Thu nhận enzyme CELLULASE trong Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất BIOETHANOL

Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
MỤC LỤC
MỤC LỤC________________________________________________________1
Chương 1: GIỚI THIỆU_____________________________________________3
Chương 2: TỔNG QUAN____________________________________________4
2.1 Enzyme cellulase____________________________________________4
2.2 Aspergillus Niger ___________________________________________4
2.3 Giới thiệu cơ chất___________________________________________5
2.4 Cơ chế xúc tác______________________________________________6
2.5 Tâm hoạt động______________________________________________8
2.6 Các thông số cần xác định_____________________________________9
Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME
CELLULASE____________________________________________________10
3.1 Sơ lược quy trình lên men____________________________________10
3.1.1 Môi trường nuôi cấy___________________________________11
3.1.2 Giống______________________________________________12
3.1.3 Lên men____________________________________________12
3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase____12
3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch________________________________13
3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase_____________________________13
3.2.2 Tinh sạch enzyme cellulase_____________________________14
3.3 Phương pháp xác định hoạt tính_______________________________15
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 1
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT NHIÊN
LIỆU SINH HỌC ETHANOL________________________________________17
4.1 Giới thiệu về nhiên liệu sinh học ethanol________________________17

4.2 Sơ đồ sản xuất ethanol và thuyết minh quy trình sản xuất___________20
4.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất________________________________20
4.2.2 Thuyết minh quy trình_________________________________21
4.2.2.1 Tiền xử lý_____________________________________21
4.2.2.2 Thuỷ phân_____________________________________22
4.2.2.3 Lên men______________________________________23
4.2.2.4 Chưng cất- khử nước____________________________24
4.3 Các thông số kỹ thuật của hệ enzyme cellulase___________________24
4.4 Phương pháp xác định đường glucose sinh ra_____________________25
Chương 5: KẾT LUẬN_____________________________________________26
PHỤ LỤC_______________________________________________________27
1. Phương pháp xác định hàm lượng enzyme cellulase bằng phương pháp
Bradford________________________________________________________27
2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp
DNS____________________________________________________________28
3. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc kí lọc
gel_____________________________________________________________30
TÀI LIỆU THAM KHẢO___________________________________________32
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 2
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chương 1: GIỚI THIỆU
 
Enzyme cellulase là một trong những enzyme thương mại hóa lớn nhất hiện nay
được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp dệt như làm mềm sợi bông, tẩy hay giữ màu,
chống kết tủa…; dùng để tách chiết trong thực phẩm hay công nghiệp giấy và bột giấy.
Thị trường cellulase dùng để tiền xử lý nguyên liệu cellulose sản xuất hàng hóa
như bioethanol và các sản phẩm sinh học cơ bản khác trên quy mô lớn đã tăng đột
ngột. Ví dụ như thị trường cellulase tiềm năng được ước đoán trên 400 triệu USD mỗi

năm, chỉ riêng sử dụng thủy phân bắp và rơm khô và trong tương lai sẽ chiếm khoảng
33% tổng giá trị công nghiệp enzyme của Mỹ. Sự tiềm năng của thị trường enzyme
cellulase có vai trò quan trọng của nổi bật trong công nghiệp năng lượng sinh học và
các sản phẩm cơ bản của sinh học, là một động lực to lớn để phát triển công nghệ
cellulase thủy phân vách tế bào thực vật. Để phát triển công nghiệp cellulase đòi hỏi
cần phải có những đặc điểm như hiệu suất xúc tác phản ứng cơ chất cellulose cao trong
môi trường không hòa tan, tăng sự ổn định của môi trường nhiệt độ cao, khi pH thay
đổi, và không bị ức chế nồng độ sản phẩm cao.
Ngoài ra hệ enzyme cellulase trong Aspergillus niger cũng được nghiên cứu từ
lâu nhằm ứng dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ nhu cầu chế biến
thực phẩm, trong nông nghiệp sử dụng dể xử lý đất nhằm tăng độ màu mỡ.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 3
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chương 2: TỔNG QUAN
 
2.1 Enzyme cellulase
Cellulase là enzyme thuộc nhóm thủy phân cellulose thành glucose.
Enzyme cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
•Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch
đen…
• Động vật: chủ yếu là do các vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột của động vật
nhai lại hay mối
•Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các chủng vi
sinh vật thường sử dụng:
•Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus,
Trichodesma reesei …
•Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

•Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…
Trong đó nấm mốc và vi khuẩn là 2 nguồn tạo cellulase chủ yếu, ở mức độ ít hơn
là mầm malt và hạt cây.
Trong kỹ thuật, cellulase được sản xuất chủ yếu từ nấm Trichodesma reesei,
Aspergillus niger và vi khuẩn Cellulomonas.
2.2 Aspergillus Niger
Aspergillus niger thuộc giới Eukaryota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ
Trichocomaceae, là một dạng nấm phổ biến nhất trong chi nấm mốc Aspergillus.
Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào
tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng.
Bào tử bụi của Aspergillus niger có màu đen.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 4
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Asp. niger là nguyên nhân gây bệnh mốc đen ở một số loài thực vật nhưng lại ít
có khả năng gây bệnh cho người, nó chỉ có thể gây hại cho người khi hít vào với một
lượng lớn, từ đó có thể gây ra các bệnh về phổi và hô hấp, nó cũng có thể gây nhiễm
trùng tai. Nó được nuôi cấy trong nhiều ngành công nghiệp như sản xuất acid citric,
acid gluconic, hoặc thu các chế phẩm enzyme amylase, cellulase, α-galactosidase.
2.3 Giới thiệu cơ chất
Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất. Người ta phân ra làm
2 loại chủ yếu sau:
• Cơ chất tự nhiên: gồm các nguồn phụ phẩm của các ngành nông nghiệp
như bã mía, bã cà phê, rơm rạ, sợi bông, cọng khoai mì, dây đậu sau thu
hoạch…Chẳng hạn như cellulose là homopolymer mạch thẳng, được cấu
tạo khoảng vài ngàn gốc glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-
glucoside. Cellulose có cấu tạo sợi, cấu trúc không đồng nhất gồm vùng
kết tinh và vùng vô định hình. Khoảng 40 sợi liên kết lại với nhau tạo
thành liên kết microfibrin. Nhiều sợi microfibrin tập hợp lại thành sợi

macrofibrin có đường kính mặt cắt khoảng 0,5nm.
 Cơ chất nhân tạo: gồm các cơ chất dùng để phân tích hoạt tính enzyme
cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl
cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) là một dẫn xuất của
cellulose. Cấu trúc của CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D-
glucopyranose, có thành phần tương tự nhưng chỉ có liên kết của phần vô
định và ngắn hơn so với cellulose.
Bảng: Các loại cơ chất tan và không tan dùng đêt nuôi cấy và cố định hoạt tính
enzyme.
Cơ chất tan Cơ chất không tan
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 5
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Radio-labeled cellodextrin
Dẫn xuất cellodextrin
β-methyllumbelliferul-
oligosaccharides
p-nitophenol-oligosaccharides
Cacboxymethyl cellulose (CMC),
hydroxyethyl cellulose (HEC)
Cellulose kết tinh như:
Cellulose kết tinh
Valonia cellulose
Cellulose vô định hình-PASC, RAC
Cellulose nhuộm
Cellulose phát huỳnh quang
Dẫn xuất sinh màu
Trinotrophenyl-
carboxymethylcellulose (TNP-CMC)

Fluram-cellulose
2.4 Cơ chế xúc tác
Enzyme cellulase là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá trình
chuyển hóa cellulose.
 Enzyme endogluconase (endo-1,4- β-D-glucanase (EC 3.2.1.4)) hay Cx: tên
khác là CMCase- gọi tên theo cơ chất nhân tạo sử dụng để xác định hoạt tính
của enzyme. EG bắt đầu thủy phân cellulose trên các vị trí vô định hình trên
bề mặt sợi microfibrin ở các vị trí ngẫu nhiên làm xuất hiện các đuôi khác
nhau trên phần chất vô định hình, từ cellulose tạo thành các cellobiose, tiền đề
cho xúc tác của cellobiosehydrolase trên các đầu mút của chuỗi tự do. Điều
này cho biết ảnh hưởng của enzyme trên phần carboxymethylcellulose và
cellulose kết tinh. Enyme endoglucanase của nấm thường là một monomer, có
pH hoạt động trong khoảng pH=4-5 và nhiệt độ t= 50 -70
o
C.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 6
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
 Enzyme exoglucanase (cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)) hay C1 : sẽ cắt và
giải phóng các cellobiose từ đầu không khử (đầu mút của chuỗi) tạo thành
trong bước đầu tiên. Exocellulase chiếm khoảng 40-70% thành phần hệ
enzyme cellulase của nấm, xúc tác bằng cách tạo ra các cầu liên kết giữa cơ
chất với enzyme. Với Exocellulase pH hoạt động từ 4-5, nhưng khoảng nhiệt
độ rộng hơn so với endocellulase khoảng 37-60
o
C.
 Enzyme β-glucanase (1,4- β - D -glucosidase(EC 3.2.1.21) ): thủy phân liên
kết β-1,4-glucoside, cắt và giải phóng glucose tự do. β –glucosidase thủy phân
cellobiose, một số trường hợp cellodextrin thành glucose. Enzyme β-

