảm nhanh, còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20–23

o
C, hạn chế được
mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn [5].
1.2.5.3. pH của môi trƣờng
pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích lũy
sinh khối giảm, pH=3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ
hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym, sự sinh