Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước

Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Đỏ THỊ LOAN
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI BẰNG
NƯỚC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC s ĩ
Người hướng dẫn :
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện :
Bộ môn Công nghiệp Dược
TRƯỜNG ĐH ĐƯỢC HÀ NỘI
/I
HÀ NỘI-2011
Trong qua trinh thuc hien de khoa luan nay, toi da nhan dugc sir
hirong dan va giiip da tan tinh ve moi mat tir cac thay c6 , ban be.
Nhan dip nay, toi xin dugc bay to long kinh trong va biet on sau sac ta i:
TS. Nguyen Van Han
Nguai thay da danh cho toi su huong dan, giup da quy bau. Toi cung
xin bay to long biet an sau sac doi vai sir giup da nhiet tinh cua cac Thay c6
giao, anh chi ky thuat vien a Bo mon Cong nghiep dugc, cac thay c6 trong
Ban giam hieu, Phong dao tao cung toan the cac thay c6, can bg trong truang
dai hoc Dugc Ha Ngi da tao mgi dieu kien giup da toi hoan thanh khoa luan.
Toi xin cam an gia dinh va ban be da dong vien, ho trg toi trong suot qua
trinh hgc tap va thirc hien khoa luan nay.
Ha Ngi, thang 05 nam 2011.
Sinh vien.
l 6 i c a m o n
Do Thi Loan
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

4
DANH MỤC CÁC BẢNG 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, sơ Đ ồ 5
ĐẶT VẤN ĐÈ 6
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 7
1.1. Tổng quan về add shikỉmỉc 7
1.1.1 Công thức hóa học, tính chất
7
1.1.2 Nguồn gốc acid shikimic 7
1.1.3 Vai trò acid shikimic : 9
1.2 Tồng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acỉd
shỉkỉmỉc từ đại hồi 13
1.2.1 Vài nét về cây đại hồi 13
1.2.2 Một số phương pháp chiết xuất, tinh chế acid shikimic từ đại hồi:. 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

18
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị : 18
2.1.1 Nguyên vật liệu và hóa chất:
18
2.1.2 Máy móc, thiết bị : 18
2.2 Nội dung nghiên cứu: 19
2.2.1 Khảo sát các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng tới hiệu suất chiết xuất: 19
2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế 19
2.3 Phương pháp nghiên cứu 19
2.3.1 Phương pháp chiết xuất 19
2.3.2 Phương pháp định lượng
20

2.3.3 Phương pháp tinh chế acid shikimic 22
CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1 Xác định hàm lượng acid shỉkimic trong đại hồi

23
3.2 Khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng đến qua trình chiết xuất

24
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước tiểu phân dược liệu

24
3.2.2 Khảo sát yếu tố nhiệt độ chiết xuấ'^ 26
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ DL/DM

28
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH 29
3.3 Xây dựng quy trình tinh chế 30
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO M
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt.
Cao lỏng SA/ MeOH : cao chứa shikimic acid trong methanol.
Dd: dung dịch.
DL/ DM: Khối lượng dược liệu / thể tích dung môi.
Dm: dung môi.
Dung dịch SA/ MeOH : Dung dịch chứa shikimic acid trong methanol.
KTTP : Kích thước tiểu phân.
Danh mục các bảng.
Bảng 1: Kết quả hàm lượng acid shikimic trong các mẫu có kích thước khác
nhau 25
Bảng 2: Kết quả hàm lượng acid shikimic chiết ở các nhiệt độ khác nhau 26

Bảng 3: Hàm lượng acid shikimic ở 2 tỷ lệ DL/ DM 28
Bảng 4: Hàm lượng acid shikimic chiết bằng 2 dung môi có pH khác nhau 29
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ.
Hình 1.1: Sơ đồ tổng họp acid shikimic theo Raphael (1960) và Smissman
(1959) 9
Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp Acid Shikimic theo Dangschat, G. (1950)

9
Hình 1.3: Sơ đồ con đường Shikimat
10
Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp Oseltamivir từ acid shikimic theo Rohloff và các
cộng sự 12
Hình 3.1 : sắc ký đồ của dung dịch acid shikimic chuẩn

23
Hình 3.2 : sắc ký đồ của dung dịch mẫu định lượng

24
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của KTTP đến hiệu suất chiết xuất 25
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất 27
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưcmg của tỷ lệ DL/DM tới hiệu suất chiét
xuất

.
28
Hình 3.6: Đồ tìiị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết xuất

