Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây dầu dây ( ampelopsis heterophylla sieb et zucc var hancei planch vitaceae) thu hái ở tam đảo vĩnh phúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ NGỌC LAN


NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
DÂU DÂY (AMPELOPSIS HETEROPHYLLA
SIEB. ET. ZUCC. VAR. HANCEI PLANCH.,
VITACEAE) THU HÁI Ở TAM ĐẢO,
VĨNH PHÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
DÂU DÂY (AMPELOPSIS HETEROPHYLLA SIEB.
ET. ZUCC. VAR. HANCEI PLANCH., VITACEAE)
THU HÁI Ở TAM ĐẢO,
VĨNH PHÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 60720406


Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Thị Bích Thu


HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn TS. NGUYỄN THỊ BÍCH
THU đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt
nghiệp.
Luận văn này là kết quả của quá trình học tập trong gần 16 tháng liên tục.
Do đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy, cô trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị cho
tôi những kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới TS. PHƯƠNG THIỆN
THƯƠNG, TS. ĐỖ THỊ HÀ cùng các anh chị, các em trong Viện Dược liệu đã
tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận
văn.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân, bạn
bè, đặc biệt là gia đình của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013
Học viên


Nguyễn Thị Ngọc Lan







MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đặc điểm chung của họ Nho (Vitaceae) 3
1.2. Đặc điểm chi Ampelopsis. 3
1.2.1. Vị trí phân loại 3
1.2.2. Đặc điểm thực vật 3
1.2.3. Thành phần hóa học 4
1.2.4. Tác dụng dược lý 5
1.3. Những nghiên cứu về cây Dâu dây Ampelopsis heterophylla Sieb. et.
Zucc. var. hancei Planch. 6
1.3.1. Đặc điểm thực vật: 6
1.3.2. Phân bố và sinh thái 7
1.3.3. Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian [2], [10]. 7
1.3.4. Thành phần hoá học: 7
1.3.5. Tác dụng dược lý: 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.1. Đối tượng nghiên cứu 10
2.2. Phương tiện nghiên cứu 10
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất : 10
2.2.2. Phương tiện và máy móc 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu 11
2.3.1. Về thực vật 11
2.3.2. Về hóa học 11
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22
3.1. Nghiên cứu về thực vật 22
3.1.1. Đặc điểm thực vật 22
3.1.2. Cấu tạo giải phẫu của thân và lá. 24
3.1.3. Đặc điểm vi học 26
3.2. Nghiên cứu về hóa học 27

3.2.1. Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong phần trên mặt đất (lá và
thân) cây Dâu dây (xem Bảng 3.1) 27
3.2.2. Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn. 29
3.3. Phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học. 34
3.3.1. Chiết xuất: 34
3.3.2. Phân lập: 34
3.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất 38
3.3.4. Sắc ký đồ của dịch chiết phân đoạn với AG-1, AG-2 và AG-3 43
3.3.5. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được. 45
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 54
4.1. Về phương pháp. 54
4.2. Về thực vật 54
4.3. Về thành phần hóa học 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitril
BuOH: Butanol
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Dd: Dung dịch
DM: Dung môi
MeOD: Methanol
EtOAc: Ethylacetat
ESI-MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry
F: Hàm lượng chất (tính theo %)
GC-MS: Gas Chromatography – Mass Spectrometry
H
2
O: Nước
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
13
C-NMR: Carbon Nuclear Magnetic Resonance
1
H-NMR: Hydro Nuclear Magnetic Resonance
IR: Infrared Spectroscopy.
MS: Mass Spectrum
Pư: Phản ứng
SKLM: Sắc ký lớp mỏng

SKC: Sắc ký cột
SKĐ: Sắc ký đồ
TLC: Thin Layer Chromatography
UV: Ultra Violet
VAST : Vietnam Academy of Science and Technology.







DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên b
ảng

Trang

1
B
ảng 3.1. Kết quả
đ
ịnh tính các nhóm

ch
ất chính
trong phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây

bằng các phản ứng hóa học.
28-29
2
B
ảng 3.2. Hàm l
ư
ợng cắn trong từng phân
đo
ạn chiết
phần trên mặt đất của cây Dâu dây.
29
3
B
ảng 3.3. Kết quả
đ
ịnh tính cắn các phân
đo
ạn trong
phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây.
30-31
4
Bảng 3.4: Hệ dung môi pha động HPLC
40
5
B
ảng 3.5: Số liệu phổ
1
H
-
NMR (500 MHz) và

1
3
C
-
NMR (125 MHz) của chất AG-1
47
6

Bảng 3.6: Số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz) và
13
C-
NMR (125 MHz) của chất AG-2
49-50
7
B
ảng 3.7: Số

li
ệu phổ
1
H
-
NMR (500 MHz) và
1
3
C
-
NMR (125 MHz) của chất AG-3

52-53














DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1
Hình 1.1.
Ảnh cây Dâu dây (Nguồn internet).

6

2

Hình 2. 2. S
ơ đ
ồ chiết phân
đo
ạn các nhóm chất

21

3

Hình 3.3
.
Ảnh hình thái cây Dâu dây

23

4

Hì
nh 3.4
.
Ảnh chụp vi phẫu lá cây Dâu dây

25

5
Hình 3.5. Ảnh chụp vi phẫu thân cây Dâu dây.
25

6

Hình 3.6
. Tinh th
ể calci oxalat hình cầu gai và bó
tinh thể hình kim (Vi phẫu thân)
25