glucanase cũng bị ức chế cạnh tranh bởi glucose, enzyme này có pH tối ưu
dựa vào nơi hoạt động của nó và có nhiệt độ tối ưu khoảng 45-75
o
C.
 Cơ chế xúc tác của enzyme CMCase cơ chất CMC: Do cơ chất CMC chỉ có
vật chất vô định hình trong phân tử nên phức hợp 3 enzyme của cellulose chỉ
có enzyme endoglucanase hoạt động. Do đó CMC được dùng chủ yếu để xác
định hoạt tính endoglucanase (Cx) nên được gọi là CMCase.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 7
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
•
Hình: Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase
2.5 Tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp
với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian
giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao
gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều
khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ.
Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp
các nhóm chức năng của acid amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi
polypeptide.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 8
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể
dễ dàng bị cắt đứt trong quá tr.nh phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản
ứng.

Trung tâm hoạt động của các enzyme có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần
dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.
Đối với cellulase, tâm hoạt động là acid amin và không có cofactor cũng như
coenzyme.
2.6 Các thông số cần xác định
Trong quy trình lên men, thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ Asp. niger, ta
cần chú ý các thông số đặc tính của enzyme như sau:
• Khối lượng phân tử [Asp. niger]: 26000 Da
•Chất nền: carboxymethylcellulose + H
2
O
•Nhiệt độ cất giữ: -15
o
C trong khoảng thời gian dài hoặc 4
o
C trong 3 ngày.
•Khoảng nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ quá cao hay quá thấp thường dễ làm biến
tính enzyme do enzyme có bản chất là protein do đó enzyme hoạt động trong khoảng
20
o
C – 60
o
C.
•Nhiệt độ tối ưu: 45
o
C
•Khoảng pH : pH có vai trò quan trọng trong việc tạo môi trường cho hoạt động
enzyme, mỗi enzyme có một vùng hoạt động tốt nhất riêng cho mình nên khi pH thay
đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu trúc nên trung tâm hoạt động của
enzym như OH, SH hoạt động của hệ enzyme trong nấm mốc Aspergillus niger

thường có môi trường axit: 3 – 8.
•pH tối ưu: 3.8 – 4.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 9
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
•Nồng độ cơ chất: cơ chất vừa có vai trò là chất cảm ứng vừa có vai trò là chất ức
chế sự sinh tổng hợp enzyme khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt.
•Chất ức chế : Ag
+
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 10
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME CELLULASE
 
3.1 Sơ lược quy trình lên men
Quy trình lên men giống nấm mốc Asp. niger thuộc dạng lên men bề mặt và được
thực hiện theo sơ đồ sau:
3.1.1 Môi trường nuôi cấy
Môi trường bán rắn có các thành phần gồm bã mía và cám mì theo tỉ lệ 4:6, độ
ẩm 40 – 50%.
Sau khi trộn đều môi trường ta cho vào các bình tam giác thể tích 250ml, sau đó
hấp khử trùng ở 121
o
C/30 phút.
Làm nguội môi trường và chuẩn bị cấy giống.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 11
Môi trường nuôi cấy

Lên men
Khử trùng
Giống
Chế phẩm
enzyme thô
Khoáng và chất tăng
trưởng (nếu có)
Canh
trường
Nước + đệm
Ly tâm và tủa bằng cồn
lạnh
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
3.1.2 Giống
Giống Asp. niger được cung cấp bởi phòng thí nghiệm trường ĐH Kỹ thuật công
nghệ TP.HCM.
Cấy dịch huyền phù tế bào vào môi trường nuôi cấy với mật độ 10
6
bào tử/g môi
trường.
3.1.3 Lên men
Lên men bán rắn bề mặt trong các khay.
Nuôi cấy Asp. Niger trong 2 ngày, sau đó bắt đầu thu nhận enzyme thô.
3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase
Độ thoáng môi trường
Bã mía, cám mì tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm
mốc phát triển tốt. Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường
như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết

ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát
triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ
tiết ra lượng enzyme khác nhau.
Độ ẩm
Độ ẩm là khoảng 40 -50 %, đây là yếu tố quan trọng trong môi trường. Nếu độ
ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào
bị chết. Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nếu độ ẩm
quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 12
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Yếu tố khác
Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi
sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì
Hoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm
giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa
không đổi làm hoạt tính enzyme giảm.
Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết
kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các
đường đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các
chất có trong môi trường.
Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển,
cân bằng và tử vong. Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích
nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển.
Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó
sẽ giảm đi khi môi trường Minh dưỡng cạn kiệt dần.
3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch
3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase
Mẫu: enzyme cellulase từ nấm mốc Asp. Niger.

Cân 5g chế phẩm ezyme thô pha với nước tỷ lệ 1:5 (5g enzyme với 25 ml
nước), dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều trong 20 phút rồi lọc qua bông .
Đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút.
Thu dịch chiết nằm ở phía trên, bỏ phần cặn phía dưới.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 13
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
- Lấy 25ml dịch chiết tủa bằng cồn lạnh 96
o
C tỷ lệ 1:3 (25ml dịch : 75 ml cồn).
(Không sử dụng cồn ở nhiệt độ thường vì có thể làm biến tính và giảm hoạt lực của
enzyme).
- Làm lạnh 30 phút.
- Dịch chiết được ly tâm lần 2 cũng ở 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau
ly tâm thu tủa phía dưới (là protein) và tách bỏ lớp dung dịch phía trên. Pha dịch
enzyme thu được trong dung dịch đệm acetate pH= 5=> nhằm đảm bảo quá trình
biến tính của protein không xảy ra.
3.2.2 Tinh sạch enzyme cellulase
Tinh sạch enzyme này bằng sắc ký lọc gel. (chuẩn bị gel xem phụ lục).
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 14
Lọc qua bôngThu dịch chiết
Tủa bằng cồn
(1:3)
Thu cặn tủa
protein
Ly tâm 3000
vòng/phút (10’)
Làm lạnh
30phút

Pha với nước
(tỷ lệ 1:5)
Chế phẩm
enzyme
Khuấy 20 phút
Ly tâm 3000
vòng/phút (10’)
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel là kỹ thuật dùng để tách những phân tử có kích
thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Những phân tử kich thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di
chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các
hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các
phân tử nhỏ.
3.3 Phương pháp xác định hoạt tính
Cơ chất dùng để xác định hoạt động của hệ enzyme cellulase là cellulose không
tan như giấy lọc, bột cellulose tinh khiết… Tuy nhiên, do lượng đường khử sinh ra
không tuyến tính với lượng enzyme trong phản ứng, nghĩa là lượng enzyme tăng gấp
đôi sẽ không sinh ra lượng đường khử gấp đôi trong cùng thời gian phản ứng. Do đó ta
sử dụng cơ chất là dãn xuất của cellulose tan trong nước như CMC, hay HEC để xác
định hoạt tính của CMCase.
Với các cơ chất khác như giấy lọc dùng xác định hoạt tính enzyme exocellulose.
Đơn vị đo hoạt tính riêng của cellulase là CU/mg (cellulase units)
Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 15
Chế phẩm
enzyme thô
Cột sắc ký

Dung dịch đệm
pH=5
Chế phẩm
enzyme
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB)
sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường
độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.
Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS:
Phương pháp dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi
enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5.0 và 40
o
C. Lượng đường khử sinh ra
được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra
sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở
bước sóng 540nm.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 16
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT
NHIÊN LIỆU SINH HỌC BIOETHANOL
 
4.1 Giới thiệu về nhiên liệu sinh học ethanol
Nhiên liệu sinh học (Biofuel hay Agrofuel) là sản phẩm của quá trình lên men
kị khí từ nấm men, đây là loại chất đốt tái tạo sản xuất từ nguyên liệu động thực vật.
Xăng-Ethanol (E) thông dụng nhất hiện nay trên thế giới vì dễ dàng biến chế từ
đường và tinh bột.