29
Hình 3.7: Sơ đồ chiết xuất tinh chế acid shikimic 32
Hình 3.8: Hình ảnh acid shikimic thô 33

Hình 3.9: Hình ảnh acid shikimic tinh khiết
34
ĐẬT VẤN ĐỀ
Acid shikimic là một hợp chất quan trọng có trong nhiều loài thực vật và
vi sinh vật. Nó là chất trung gian trong quá trình tổng họp các acid amin thơm,
alkaloid Gần đây, acid shikimic còn được dùng làm nguyên liệu để điều chế
oseltamivir phosphat (oseltamivir phosphat là hoạt chất trong chế phẩm
Tamiflu của Roche có tác dụng chống cúm). Mặc dù dịch cúm đã chấm dứt
nhưng luôn có nguy cơ bùng phát, nhu cầu thuốc chống cúm vẫn rất bức thiết.
Vì vậy rất cần các nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu và phương pháp
hiệu quả nhằm thu được acid shikimic với hiệu suất cao.
Đại hồi là nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất acid shikimic.
Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi có thể từ 5-7%, nên đại hồi là nguyên
liệu chính để sản xuất oseltamivir. Ngoài đại hồi, acid shikimic được tìm thấy
trong một số loài khác như : cây bạch quả {Ginkgo biloba), quả sau sau (chi
Liquidambar), bạch đàn (Chi Eucalyptus) hoặc được sinh tổng hợp nhờ vi
khuẩn Escherichia coli hay tổng hợp hóa học theo nhiều con đưòng khác
nhau. Tuy nhiên các phương pháp này thường phức tạp, hiệu suất thấp vì vậy
chưa đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, ở nước ta, đại hồi cũng là một
nguồn dược liệu lớn, tiềm năng.
Đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic trong đại hồi, song các
dung môi được sử dụng đều là dung môi hữu cơ, gây độc hại cho môi trường
và người nghiên cứu. Trong khi đó, acid shikimic lại tan rất tốt trong nước,
nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu chiết xuất acid
shỉkimỉc từ đại hồi bằng nước” với những mục tiêu sau:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất acid
shikimic trong đại hồi bằng nước.
2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về acid shikỉmic

^ O ^ O H
1.1.1 Công thửc hóa học, tính chất
Công thức hóa học : C7H10O5
Công thức cấu tạo : Hơ"'"
ổH
Tên khoa học : acid (3R,4S,5R) - 3,4,5 - trihydroxy -1-cyclohexen -1-
carboxylic .
Phân tử lượng : 174,15.
Tính chất: Acid Shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong
nước (18%), tan trong methanol, ethanol tuyệt đối, không tan trong
ethylacetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa.
Nhiệt độ nóng chảy :
183 - 184,5^.
Năng suất quay cực [a]*^=-183,8° (C = 4,03/H2O).
Dung dịch acid Shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213 nm[24].
1.1.2 Nguồn gốc acid shikimỉc
Acid shikimic được chiết xuất lần đầu tiên bởi Eykman từ 1 loại hồi
Nhật Bản shikimi-no-ki ( tên khoa học là Illỉcium religiosum Sỉeb. et Zucc.)
vào năm 1885. Do đó tên acid shikimic xuất phát từ tên loài hồi này.
[6],[22],[24],
Acid shikimic có trong nhiều loài cây, vi sinh vật và có vai trò then chốt
trong quá trình sinh tổng hợp. Nhưng chỉ có một số ít loài thực vật có chứa
một lượng đáng kể acid shikimic trong đó quan trọng nhất là đại hồi ụilỉcium
verum). Cho đến nay đã có nhiều tài liệu nghiên cứu chiết xuất acid shikimic
từ đại hồi với tỉ lệ hàm lượng acid shikimic chiết được từ 5 - 7% . Năm 2005,
Richard Payne đã chiết tách và phân lập được 7% acid shikimic từ đại hồi. ở
Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu chiết tách acid shikimic tương tự.
Nguyễn Quyết Chiến và cộng sự (2006) đã phân lập được 7,02 % acid
shikimic từ hồi Việt Nam ụ.verum) [1]. Nguyễn Đình Luyện và cộng sự
(2006) thực hiện nghiên cứu chiết tách acid shikimic tại trường đại học Dược