7
Hình 3.7
.
Ảnh chụp các
đ
ặc
đi
ểm b
ột thân cây Dâu
dây dưới kính hiển vi.
26

8
Hình 3.8
.
Ảnh chụp các
đ
ặc
đi
ểm bột lá cây Dâu dây
dưới kính hiển vi
27

9

Hình 3.9
. S
ắc ký
đ
ồ phân
đo
ạn cắn ethylacetat

32

10

Hình 3.10
. S
ắc ký
đ
ồ phân
đo
ạn cắn n
-
butanol

33

11
Hình 3.11
. Sơ đ
ồ chiết xuất, p
hân l

ập các chất trong
cây Dâu dây.
37

12
Hình 3.12. Sắc ký đồ SKLM của AG-1 với 3 hệ dung
môi khác nhau
38

13
Hình 3.13. Sắc ký đồ SKLM của AG-2 với 3 hệ dung
môi khác nhau
39

14
Hình 3.14. Sắc ký đồ SKLM của AG-3 với 3 hệ dung
môi khác nhau
40

15
Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC của chất AG-1
41



16
Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC của chất AG-2
42

17

Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC của chất AG-3
42

18
Hình 3.18. Sắc ký đồ SKLM của cắn EtOAc, AG-1,
AG-2
43

19
Hình 3.19
. SKLM d
ấu vân tay ở b
ư
ớc sóng 254 và
365 nm (trước khi phun thuốc thử)
44

20
Hình 3.20
. SKLM d
ấu vân tay ở ánh sáng th
ư
ờng

và UV 365 nm (sau khi phun thuốc thử)
44

21
Hình 3.21. Công thức cấu tạo của 4’-O-methyl
myricitrin

48

22
Hình 3.22. Công thức cấu tạo của acid ursolic
51

23
Hình 3.23. Công thức cấu tạo của myricitrin
54

















1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, thực vật phát
triển quanh năm, rất đa dạng và phong phú. Thực vật không những cung cấp
chất dinh dưỡng mà còn là nguồn thuốc chữa bệnh quí giá cho con người.
Hiện nay có rất nhiều các loại thuốc đang được lưu hành trên thế giới hoặc
đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên
nhiên. Do vậy, hướng nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của các cây thuốc đang rất thu hút sự quan tâm của giới khoa học.
Cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei
Planch.), còn gọi là cây nho dại, nho rừng, song nho dị diệp. Cây phân bố ở
các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới. Ở nước ta, cây phân bố tương đối rộng rãi
từ các tỉnh vùng đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp. Cây thường leo lên
các lùm bụi ở ven rừng, đồi, bờ nương rẫy và đôi khi thấy ở cả quanh làng
bản. Theo Y học cổ truyền, cây có vị ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng thanh
nhiệt, tiêu sưng, chữa phong thấp. Trong dân gian, cây được dùng phối hợp
với các vị thuốc khác nhau để chữa sốt rét, chữa đau quanh vai, lưng gối đau
nhức, chân sưng phù, chữa vết thương bầm tím sưng đau [2].
Cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố sâu về thành
phần hóa học, tác dụng sinh học của cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla
Sieb.et.Zucc.var. hancei Planch.), mọc ở Việt Nam.
Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng dược liệu có
hiệu quả hơn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu đặc điểm
thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây (Ampelopsis
heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei Planch., Vitaceae) thu hái ở Tam
Đảo, Vĩnh Phúc” với mục tiêu:
Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây

2

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, thân, đặc điểm bột lá,

thân và giám định tên khoa học của cây Dâu dây (Ampelopsis
heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei Planch., Vitaceae) thu hái ở
Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
2. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối
với cắn toàn phần và cắn các phân đoạn của các mẫu nghiên cứu.
3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học 2 đến 4 chất tinh khiết
trong cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei
Planch., Vitaceae) thu hái ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm chung của họ Nho (Vitaceae)
Các cây thuộc họ Nho chủ yếu là dây leo thân gỗ có tua cuốn. Hoa mẫu
4-5, nhị đối diện với cánh hoa và dính mép ngoài của triền; lá thường xẻ thùy
chân vịt với gân chân vịt, hoặc lá kép chân vịt (gồm 3-5-7 lá chét), ít khi lá
khép lông chim; bộ nhụy gồm 2 lá noãn hợp thành bầu thượng 2(6) ô, mỗi ô
chứa 2 (1) noãn; thường là quả mọng; hạt thường có nội nhũ [1].
Họ Nho (Vitaceae) phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới.
Ở Việt Nam có 7 chi: Ampelocissus, Ampelopsis, Cayratia, Cissus,
Parthenocissus, Tetrastigma, Vitis; khoảng 85 loài [1].

1.2. Đặc điểm chi Ampelopsis.
1.2.1. Vị trí phân loại
Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, chi Ampelopsis được phân loại
như sau:
Giới thực vật: Plantae
Ngành ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp ngọc lan: Magnoliopsida

Bộ: Vitales
Họ: Vitaceae
Chi: Ampelopsis 1],3.
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Chi Ampelopsis có khoảng 30 loài là những loài đặc hữu của khu vực
châu Á và Trung, Bắc Mỹ [42]. Ở Ấn Độ và Trung Quốc có 5-6 loài được mô
tả. Ở Việt Nam, có tác giả ước tính tới 5 loài (Nguyễn Tiến Bân, 1997) [1].
Hầu hết các loài thuộc chi này phát triển ở các vùng núi có khí hậu ôn
đới. Tất cả các loài thuộc chi Ampelopsis là dạng dây leo thân gỗ có tua cuốn.
4

Ở một số loài, tua cuốn có thể ôm lấy hoa. Lá thường, chân vịt hoặc lá kép
chân vịt. Cụm hoa dạng xim, tràng hoa có 5 cánh tù. Quả mọng có 1 đến 4 hạt
hình trứng ngược [2].
1.2.3. Thành phần hóa học
Theo Xu. Zihong và cộng sự, lá chè dây (Ampelopsis cantoniensis
Planch) chứa flavon (4,73%), protein (9,25%) và giàu K
+
, Ca
2+
, Fe, Zn cùng
các vitamin E, B
1
, B
2.
Phạm Thanh Kỳ và cộng sự phát hiện lá chè dây tại Cao
Bằng có chứa flavonoid (18-19%), tanin (10,82-13,30%), đường và đã phân
lập và định lượng được 2 flavonoid tinh khiết từ lá chè dây bao gồm (+)
myricetin (1) và dihydro myricetin (2) [13].