Tất cả thực vật quang tổng hợp đều có thể biến chế thành xăng sinh học.
Cây nông phẩm chứa đường gồm mía, củ cải đường, sorgho-đường; nông
phẩm chứa tinh bột gồm hạt ngủ cốc như lúa mì, lúa, bắp, sorgho…; củ như khoai
tây, khoai mì, khoai lang.
Mía có hiệu quả kinh tế nhất vì cho năng xuất thân (khoảng 170-200 t/ha ở
Brazil, 80-100 t/ha ở Úc, Việt Nam khoảng 35-50 t/ha), biến chế ethanol thẳng từ
nước ép, bả mía dùng làm năng lượng chạy máy ép và chưng cất ethanol. Mía sản
xuất trung bình 15,500 lít ethanol/ha/năm, và cứ 1 tấn chất khô mía sản xuất được
438 lít ethanol. Brazil sản xuất ethanol chính từ mía. Sorgho-đường hiện được ưa
chuộng hơn mía ở một số vùng nhiệt đới khô hạn, có hiệu quả kinh tế hơn mía.
Sorgho-đường canh tác ở Hoa Kỳ cho 28,500 lít ethanol/ha/vụ 4 tháng.
Ngoài ra còn có các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất xăng sinh học như:
• Thực vật hoang dại: tảo (algae) nước ngọt, tảo biển, lục bình (Eichornia
crassipes), cỏ Vetiver, cỏ voi (Elephant grass, Pennisetum purpureum, sản xuất
13,700 lít ethanol/ha/năm), lác (Cyperus), cỏ tranh (Imperata cylindrica),…
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 17
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
• Phó sản thực vật từ sản xuất cây nông phẩm và cây kỹ nghệ: rơm rạ, bả
mía, thân, gổ, mạt cưa, trấu, hạt cao su (sản xuất 217 kg dầu/ha/năm), hạt bông vải
(sản xuất 273 kg dầu/ha/năm).
• Giấy phế thải: 1 tấn giấy củ sản xuất khoảng 416 lít ethanol.
• Rác thành phố: 1 tấn rác sản xuất khoảng 227 lít ethanol.
• Phế thải chuồng trại gia súc: phân chuồng (tạo methane sinh học rồi chế
methanol).
Xăng sinh học ethanol (C
2
H
5

OH) 99.9% có thể chạy động cơ xe hơi chạy bằng
xăng. Khi cháy, một phân tử ethanol sinh một nhiệt lượng 1409 kJ.
Xăng pha với ethanol thải ít khí nhà kính hơn xăng thường. Chẳng hạng E85
thải 1 ppm khí NO
2
trong khi xăng-cổ-sinh thải 9 ppm.
Trên nguyên tắc, bất cứ chất vật liệu sinh học nào chứa nhiều Carbon, hoặc
dưới dạng đường, tinh bột, cellulose đều có thể chế biến thành ethanol, hoặc chứa
nhiều acid béo đều có thể chế biến diesel sinh học được. Thông thường nhất là từ
thực vật có khả năng quang tổng hợp – biến CO
2
của khí quyển thành chất đường,
tinh bột, cellulose, rồi protides, lipids, v.v. Trung bình cứ mỗi phân tử CO
2
cây hấp
thụ và biến chế qua quang tổng hợp thành sinh khối chứa 114 kilocalories. Khó khăn
kỹ thuật hiện tại là làm sao biến toàn thể năng lượng C chứa trong sinh khối thành
xăng sinh học. Với kỹ thuật hiện nay (cổ điển), có 2 phương thức hữu hiệu:
• Cho lên men (nhờ men và enzymes trong điều kiện yếm khí) chất đường
(từ mía, củ cải đường, v.v.), tinh bột [từ hạt ngũ cốc (bắp, lúa, lúa mì, v.v.) và củ
(khoai tây, khoai mì, v.v.)], hay cellulose để tạo ra rượu Ethanol (CH
3
OH), Propanol
[CH
3
CH
2
CH
2
OH; (CH