- Hà Nội cho tỉ lệ phần trăm acid shikimic từ 5 - 7% [6]. Ngoài ra acid
shikimic có thể được chiết xuất từ hạt của quả sau sau (chi Liquidambar) rất
phổ biến ở Bắc Mỹ, với hiệu suất khoảng 2 - 4% [12]. Một số loài thực vật
khác có chứa acid shikimic bao gồm nho, táo, bạch quả {Ginkgo biloba), liễu
(Salix nigra), một số cây thuộc chi Eucalyptus {E.sieberiana F.Muell,
E.citriodora), đinh hưoTig {Syzygium aromatỉcum, Myrtaceae), quả cây lý gai
( chi Gooseberry), cây việt quất châu Mỹ và châu Âu {Vaccinium
macrocarpon, v.oxycocos, V.myrtilỉus) [S'.
Ngoài ra, acid Shikimic còn có thể được tổng hợp hoặc bán tổng hợp.
Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid Shikimic từ 1,3-
butadien-l,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Aider (hình 1.1)
[20],[22],[23]. Grewe (1964) và cộng sự tổng hơp acid Shikimic từ 1,3-
butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng
hợp từ acid quinic và D-manose ( hình 1.2) [10],[22;.
OAc
hydroquinone
85-90 °c
ỌAc
X
C02H
OSO4, EtgO
Py, CH2N2
OAc
OAc
OAc
COaMe
ốAc
9
HCI
acetone

OAc
0/, Mg0.290^C
d^'Y
OAc
X
OAc
H2O, AcOH
KOH, Me0H-H20 HO''
i) AC2 O, Py
ii) (-)-quinine, MeOH
iii) KOH, M6 OH-H2 O
OAc
QO2H
HO'' ^OH
OH
Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp acid shikimỉc theo Raphael (1960) và
Smissman (1959).
HO, PO 2H
HO^ ìF^2NH2
p-TsCi, Pỵ
37 °c, 7 days
CN
H O ''' ' V ' ^O H
0 H
(-)-quinìc acỉd
•O A c
V^Ổ
C O 2H
'O A c
V -n

C O 2H
aq. NaOH
reflux 2.5 h
aq. H2 SO4
reflux
í >
V- 0
'OH H O '' ' Ỵ ' "'OH
0 H
Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp Acid Shikỉmic theo Dangschat, G. (1950)
1.1.3 Vai trò acid shikimic :
Trong tự nhiên, acid shikimic là một nguyên liệu cần thiết cho quá trình
sinh tổng họp các acid amin thơm như L-phenylalanin, L-tyrosin và L-
tryptophan hay các chất có nhân thơm trong cây (flavonoid, coumarin), indol
10
vä cäc dän chät, mot so alcaloid, tanin, lignin, acid p-aminobenzoic thong qua
con dirong Shikimat [13]. ( hinh 1.3)
A " '
OH ÖH
glucose
.^0H
'•OH
OPO3H2
<=^C02H
Hq CO2H
0X .0H
phosphoenolpyruvic
acid
OH o
H2 O3P o ^

ÖH
D-erythrose 4-phosphate
(E4P)
COjH
J\>xOH
O- V" 'OH
ÖH
3-dehydroshikimic acid
CO2H
'OH
ÖH
OPO3H2
3-deoxy-D-arabino-
tieptulosonic acid phosphate
HO, COjH
^„vO H
O'' 'Y' ^OH
ÖH
3-dehydroquinlc acid
COjH
HO'' 'Y" ’OW
ÖH
(-)-shikimic acid
H2O3PO' Y ^OH
ÖH
shikiitnate 3-phosphate
COOH
HO^ ypOaH
HO''' 'Y ' 'OH
ÖH

(•)-quinic acid
Quinones
CH2
'O COOH
ÖH
Chorismic acid
"► Folates
Q W
HN ^ NH2
Trytophan
"OH
Phenylalanin
Hinh 1.3: So" do con dircrng Shikimat.
Tyrosin
11
Acid shikimic là nguyên liệu tổng họp hóa học của acid triacetyl
shikimic có tác dụng chống kết tập tiểu cầu và huyết khối bằng cách tác động
lên sự chuyển hóa acid arachidonic [14\
Acid 6-fluoroshikimic là một dẫn chất của acid shikimic được sử dụng
như một chất kháng khuẩn và diệt ký sinh trùng hiệu quả. Vì vậy acid
shikimic có thể đóng vai trò quan trọng tạo ra thuốc bao gồm thuốc kháng
khuẩn, kháng virus, diệt ký sinh trùng [1 1 .
Đặc biệt, trong những năm gần đây, acid shikimic trở thành nguồn
nguyên liệu quan trọng để tổng hợp oseltamivir có vai trò ức chế enzym
neuraminidase - một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ
các tế bào bị nhiễm. Hoạt chất Oseltamivir có tác dụng trên virus cúm type A
và type B đặc biệt với chủng H5N1 [8]. Kim và cộng sự (1997) đã tìm ra con
đường tổng hợp oseltamivir từ acid shikimic. Trong quá trình này nhóm 3-
isopenyl ete được tạo ra bằng phản ứng mở vòng tritylaziridin và xúc tác
acid, cho phép tạo ra các hợp chất có cấu trúc tương tự bằng cách thay đổi