(1) (2)
Theo Xu Z. và cộng sự, rễ cây A. brevipedunculata (Maxim) Trautv. có
chứa các hợp chất: β-amyrin, betulin, acid vanillic, ethyl gallat, kaempferol,
acid 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic, aromadendrol và resveratrol [37].
Trong rễ cây A. sinica (Miq.) W.T. Wang có chứa các hợp chất gồm:
lupeol, β-sitosterol, daucosterol, catechin, sucrose và acid palmitic. Đây là lần
đầu tiên lupeol được tìm thấy trong chi Ampelopsis [20].
Du Q. và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc một số flavonoid
glycosid từ loài A. grossedentata là: 5,7- dihydroxy-3 ', 4'-trihydroxyflavon-
3-O-6''-rhamnose và 5,7-dihydroxy-3', 4'-dihydroxyflavon-3 -O-6''-rhamnose,
đồng thời cũng phân lập được (+) - dihydromyricetin tinh khiết [24].
5

Yuan A. và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất gồm: ampelopsin,
ambrein, β-sitosterol, myricetin và myricitrin từ loài A. grossedentata (Hand
Mazz.) W.T. Wang [41].
Từ loài A. humulifolia var. heterophylla (Thunb.) K. Koch, Zhang Q.
và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của sáu hợp chất gồm: lupeol, β-
sitosterol, daucosterol, ethyl gallat, acid gallic và catechin [41].
1.2.4. Tác dụng dược lý
Cao khô chè dây (A. cantoniensis Planch) chứa các flavonoid
(myricetin, dihydro myricetin) có hoạt tính chống oxi hóa và ức chế sự phát
triển của một số chủng vi khuẩn, điều trị bỏng hiệu quả, điều trị loét dạ dày-
tá tràng, ức chế sự đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [2], [13].
Dịch chiết lá của loài A. grossedentata có khả năng gây ức chế sự co
động mạch chủ của thỏ đã tiêm noradrenalin và gây giãn cơ ở chuột đã tiêm
ethanol [32].
Yabe và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của loài
A.brevipedunculata (Maxim.) Trautv. (Vitaceae). Kết quả cho thấy, dịch chiết
ethanol 40% từ quả của loài này có khả năng làm giảm đáng kể mức độ tổn

thương gan, thông số đánh giá là: mức độ bị hoại tử của trung tâm tiểu thùy,
mức độ viêm sưng và xơ hóa của tế bào gan chuột đã được tiêm carbon
tetrachlorid [39].
Dịch chiết phân đoạn từ quả loài A. brevipedunculata (Maxim.) Trautv.
có khả năng gây ức chế sự hình thành các sợi collagen trong tế bào M của gan
chuột. Đồng thời dịch chiết này không làm giảm sự tổng hợp protein không
chứa collagen và không ảnh hưởng đến sự hình thành các tế bào không chứa
collagen [38].

6

1.3. Những nghiên cứu về cây Dâu dây Ampelopsis heterophylla Sieb. et.
Zucc. var. hancei Planch.
1.3.1. Đặc điểm thực vật:





Hình 1.1. Ảnh cây Dâu dây (Nguồn internet, www.plant.ac.cn)


Cây Dâu dây (hay cây nho rừng, nho dại) là dạng cây leo, thân cành hình
trụ, đôi khi có cạnh, khi non có lông rải rác rất nhỏ. Tua cuốn phân nhánh, đối
diện với lá. Lá mọc so le, hình tim, hơi chia thùy, dài và rộng gần bằng nhau, gốc
hình tim, đầu nhọn dài, mép khía răng thô, 5 gân chính tỏa từ gốc thành hình chân
vịt, hai mặt có lông mịn. Cụm hoa mọc thành ngù, đối diện với lá, ngắn hơn lá;
hoa màu vàng nhạt; đài hình chén, có lông, 5 răng nhỏ; tràng có 5 cánh tù, 5 nhị,
chỉ nhị rất mảnh, bao phấn gần tròn, bầu 2 ô. Quả mọng, màu xanh lơ hay tím
nhạt, có 3-4 hạt nhỏ. Mùa hoa quả: tháng 7-12. [1], [2], [10], [12].