3
)
2
CHOH] và Butanol (C
4
H
10
O).
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 18
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
• Trích dầu từ thực vật giàu chất dầu, hay mỡ từ động vật (ép với áp suất
cao và nhiệt, hay bằng dung môi, hay phối hợp cả hai).
Về phương diện kỹ thuật (và kinh tế), chia làm 3 loại nguyên liệu:
• Công nghệ xăng-sinh-học thế hệ 1: chế biến từ đường (mía, củ cải đường,
sorgho-đường) và tinh bột của nông phẩm (từ hạt của bắp, lúa mì, lúa, v.v., hay từ củ
như khoai tây, khoai mì, v.v.) để tạo ethanol; hay từ dầu (của hạt dừa-dầu, đậu nành,
đậu phộng, v.v.) để biến chế diesel-sinh-học. Kỹ thuật đơn giản và kinh tế nhất.
• Công nghệ xăng-sinh-học thế hệ 2: từ cellulose, chất xơ của dư thừa thực
vật (rơm, rạ, thân bắp, gổ, mạt cưa, bả mía, v.v.), hay thực-vật-hoang (non-crop)
(như cỏ voi, vetiver, lục bình). Chẳng hạn, một ha mía cho khoảng 25 tấn bả mía
(bagasse, xác mía sau khi ép), và mỗi tấn bả mía sản xuất 285 lít ethanol. Kỹ thuật
hiện nay chưa hoàn hảo, hiệu năng còn kém, con men chưa hữu hiệu và giá đắt, chỉ
một phần cellulose và lignin biến thành ethanol, nên giá thành sản xuất còn cao.
• Công nghệ xăng-sinh-học thế hệ 3: từ tảo (algae), kỹ thuật đang phát triển.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 19
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

4.2 Sơ đồ sản xuất ethanol và thuyết minh quy trình sản xuất
4.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 20
Phế phẩm
nông nghiệp
Cellulose Hemicellulose Lignin
Tiền xử lý
Thủy phân
Hemicellula
ses
Cellulases
Đường
hexoses và
pentoses
Lignin
Hệ thống quản
lý chất thải
Sản xuất năng
lượng
Năng
lượng điện
Cung cấp cho quá trình tiền xử lý
Lên men
Bioethanol
thô
S.cerevisiae
Bioethanol
Chưng cất và
cho bay hơi
Cải tiến môi trường nuôi

cấy
Tác nhân gây đột biến
Sinh vật chuyển gen
SSF
CBP
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
SSF: quá trình thủy phân thành các đường đơn giản và lên men được tiến hành
trong một thiết bị.
SHF: quá trình thủy phân thành các đường đơn giản và lên men được tiến hành
độc lập trong những thiết bị khác nhau.
CBP: đồng nhất bằng quá trình sinh học
4.2.2 Thuyết minh quy trình
Quy trình được tiến hành theo 4 bước:
• Xử lý cơ học nguyên liệu.
• Thuỷ phân cellulose thành glucose.
• Lên men glucose thành ethanol.
• Tách và tinh chế sản phẩm
4.2.2.1 Tiền xử lý
Bã mía là nguồn phế thải của ngành công nghiệp sản xuất đường. Thành phần của
bã mía gồm 41% cellulose (C
6
H
10
O
5
)
n
, ngoài ra còn có lignin, pectin, hemicellulose và

phần đường còn dư.
Tiền xử lý lignocelluloses rất cần thiết vì nguyên liệu thủy phân không có quá
trình tiền xử lý xảy ra rất chậm và kết quả là cho hiệu suất tạo ra sản phẩm không cao.
Một vài phương pháp nhằm làm giảm kích thước nguyên liệu và giảm phần cellulose
kết tinh. Tiền xử lý nâng cao mức độ tiếp xúc giữa cellulose với enzyme, làm giảm
lượng enzyme sử dụng do đó giảm về giá thành của quy trình. Có nhiều phương pháp
tiền xử lý khác nhau có thể phân chia thành 3 loại: hóa học (dùng axit hoặc kiềm),vật
lý kết hợp với hóa học (bằng cách xay xát kết hợp với sử dụng hơi nước) và tiền xử lý
bằng phương pháp sinh học sử dụng vi sinh vật. Trong tiền xử lý bằng phương pháp
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 21
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
hóa học sử dụng axit, hemicellulose sẽ là đối tượng tương tác chính, ngược lại quá
trình tiền xử lý sử dụng kiềm chủ yếu để loại bỏ lignin. Vì thế không nhất thiết chỉ sử
dụng một phương pháp cho quá trình tiền xử lý mà dựa vào thành phần của nguyên vật
liệu mà có một phương pháp xử lý thích hợp.Nhiều enzyme thủy phân cellulose từ nấm
làm việc ở pH axit yếu (4-5).
Tiền xử lý bằng phương pháp sinh học sử dụng vi sinh vật như dụng loại nấm như
Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và
enzyme của chúng dùng để khử lignin trong lignocelluloses nhằm giảm năng lượng sử
dụng, tối thiểu sản phẩm thải ra và tác động đến môi trường.
Một số loài nấm đảm trắng có khả năng sử dụng lignin nhưng không làm giảm
lượng mannan peroxide và laccase.
Trong bước xử lý cơ học, cần loại lignin trong nguyên liệu, chỉ còn lại thành phần
cellulose, vì ligin là chất khó phân huỷ. Nếu còn sót lại trong nguyên liệu sẽ ảnh hưởng
năng suất của quá trình.
4.2.2.2 Thuỷ phân
Quá trình này gây tiêu tốn nhiều chi phí trong giai đoạn sản xuất cồn. Sau
quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicelluloses được thủy phân tạo ra các đường đơn