các tác nhân nucleophin. Tiếp sau đó, Rohloff và cộng sự (hãng Gilead) đã
xây dựng được phương pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở qui
mô pilot. Hiệu suất tổng thể của phản ứng là 21% với 10 công đoạn phản ứng
[2],[21]
CO2H
HO 'OH
I) EtOH, SOCI2
ii) 3-penỉanone, TsOH
iií) MsCI, EtjN
80%
ÕH
ỴỊụỊSOTÍ
BH3.Me2S
" V
63-75%
OMs
-0 /„
HO
' " Y
OMs
KHCO3 . aq. EtOH
0 /,,
96%
/
.aEt
NaNg, NH4CI
aq. EtOH (86%)
12
MesP
(97%)

DMF CjA%)
ii) AC2 O
HN
aziridine (74% purity)
AcHN’
N.
Í)
Ra-Ni,
H 2
EtOH
ii) 85% H3 PO4
(71-75%)
AcHN
NH,
Oseltamivir
Hinh 1.4: Sơ đồ tổng hợp Oseltamivir từ acid shikimỉc theo Rohioff
và các cộng sự.
Sau khi hãng Gilead nhượng lại bản quyền phát minh cho hãng Roche,
Federspiel cùng các cộng sự ở hãng Roche đã giữ nguyên phưong hướng
tổng hợp này và nghiên cứu các phương pháp để nâng cấp qui mô sản xuất và
nâng cao hiệu suất tổng hợp. Kết quả đã hoàn thiện được qui trình tổng hợp
epoxit ( một hợp chất quan trọng trong tổng hợp oseltamivir) theo 6 công
đoạn đạt hiệu suất tổng thể 63 - 65%. Phương pháp này được hãng Roche áp
dụng đe sản xuất quy mô công nghiệp [2].
Tuy nhiên, sự thiếu hụt nguồn nguyên liệu đã làm cho việc sản xuất
thuốc Tamiflu (Oseltamivir) bị ngưng trệ dẫn đến sự khan thuốc trong năm
2005. Các phương pháp sinh tổng hợp và tổng hợp hóa học nhằm sản xuất
thuốc Tamiflu đang được đẩy mạnh nghiên cứu và đã có nhiều thành công.
13
Elias J.Corey (Đại học Harvard) cùng các cộng sự đã tổng hợp

Oseltamivir thông qua phản ứng Diels-Alder đi từ chất ban đầu là 1,3-
butadien và 2 ,2,2- trifluoroethyl acrylate với xúc tác oxazaborolidium ở nhiệt
độ thường. Masakatsu Shibasaki (Đại học Tokyo) và các cộng sự tổng hợp
thuốc từ nguyên liệu 1,4 -cyclohexadien. Giai đoạn chính của quá trình tổng
hợp này dùng tác nhân trimethyl silyl azide [8].
Phương pháp sinh tổng họp acid shikimic bằng con đường lên men
chủng vi khuẩn Escherichia coli đột biến đã được mô tả bởi John W.Frost và
cộng sự (đại học Michigan). Hiệu suất của quá trình lên men này có thể đạt
được từ 20 - 50g acid shikimic trong IL môi trường. Một công trình tương tự
được thực hiện ở Nga nhờ sử dụng chủng đột biến của vi khuẩn Bacillus.
Hiệu suất từ 3 - 17g/L. Một nghiên cứu nữa ở Nhật Bản lên men chủng đột
biến vi khuẩn Citrobacter cho hiệu suất từ 4 - lOg/L [9’.
Những nỗ lực nghiên cứu về acid shikimic vẫn tiếp tục nhằm góp phần
tạo nguồn nguyên liệu ổn định cho việc sản xuất thuốc phòng chống cúm
trong trường hợp xảy ra đại dịch. Tuy nhiên cho đến nay các phương pháp
chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đều trải qua quá trình tinh chế bằng trao
đổi ion phức tạp, tốn kém khi áp dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp. Vì
vậy cần phải có nghiên cứu các phương pháp chiết xuất, tinh chế đơn giản,
hiệu quả, và kinh tế hơn.
1.2 Tổng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acid
shikimic từ đại hồi.
1.2.1 Vài nét về cây đại hồi
Cây đại hồi còn có tên khác là đại hồi hưong hay bát giác hồi hương.
Tên khoa học là Illicium verum Hook.f, họ Hồi ( Illiciacea).
14
Đặc điểm thực vật: cây đại hồi là cây gỗ nhở, cao 6 - lOm. Thân thẳng
to, cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt sau chuyển sang màu nâu xám. Lá
mọc so le, phiến lá nguyên, dày, cứng giòn, nhẵn bóng, dài 8 - 12cm, rộng 3 -
4cm, hình mác hoặc trúng thuôn, hơi nhọn đầu, mặt trên xanh bóng hơn mặt
dưới. Hoa mọc đofĩi độc ở nách lá, có khi xếp 2 - 3 cái, cuống to và ngắn, 5 lá