Dâu dây còn có các tên khoa học là: Ampelopsis glandulosa var. hancei
(Planch.) Momiy.; Ampelopsis brevipedunculata var. hancei (Planch.)
Rehder.; Ampelopsis brevipedunculata var. hancei (Planch.) Li.; Ampelopsis
sinica var. hancei (Planch.) W.T.Wang [21].
7

1.3.2. Phân bố và sinh thái
Dâu dây phân bố tương đối rộng rãi từ các tỉnh vùng đồng bằng đến
trung du và vùng núi thấp. Cây thường leo lên các lùm bụi ở ven rừng, đồi, bờ
nương rẫy và đôi khi thấy ở cả quanh làng bản [2], [10].
Dâu dây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt.
Khi bị chặt phá nhiều lần cây vẫn có khả năng mọc chồi mới [2].
1.3.3. Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian [2], [10].
Dâu dây có vị ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng,
chữa phong thấp. Từ xưa, danh y Tuệ Tĩnh đã dùng dâu dây phối hợp với lá
thường sơn, hạt cau rừng, trần bì, thanh bì, sắc uống chữa sốt rét (Nam dược
thần hiệu).
Theo kinh nghiệm dân gian, cây dâu dây 40g phối hợp với gối hạc,
huyết giác, cẩu tích mỗi vị 20g, tất cả thái nhỏ phơi khô, sắc với 400ml nước
còn 100ml, chia làm 2 lần uống trong vài ngày. Dùng liên tiếp 5-7 ngày, chữa
đau quanh vai, lưng gối đau nhức, chân sưng phù.
Để chữa vết thương bầm tím sưng đau, lấy lá dâu dây tươi, giã nát,
chưng nóng đắp tại chỗ, kết hợp lấy rễ dâu dây phối hợp với dây đau xương
và huyết giác, mỗi vị 20g, sắc nước uống. Ở Lạng Sơn, đồng bào Tày dùng rễ
dâu dây thái nhỏ, phơi khô, ngâm rượu, uống chữa mệt mỏi trong khi lao
động nặng nhọc.
1.3.4. Thành phần hoá học:
Dong L. và cộng sự đã phân lập và nhận dạng cấu trúc của 8 hợp chất
bao gồm: β-sitosterol, β-daucosterol, lupeol, trans-resveratrol, piceid, acid
galic, n-butyl gallat và (+)-catechin từ rễ của loài A.sinica var. hancei (pl.)

W.T. Wang [23].
Oshima và cộng sự cũng đã phân lập và xác định cấu trúc của các
oligostilben là ampelopsin A (3), ampelopsin B (4), ampelopsin C (5),
ampelopsin D (6), ampelopsin E, cis-ampelopsin E, ampelopsin F (7),
8

ampelopsin G (8) và ampelopsin H. Đây là các hợp chất chính có trong loài
A.brevipedunculata var. hancei [31], [32], [33].

(3)

(4)

(5)


(6)


(7)


(8)
9

1.3.5. Tác dụng dược lý:
Dịch chiết cao cồn và dịch chiết nước thân, cành, lá và rễ của loài A.
brevipedunculata var. hancei có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp collagen
của tế bào gan và làm giảm lượng mỡ trong gan [31].
Dịch chiết methanol của A. brevipedunculata var. hancei cũng có tác

dụng trên gan, thí nghiệm được đánh giá bằng cách tiêm liều 1mg/ml vào tế
bào gan chuột đã làm tổn thương bằng cacbon tetraclorid hoặc D-
galactosamin. Nghiên cứu cho thấy phân đoạn dịch chiết có hoạt tính sinh học
chứa một số oligostilben và có tác dụng tốt đối với việc bảo vệ gan. Hơn nữa
phân đoạn ethyl acetat của dược liệu cũng có tác dụng giải độc gan rất tốt
[32],[33].
Ở Việt Nam chưa có công bố nào về tác dụng sinh học của cây Dâu
dây.