sử dụng enzyme cellulase và hemicellulase. Nhiều loài nấm như Tricoderma,
Aspergillus, Penicilium… có thể sản xuất ra một lượng lớn cellulase ngoại bào và
hemicellulase. Những enzyme chịu nhiệt độ cao và pH thấp được ưu tiên sử dụng do
quá trình tiền xử lý thường dùng axit và nhiệt độ. Hơn nữa, các enzyme chịu nhiệt có
vài đặc điểm thuận lợi như hoạt tính riêng cao và mức độ ổn định cao dùng cải tiến quá
trình thủy phân. Cuối cùng, nâng cao hiệu suất xúc tác của enzyme tức là giảm lượng
enzyme sử dụng. Những chủng chịu nhiệt có enzyme hoạt động ở nhiệt độ rất cao trên
60
o
C và nhiệt đọ phát triển tối ưu là 35-55
o
C. Hiện nay, bằng kỹ thuật di truyền, các
nhà nghiên cứu đang hướng đến tạo ra một tổ hợp enzyme có thể thủy phân nguồn
nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất. Bao gốm quá trình:
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 22
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Chuyển đổi cellulose: Cellulose là loại polysaccharide đồng hình được cấu -(1-
4) glycoside.β-D-glucose thông qua liên kết thành từ các đơn phân. Quá trình thủy
phân bằng tổ hợp enzyme cellulase bao gồm β-glucosidase tạo ra β-cellobiohydrolase
(exoglucanase), endoglucase và sản phẩm cuối cùng là glucose.
Chuyển đổi hemicellulose: hemicellulose là thành phần dồi dào nhất thứ 2 trong
nguồn nguyên liệu lignocellulose (25-30%). Hemicellulose là một loại polymer dị hình
được tạo bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose (D-
mannose, D-glucose, D-galactose) và các acid đường. Xylan là thành phần thường thấy
trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lại là thành phần chính trong các loại
thực vật thân mềm. Tổ hợp enzyme để thủy phân hemicellulose cũng rất phức tạp. Ví
dụ β-xylanse, để thủy phân xylan thì tổ hợp enzyme cần thiết là endo-1,4-β -L-
arabinofuranosidase.α-glucuronidase và α-xylosidase.

Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma reesei và
Aspergillus niger. Hiện nay, người ta đang thay thế dần các hệ enzyme chịu nhiệt, chịu
các điều kiện hóa học quá hạn. Hơn hết là các nghiên cứu về phức hợp cellulosome của
các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đường mới nhằm tăng hiệu quả thủy phân
của tổ hợp trên các loại nguyên liệu lignocellulose.
4.2.2.3 Lên men
Trong quá trình lên men, sản phẩm sau quá trình thủy phân bao gồm các
monomer hexose ( glucose, mannose, galactose) hay pentose (xylan, arabinose) sẽ
được lên men để tạo ra các sản phẩm có giá trị như ethanol. Trong số các sản phẩm
thủy phân, glucose có hàm lượng cao nhất sau đó đến xylose và mannose và những
đường khác có tỷ lệ thấp hơn.
S.cerevisiae là vi sinh vật lên men truyền thống sử dụng lên men ethanol từ tinh
bột trong quy mô công nghiệp. S.cerevisiae có nhiều thuận lợi như được nghiên cứu từ
lâu, hiệu suất lên men cao tuy nhiên S.cerevisiae có nhược điểm là không thể sử dụng
xylose làm nguồn cacbon để sinh trưởng hay len men. Do đó S.cerevisiae được cải tiến
để có thể sử dụng cả 2 đường glucose và xylose. Hiện tại một số loài như S. Cerevisiea
hay S. unvarum là giống có khả năng tạo độ cồn cao (12-13%), hay đặc biệt S.
oviformis có khả năng tạo độ cồn 18% đặc biệt loài nấm men này có khả năng lên men
được rất nhiều đường khác nhau như glucose, manose, saccharose, maltose và rafinose,
tuy nhiên không có khả năng lên men galactose. Ngoài ra còn có Zymononas mobilis
cũng thường được sử dụng trong quá trình rượu hóa. Tuy nhiên cả Saccharomyces và
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 23
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương
Zymononas sp đều thiếu hoàn toàn khả năng chuyển hóa các loại đường pentose.
Khuynh hướng biến đổi gen của 2 giống này nhằm giúp biểu hiện khả năng chuyển hóa
2 loại đường pentose phổ biến nhất là D-xylose, và L – arabinose cũng đã được phát
triển nhiều.
Gần đây, người ta phát hiện thấy có một số loài nấm men như Pichia stipitis,

Candida shehatae và Pachyhysolen tannophillus là những chủng có khả năng chuyển
hóa xylose mạnh và đã được dùng trong sản xuất ethanol. Trong đó P. stipilis lại nổi
bật bởi khả năng sản xuất hàm lượng cồn cao và nhu cầu dinh dưỡng của chúng không
quá phức tạp so với các giống nấm men khác.
Ngoài ra, các chủng chịu nhiệt độ cao như G. thermoglucosidasius, T.mathranii
và T. saccharolyticum cũng đang được sử dụng. Quá trình lên men cồn của chúng có
nhiều lợi ích hơn các quá trình chuyển hóa xảy ra ở nhiệt độ trung bình. Chúng có khả
năng lên men không chỉ đường pentose, hexose mà còn có khả năng lên men
cellobiose, thậm chí trong một số trường hợp những cơ chất polycarbonhydrate phức
tạp như cellulose. Quá trình lên men ở nhiệt độ cao giúp quá trình thu hồi sản phẩm dễ
dàng hơn, bởi vì ethanol có chứa nước (aqueous ethanol) sẽ bốc hơi tại nhiệt độ 50
0
C,
đồng thời giảm nồng độ cồn trong bồn lên men nhằm giảm thiểu ảnh hưởng ngược lại
của nồng độ cồn đến sự phát triển của tế bào, từ đó giảm được chi phí sản xuất.
4.2.2.4 Chưng cất- khử nước
Quá trình tách nước và tinh sạch ethanol để đáp ứng đặc điểm kỹ thuật của nhiên liệu.
4.3 Các thông số kỹ thuật của hệ enzyme cellulase
•Nhiệt độ: enzyme cellulase hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 đến 50
o
C,
nhiệt độ tối ưu là 48
o
C.
•pH: môi trường kiềm hoặc phosphoric acid, ở môi trường này, cần quan sát pH
để tao môi trường thích hợp, cellulose được nở ra do đó sẽ bị phân giải rất nhanh.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 24
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

4.4 Phương pháp xác định đường glucose sinh ra
Cần theo dõi lượng glucose sinh ra sau phản ứng. Glucose sau phản ứng có thể
xác định bằng phương pháp đo Iode theo kỹ thuật chuẩn độ ngược.
Cách tiến hành như sau:
Cho 1 thể tích chính xác glucose tác dụng với 1 thể tích chính xác (lấy dư) dung
dịch I
2
trong môi trường kiềm. Quá trình oxy hoá diễn ra theo phương trình:
I
2
+ 2NaOH  NaI + NaIO + H
2
O
CH
2
OH(CHOH)
4
-CHO +IO
-
 CH
2
OH(CHOH)
4
-COOH + I
-
Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, acid hoá môi trường bằng H
2
SO
4
để Iode dư

dưới dạng IO
-
chuyển về lại I
2
. sau đó định lượng I
2
dư bằng dung dịch chuẩn Na
2
S
2
O
3
.
Tính kết quả % glucose như sau:
f
V
ENVNV
G
G
GthiothioII
100*
1000*
*)**(
%
22
−
=
Trong đó:%G là glucose.
f: là hệ số pha loãng dd C
6

H
12
O
6
trước khi định lượng.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 25