đài màu trắng có mép màu hồng, 5 - 6 cánh hoa đều nhau màu hồng thẫm.
Quả kép gồm
6 - 8 đại, xếp thành hình sao đường kính 2,5 - 3cm, lúc non
màu lục, khi già màu nâu sẫm, mỗi đại dài 10 - 15mm, có mũi nhọn ngắn ở
đầu. Hạt hình trứng, nhẵn bóng.
Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm và vị nóng. Mùa hoa: Tháng 5-6;
mùa quả: Tháng 7 -9 hoặc tháng 11 - 12 [5 .
Bộ phận dùng: Quả chín phơi khô của cây Hồi ụilicium verum).
Phân bố: Cây Hồi có ở một số tỉnh miền núi phía bắc nước ta, chủ yếu ở
Lạng Son [5 .
Thu hái: Thu hái vào mùa thu. Phơi khô (tránh làm gãy cánh). Để
nguyên dùng hoặc cất lấy tinh dầu. Lá thu hái quanh năm, dùng tươi.
Thành phần hoá học: quả hồi chứa nhiều tinh dầu, nếu cất bằng
phương pháp kéo hơi nước từ quả hồi tươi thì đạt hàm lượng 3 - 3,5% tinh
dầu lỏng, không màu hoặc màu vàng nhạt, có mùi thoTn đặc biệt. Thành phần
chủ yếu của tinh dầu hồi là anethol (80 - 85%), ngoài ra con có a-pinen, d-
pinen, 1-phel- landren, safrol, terpineol, limonen. Lá hồi cũng chứa tinh dầu
nhưng độ đông đặc hơi thấp hơn. Hạt hồi không mùi, chứa nhiều dầu béo
[3],[5],[8].
Công dụng: đại hồi được sử dụng nhiều trong cả Đông y và Tây y.
Trong Đông y, Đại hồi có vị cay, tính ôn, mùi thơm, có tác dụng khử hàn,
ấm kinh, kiện tỳ, khai vị, trừ đờm, tiêu thực, chỉ thống , giải độc, kháng
khuẩn. Quy vào 4 kinh Can, Thận, Tỳ, Vị. Thường dùng chữa nôn mửa, đầy
15
bụng, đau bụng, tiêu chảy, tay chân nhức mỏi, giải độc thức ăn, dị ứng. Ngoài
ra còn dùng quả hồi ngâm rượu cùng với một số dược liệu khác để xoa bóp
chữa tê thấp, nhức mỏi [7’.
Tây y cũng đã sử dụng quả hồi làm thuốc trung tiện, kích thích tiêu hóa,
lợi sữa. Có tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ (giảm đau, giảm co thắt
ruột), được dùng trong các bệnh lý đau dạ dày, ruột. Tuy nhiên, không nên