10

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu được thu hái tháng 11 năm 2012 tại Tam Đảo, Vĩnh
phúc gồm:
- Cành tươi mang hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu
khô.

- Cành tươi mang hoa, lá để làm tiêu bản vi học.
- Cành, lá phơi khô, thái nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô
ráo, thoáng mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất :
- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam III, IV.
- Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
- SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F
254
, RP
18
F
254s

(Merck).
- Sắc ký cột: Chất nhồi cột là Silica gel GF
254
, cỡ hạt 60-200 µm
(Merck), Silica gel Merck LiChroprep® RP-18, Sephadex LH-20.
- Các thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Baljet, Diazo…
2.2.2. Phương tiện và máy móc
- Kính hiển vi: Zeiss Axioskop 40.
- Kính soi nổi: Krussoptroni.
- Cân kỹ thuật Precisa.
- Tủ sấy Memmert.
- Máy xác định độ ẩm Satorius.
- Máy cắt vi phẫu cầm tay
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon.
11

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy Sỹ).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu bao gồm: Bơm LC-20AD,
detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn
nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Nhật Bản).
- Máy đo điểm nóng chảy Gallenkamp, Sanyo, Nhật Bản (Viện Dược
liệu).
- Máy đo quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu, Nhật Bản (Viện Dược
liệu).
- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin
Elmer (Viện Hóa học, VAST).
- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS – Water – API – ISI (Viện Hóa
học, VAST).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (
1
H- và
13
C-NMR) của hãng
Bruker (500MHz), Viện Hóa học, VAST.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Về thực vật
* Phân tích hình thái thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu phân loại
thực vật [9]
- Phân tích hoa trên kính lúp soi nổi và chụp ảnh bằng máy ảnh kĩ thuật số.
* Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [7], [8].
* Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [8], [9].
- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu
- Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật.

2.3.2. Về hóa học
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa
học.
12

Phần trên mặt đất (lá và thân cây) được đem sấy khô trong tủ sấy ở
nhiệt độ 60
0
C. Đem ra tán nhỏ lá và thân bằng thuyền tán thành bột thô, bảo
quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo để làm các phản ứng
hóa học định tính đối

với bột dược liệu và làm sắc ký lớp mỏng theo tài
liệu [6], [7].
2.3.2.2. Chiết xuất
* Xác định độ ẩm của dược liệu [5], [16], [17]:
Lấy 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh
nhiệt độ 110°C. Để dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân
và cho máy tự hoạt động, đợi khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả.
Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
*Định lượng các cắn [16], [17]:
Cân chính xác khoảng 100g dược liệu (phần trên mặt đất của cây Dâu
dây) đã xác định độ ẩm. Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết. Thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần. Hòa tan cao
MeOH toàn phần vào một lượng nước vừa đủ, thu được dịch chiết nước. Đem
dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-
hexan, ethylacetat và n-butanol, với mỗi loại dung môi lắc kỹ đến khi nào
dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết được cất
thu hồi dung môi ở 60
o

C, thu được cắn tương ứng. Chiết theo sơ đồ hình 2.1.
Cắn các phân đoạn được đem sấy ở nhiệt độ 40
o
C tới khối lượng không
đổi. Quá trình chiết xuất được lặp lại 3 lần. Hàm lượng cắn là kết quả trung
bình của 3 lần thực nghiệm. Xác định hàm lượng cắn trong từng phân đoạn
bằng phương pháp cân. Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công
thức:

13

Trong đó:
F: hàm lượng chất (%)
a: khối lượng cắn (g)
M: khối lượng dược liệu đã sấy khô (g)
x: độ ẩm của dược liệu (%)
2.3.2.3. Định tính cắn các phân đoạn
* Định tính cắn các phân đoạn:
Cắn ở các phân đoạn lần lượt được tiến hành định tính các nhóm chất
bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [5] [6].
 Định tính Alcaloid:
Cho khoảng 10g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm
bằng dung dịch amoniac đặc, đậy kín bình trong 30 phút. Cho thêm 15ml
chloroform, lắc đều, ngâm 12 giờ. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau
đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10 ml dung dịch H
2
SO
4
1N. Để phân lớp, gạn lấy
dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid.

+ Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Mayer
+ Ống 2: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Bouchardat.
+ Ống 3: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Dragendorff.
 Định tính glycosid tim:
Cho 20g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn
25
o
, lắc đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất
nhựa) bằng chì acetat 30% để dư. Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dung
dịch Na
2
SO
4
bão hòa đến khi không còn tủa với Na
2
SO
4
nữa. Lọc lấy dịch lọc
vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform : ethanol (4:1), mỗi lần
20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông. Chia đều
dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn
thu được để làm phản ứng định tính.
14

+ Phản ứng Liberman:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan
hết cắn. Nghiêng ống 45
o
. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H
2

SO
4
đặc
để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp.
+ Phản ứng Baljet:
Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid
picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết
cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha vào ống nghiệm.
+ Phản ứng Legal:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan
hết cắn. Nhỏ 1 giọt dung dịch natrinitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch
NaOH 10%.
+ Phản ứng Keller-Kiliani:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết
cắn. Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc
đều. Nghiêng ống 45
o
. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H
2
SO
4
đặc, tránh
xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm.
 Định tính saponin:
+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20ml, thêm vào
đó 5ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung
tích 20ml, thêm 5ml nước cất. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh
ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát.

+ Phản ứng Salkowski:
Cho vào bình nón 2g dược liệu, thêm 20ml ethanol 90%, đun sôi cách
thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm
45
o
, cho từ từ vào thành ống nghiệm 1-2 giọt acid H
2
SO
4
đặc.
15

 Định tính anthranoid:
+ Phản ứng Borntraeger:
Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml
dung dịch H
2
SO
4
10%. Đun cách thủy sôi trong 15 phút. Lọc nóng vào bình
gạn. Để nguội rồi lắc với 5ml chloroform. Gạn lớp chloroform để làm phản
ứng.
Cho vào 2 ống nghiệm:
Ống 1: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NH
4
OH 10%.
Ống 2: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NaOH 10%.
Lắc nhẹ.
+ Vi thăng hoa:
Đặt khoảng 3g bột dược liệu trong một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên bếp điện

cho bay hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên
phiến kính đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh. Để đĩa nhôm trực tiếp
trên bếp điện. Sau 5 – 10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển
vi.
 Định tính flavonoid:
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón 250ml, thêm 100ml ethanol 90%,
đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc để làm phản ứng.
+ Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH
3
: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô,
quan sát dưới ánh sáng thường thấy có màu vàng, sau đó hơ trên miệng lọ
amoniac đặc.
Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt
dung dịch NaOH 10%.
+ Phản ứng Cyanidin:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại,
rồi giỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc.
16

+ Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl
3
5%,
lắc nhẹ.
+ Phản ứng Diazo hóa:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng NaOH 10%. Thêm
vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút.

 Định tính coumarin:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml ethanol
90%. Đun cách thủy sôi trong 5 phút. Lọc nóng. Dịch lọc thu được để làm
phản ứng.
+ Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết.
Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: Để yên.
Đun sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội. Quan sát thấy:
Ống 1: Dung dịch có tủa vàng.
Ống 2: Trong
Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, thấy:
Ống 1: Dung dịch vẫn đục
Ống 2: Trong
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc.
+ Phản ứng Diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó 2ml dung dịch
NaOH 10%. Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử
Diazo mới pha.
+ Quan sát huỳnh quang:
Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho
khô. Nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%, hơ cho khô. Bịt một nửa phần giấy