dùng quá nhiều sẽ bị ngộ độc với các triệu chứng say, run tay chân, xung
huyết não và phổi, có khi co giật như động kinh. Tinh dầu hồi có tác dụng
kích thích, làm dễ tiêu, chống co giật, ức chế sự lên men ruột, long đờm và
lợi tiểu nhẹ, là thành phần các thuốc trị ho, thuốc xoa bóp ngoài da, thuốc trị
bệnh nấm da và ghẻ [5],[8]. Nguyên nhân ngộ độc do nguồn gốc nguyên liệu
hồi không đảm bảo, có thể bị nhiễm loài hồi Nhật Bản Illicium anisatum và
cây hồi núi lỉlicium griffithii [5],[17]. Hai loài hồi này đều có chứa chất độc
và dễ bị nhầm lẫn với đại hồi do đặc điểm bên ngoài của quả giống nhau. Hồi
Nhật Bản chứa anisatin, shikimin và sikimitoxin, là các chất gây ra các
thương tổn nghiêm trọng cho thận, đưòng tiết niệu và các cơ quan tiêu hóa,
[15],[17]. Các hợp chất khác tồn tại trong các loài có độc tính của chi Illicium
là safrol và eugenol các chất này không được tìm thấy trong đại hồi ụ.verum)
và chúng được sử dụng để xác định việc làm giả đại hồi[5].
Tinh dầu hồi có tác dụng kích thích, làm dễ tiêu, chống co giật, ức chế
sự lên men ruột, long đờm và lợi tiểu nhẹ. Nó được sử dụng trong thành phần
các thuốc trị ho, thuốc xoa bóp ngoài da, thuốc trị bệnh nấm da và ghẻ [5] [8].
Quả hồi còn được dùng làm hương liệu trong chế biến thức ăn và chế
rượu hồi (rưọoi khai vị), làm thơm kem đánh răng. Quả hồi là một thành phần
không thể thiếu trong một số gia vị như bột cà ri, bột nêm ngũ vị hương, nước
dùng phở.
16
1.2.2 Một số phương pháp chiết xuất, tinh chế acid shikimic từ đại hồi:
Dung môi phân cực có khả năng hòa tan tốt acid shikimic và được lựa
chọn làm dung môi chiết xuất hợp chất này. Có nhiều phưong pháp chiết đã
được áp dụng để chiết acid shikimic từ đại hồi : chiết Soxhlet với ethanol
96%, chiết bằng nước nóng, phương pháp hồi lưu trong ethanol, phương
pháp siêu âm
Richard Payne (2005) chiết acid shikimic từ đại hồi bằng thiết bị soxhlet
với dung môi ethanol 95%. Sau khi loại tạp chất trong dịch chiết: gạn loại
dầu, dùng formaldehyd loại tạp và cất loại dung môi, acid shikimic được tinh

chế bằng phương pháp trao đổi ion (dùng nhựa trao đổi anion là Amberlite
IRA - 400) và kết tinh lại trong ethyl acetat - methanol. Hiệu suất quá trình
đạt đến 7% [19].
Nguyễn Quyết Chiến (2006) cũng tiến hành chiết xuất và tinh chế acid
shikimic từ đại hồi theo phương pháp tương tự. Hiệu suất quá trình đạt 5,4%
[2].
Hiroki Ohira (2009) cùng các cộng sự đã chiết acid shikimic từ đại hồi
bằng cách bơm nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau dưới áp suất cao qua cột
chiết xuất. Dịch chiết thu được sau mỗi khoảng thời gian được xác định hàm
lượng acid shikimic bằng máy HPLC. Hiệu suất chiết xuất của phương pháp
rất cao và thời gian chiết ngắn: hiệu suất chiết xuất acid shikimic so với
lượng acid shikimic trong dược liệu đạt 97% sau 10 phút ở nhiệt độ 70°c, đạt
hiệu suất 100% sau 5 phút khi chiết ở nhiệt độ 120°c với áp suất 15Mpa [18].
Nguyễn Đình Luyện (2006) chiết acid shikimic từ đại hồi với nước nóng
ở 60°c (đun cách thủy), chiết kiệt trong 10 giờ ( theo dõi bằng sắc ký lóp
mỏng), quy trình tinh chế tương tự như của Richard Payne: sử dụng nhựa trao
đổi ion Amberlite IRA - 400. Hiệu suất quá trình đạt 6,2% [6 .
17
Nguyễn Thị Thu Hiền (2010) chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng
methanol, theo phưong pháp ngâm lạnh và tinh chế bằng hỗn hợp dung môi
methanol - ethyl acetat. Hiệu suất đạt được 6,68%[3’.
Như vậy, ta thấy acid shikimic trong đại hồi rất dễ tan trong nước nóng.
Đe đảm bảo hiệu suất chiết cao mà phương pháp tinh chế đon giản, tốn ít
dung môi ta phải nghiên cứu khảo sát cáo yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
chiết xuất nhằm thu được một phương pháp chiết xuất hiệu quả và kinh tế.
^f^ữỜN(ĩĩ)H dĨíỌC hà NỘĨ
Ngày

^ ^ - ^ 9
Số Đ K C ^ —

18
CHƯƠNG 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Nguyên vật liệu và thiết b ị:
2.1.1 Nguyên vật ỉiệu và hóa chất:
Nguyên liệu :
+ Đại hồi thu hái tại tỉnh Lạng Sơn - Việt Nam
+ Đặc điểm quả h ồi; chọn loại cánh to và dầy, mùi thơm, màu vàng nâu.
Hóa chất:
+ Acid Shikimic chuẩn ( hàm lượng 99,2%).
+ Nước cất hai lần.
+ Aceton.
+ Methanol.
+ Than hoạt.
2.1.2 Máy móc, thiết b ị:
- Máy HPLC Shimadzu SPD-MIO Avp với detetor ư v (Nhật).
- Máy khuấy từ IKA RH basic KT /c.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).
- Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).
- Nồi cất nước JENCONS
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S với độ chính xác ± Img (Thuỵ Sỹ).
- Cân kỹ thuật ADP 31OOL.
- Màng lọc 0,45 |Lim.
- Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống đong,
pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm
r-pi ■? Ẩ
_
- Tủ sây.
19
2.2 Nội dung nghiền cứu:
2.2.1 Khảo sát các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng tới hiệu suất chiết xuất:

- Kích thước tiểu phân: độ mịn của dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc
giữa dược liệu và dung môi tăng lên, lượng chất khuếch tán vào dung môi
tăng, do đó, thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn. Song nếu dược liệu quá mịn,
nhiều tế bào thực vật bị phá vỡ, dịch chiết lẫn nhiều tạp, có thể cản trở sự
khuếch tán của hoạt chất [4]. Thí nghiệm được tiến hành nhằm chọn ra kích
thước tiểu phân đại hồi cho hiệu suất chiết xuất cao.
- Nhiệt độ chiết xuất: khi nhiệt độ tăng, hệ số khuếch tán cũng tăng, độ
nhớt dung môi giảm, làm tăng hiệu suất, giảm thời gian chiết xuất. Nhưng khi
nhiệt độ tăng, độ tan của tạp chất cũng tăng như chất nhầy có thể gây khó
khăn cho quá trình chiết xuất và tinh chế [4]. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng
của nhiệt độ nhằm chọn được nhiệt độ cho hiệu quả chiết xuất cao.
- Tỷ lệ dược liệu/ dung môi chiết xuất: nhằm tìm 1 tỷ lệ dược liệu/ dung
môi cho hiệu suất chiết cao, tốn ít dung môi.
- Ảnh hưởng của pH.
2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế.
Xây dựng phương pháp hiệu quả, đơn giản tinh chế acid shikimic từ dịch
chiết nước.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chiết xuất
Áp dụng phương pháp chiết nóng có khuấy trộn.
Tiến hành:
20
Xử lý dược liệu: Đại hồi được loại tạp, tách hạt, xay nhỏ. Sử dụng rây để
phân loại kích thước tiểu phân dược liệu thành 3 phân đoạn: A ( l,50mm >
KTTP >l,00mm ), B ( l,00mm > KTTP > 0,25mm ), c ( KTTP < 0,25mm ).
Chiết xuất dược liệu
Cân 5g ( hoặc lOg) các mẫu dược liệu A, B, c cho vào các bình nón
1 OOmL khác nhau, cho thêm 1 OOmL nước vào mỗi bình. Đặt lên máy khuấy
từ, đặt các chế độ làm việc.
Đối với nhiệt độ 30”c, 50°c, thời điểm lấy mẫu sau khi đạt nhiệt độ: lấy

mẫu sau mỗi 2 giờ.
Đối với nhiệt độ 70°c, 100°c, thời điển lấy mẫu sau khi đạt nhiệt độ: lấy
mẫu sau mỗi 1 giờ.
Hút mẫu, lọc qua giấy lọc.
Trong quá trình lấy mẫu có bổ sung dung môi, đảm bảo dung môi đủ
lOOmL.
2.3.2 Phương pháp định lượng
Acid shikimic được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).
Các bước tiến hành như sau :
a. Lựa chọn điều kiện sắc ký :
Tham khảo Hà Thị Mai Trang (2007) [8] và qua thực nghiệm, điều kiện
sắc ký được xác định như sau :
Cột: Supelco C8
Pha động: dung dịch acid sulfuric pH = 2,7 ± 0,2.
Bước sóng phát hiện: 210 nm.
Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 5|J.1.
21
Nhiệt độ buồng cột: 30°c.
b. Chuẩn bị mẫu:
- Mầu chuẩn lOOịig/mL: Cân chính xác 25mg acid shikimic chuẩn vào
bình định mức 50mL, thêm nước cất, lắc hòa tan hoàn toàn. Thêm nước vừa
đủ đến vạch. Hút chính xác 5mL, cho vào bình định mức 25mL, thêm nước,
lắc kỹ cho đều, thêm nước vừa đủ đến vạch.
- Chuẩn bị mẫu định lượng, xác định hàm lượng acid shikimic trong đại
hồi:
Cân chính xác 200mg bột dược liệu cho vào bình nón 50mL, thêm 50mL
nước cất, ngâm 30 phút, cho dược liệu trương nở hoàn toàn, sau đó đem siêu
âm 60 phút. Ly tâm, lấy dịch, phần bã tiến hành chiết lần 2, 3, mỗi lần 20mL

nước cất, tiến hành tưong tự lần 1. Gộp dịch chiết 3 lần, thêm nước cất đủ thể
tích lOOmL. Lọc qua giấy lọc.
Hút chính xác lOmL cho vào bình định mức 25mL, thêm nước, lắc kỹ
cho đều.
- Chuẩn bị mẫu thử :
+ Với các mẫu lấy từ mẫu tỷ lệ DL/DM 5%;
Hút chính xác ImL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL. Thêm nước
vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
+ Với các mẫu lấy từ mẫu tỷ lệ DL/DM 10%
Hút chính xác ImL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước
vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.
Tất cả các mẫu thử được lọc qua màng lọc 0,45 |im trước khi xác định
hàm lượng.
c. Hàm lượng acid shikimic trong dược liệu:
x% = ^(i)
Sc.V( fcmT-h
22
Trong đó:
x% : hàm lượng acid shikimic trong đại hồi.
Sc, St : diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu định lượng.
Vc, Vt : thể tích dung dịch mẫu chuẩn và dung dịch mẫu định lượng.
Vc = 25mL.
fc, fr : hệ số pha loãng mẫu chuẩn và mẫu định lưcmg. fc = 10.
mc, niT : khối lượng mẫu chuẩn và mẫu định lượng,
h : độ tinh khiết của mẫu chuẩn.
d. Hiệu suất chiết xuất tại mỗi thời điểm lấy mẫu:
H% = ^ J QQO/„ (2)
Trong đó :
St, Sin : diện tích peak của mẫu định lượng và mẫu thử i tại thời điểm lấy
mẫu n.

Vt, V i; thể tích dung môi mẫu định lượng và mẫu thử i.
fj: hệ số pha loãng mẫu định lượng và mẫu thử i.
niT , m i: khối lượng mẫu định lượng và mẫu thử i.
2.3.3 Phương pháp tinh chế acid shikỉmic.
- Loại bớt tạp trong dịch chiết nước bằng methanol.
- Sử dụng dung môi, hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để kết tinh
acid shikimic.
- Loại tạp chất màu bằng than hoạt.
23
CHƯOnVG 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Xác định hàm lượng acid shikimic trong đại hồi.
Tiến hành: chiết acid shikimic trong mẫu định lượng bằng phương pháp
siêu âm, tiến hành 3 lần, cách lấy mẫu, pha mẫu như đã được chỉ dẫn trong
mục 2.3.2 -b .
Hàm lượng acid shikimic trong mẫu định lượng được xác định bằng máy
HPLC, thực hiện trên máy HPLC Shimadzu SPD-MIO Avp với detetor ư v
(Nhật).
So sánh với mẫu chuẩn, áp dụng công thức (1) [trang 21], Tiến hành 3
lần, được kết quả trung bình hàm lượng acid shikimic có trong đại hồi là
8,75% ±0,1%.
350-
300-
250-
200-
150
100
5 0 -
ọ
cò
3

Mnutes
Hình 3.1 : sắc ký đồ của dung dịch acỉd shikỉmic chuẩn.
24
2 0 0 -
150-
100-
50 -
0-
ọ
có
3
Mnutes
r ^
Hình 3.2 : Săc ký đô của dung dịch mâu định lượng acid shỉkimỉc.
3.2 Khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng đến qua trình chiết xuất.
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước tiểu phân dược liệu.
Khảo sát ảnh hưởng của KTTP ở 3 khoảng kích thước: A ( Imm <
KTTP <l,5mm ), B ( 0.25mm < KTTP < Imm ), c ( KTTP < 0,25mm ).
Tiến hành: Cân 5 g bột dược liệu mỗi mẫu, cho vào các bình nón lOOmL,
thêm lOOmL nước, đặt lên máy khuấy từ, khuấy và đun đến nhiệt độ là 50°c,
thường xuyên kiểm tra bằng nhiệt kế, đảm bảo nhiệt độ hằng định. Sau khi
đạt nhiệt độ 50°c, lấy mẫu sau mỗi 2 giờ, lọc và pha mẫu để xác định hàm
lượng acid shikimic theo mục 2.3.2 - b.
Ket quả được thể hiện ở bảng 1 và hình 3.3: