Nghiên cứu quy trình chiết xuất và tác dụng giải lo âu trên thực nghiệm của cao chiết từ cây ban di thực hypericum perforatum l
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (567.66 KB, 49 trang )
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
TRẦN ANH HOÀNG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG GIẢI
LO ÂU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA
CAO CHIẾT TỪ CÂY BAN DI THỰC
HYPERICUM PERFORATUM L.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
TRẦN ANH HOÀNG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG GIẢI
LO ÂU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA
CAO CHIẾT TỪ CÂY BAN DI THỰC
HYPERICUM PERFORATUM L.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
1.
2.
Nơi thực hiện:
1.
2.
HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Để có được thành công của khóa luận này, lời đầu tiên em xin chân thành cảm
ơn sâu sắc đến TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng- Viện Dược liệu, người cô, người chị
luôn bên cạnh chỉ bảo cho em, hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin chân thành cảm ơn đến TS. Đào Thị Thanh Hiền và ThS.
Phạm Thái Hà Văn- Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội,
người cô và người thầy luôn hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp quý báu để
em hoàn thành tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn đến các chị Nguyễn Thu Trang, chị Tạ Thị
Thủy- Khoa hóa thực vật 1 và các anh chị Khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu
đã động viên giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt
khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Đảng ủy nhà trường
cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã trang bị đầy đủ kiến
thức và động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại
trường.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn là
chỗ dựa tinh thần, là những nguồn động viên to lớn đối với em ttrong cuộc sống và
học tập.
Sinh viên
Trần Anh Hoàng
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
2
1.1. Lịch sử sử dụng cây Ban Âu
2
1.2. Thành phần hóa học
3
1.3. Tác dụng dược lý
8
1.4. Các quy trình chiết xuất Ban Âu trong và ngoài nước
12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
15
15
15
15
15
2.2. Nội dung nghiên cứu
16
2.3. Phương pháp nghiên cứu
16
16
17
19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
21
3.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng hypericin
21
3.2. Khảo sát quy trình chiết cao Ban di thực
22
22
23
25
26
27
3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu trên chuột.
31
3.4. Bàn luận
32
32
33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Acid Deoxyribo Nucleic
AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miến dịch
mắc phải)
ARN
Acid ribonucleic
EtOAc
Ethylacetat
EtOH
Ethanol
Glc
Glucosyl
HIV
Human immunodeficiency virus (virus gây suy giảm miễn dịch ở người)
HPLC
High-Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IC50
nồng độ ức chế mức 50%
LT
Light therapy ( liệu pháp ánh sáng)
Rha
Rhamnosyl
SAD
Seasonal affective disorder (trầm cảm theo mùa)
SSRI
Selective serotonin reuptake inhibitor (nhóm thuốc ức chế tái hấp thu
chọn lọc serotonin)
USP
United States Pharmacopoeia (Dược điển Hoa Kỳ)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
Trang
Bảng 3.1. Diện tích pic sắc ký của hypericin ở các nồng độ khác nhau
21
Bảng 3.2. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết bằng cồn
các nồng độ khác nhau.
23
Bảng 3.3. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết ở các tỷ
lệ dược liệu/dung môi khác nhau.
24
Bảng 3.4. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết khi cho
vào lượng vtamin C khác nhau.
25
Bảng 3.5. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết ở các
nhiệt độ khác nhau.
26
Bảng 3.6. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết với thời
gian chiết khác nhau.
27
Bảng 3.7. So sánh quy trình chiết xuất Ban âu trong và ngoài nước
30
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm naphthodianthron
4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm phloroglucinol
5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học một số chất nhóm flavonoid.
6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học một số chất nhóm biflavonoid.
7
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học một số chất nhóm phenylpropanoid.
7
Hình 1.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao chứa hypericin từ dược liệu
Ban Âu.
14
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic sắc ký của hypericin.
21
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất với các điều kiện đã khảo sát
29
Hình 3.3. Biểu đồ hình cột biểu diễn thời gian chuột ở vùng trung tâm
(giây).
31
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Ban Âu là một cây thuốc quý được sử dụng ở Châu Âu từ cách đây 2000
năm. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về cây Ban Âu với các thành phần
chính như hypericin, hypeforin, flavonoid, [20][45][49][52][59] có tác dụng giải lo
âu qua đó làm mất các tình trạng u sầu, buồn chán, thất vọng lấy lại thăng bằng
cuộc sống, do đó cây Ban Âu đang được sử dụng để điều trị bệnh trầm cảm thể nhẹ
[15][30][37][40][42][54]. Ngoài ra cây Ban Âu còn có tác dụng chống viêm, kháng
khuẩn, kháng virus [9][21] Hiện nay tại Châu Âu, đã có rất nhiều sản phẩm từ cây
Ban Âu được phép lưu hành thị trường dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như
thuốc mỡ, viên nén, viên nang
Cây Ban Âu khi di thực về Việt Nam với tên gọi là Ban di thực đã được Viện
Dược liệu trồng thử nghiệm tại trạm nghiên cứu Sa Pa, Tam Đảo, Hà Nội và Tân
Lạc - Hòa Bình cho thấy cây phát triển tốt, cho hàm lượng hypericin cao [1]. Đã có
nghiên cứu về quy trình chiết xuất cao Ban di thực tại Việt Nam tuy nhiên chưa
nghiên cứu sâu cũng như chưa có nghiên cứu về tác dụng giải lo âu của cao chiết
cây Ban di thực này.
Vì vậy, việc nghiên cứu cây Ban di thực về Việt Nam là một vấn đề cần quan
tâm và có ý nghĩa thực tiễn. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy
trình chiết xuất và tác dụng giải lo âu trên thực nghiệm của cao chiết từ cây
Ban di thực Hypericum perforatum L.” Với 2 mục tiêu:
- Nghiên cứu quy trình chiết xuất cây Ban di thực để thu được sản phẩm có
hàm lượng hypericin cao.
- Đánh giá tác dụng giải lo âu của cao chiết trên chuột nhắt trắng.
2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
Cây Ban Âu hay cây cỏ Thánh John (St. John’s Wort) có tên khoa học là
Hypericum perforatum L. thuộc họ Ban (Hypericaceae). Cây có nguồn gốc tự nhiên
ở Châu Âu, Tây Á, Bắc Phi và cũng phân bố rộng rãi Bắc Mỹ và Australia. Cây Ban
Âu là cây thuốc cổ truyền của các nước châu Âu và hiện là một cây thuốc có tiếng
nhất trong điều trị trầm cảm trên thế giới.
Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất của cây.
1.1. Lịch sử sử dụng cây Ban Âu [24]
Ban Âu đã được sử dụng để điều trị các chứng suy nhược cơ thể, làm lành vết
thương từ hơn 2400 năm trước. Bác sỹ người Hy Lạp ở thế kỷ thứ nhất Galen và
Dioscorides đã giới thiệu nó là một loại thuốc lợi tiểu, chữa lành vết thương và điều
hòa kinh nguyệt.
Vào thế kỷ thứ 16, Paracelsus đã sử dụng Ban Âu để điều trị vết thương ngoài
da và làm dịu cơn đau. Nó được coi như một loài thảo dược đặc biệt có những đặc
điểm bí ẩn. Line là người phát hiện và đặt tên cho cây là Hypericum perforatum L.
nhưng cây thường được biết đến qua tên St. John’s Wort vì loại cây này nở hoa màu
vàng rất đẹp vào ngày kỷ niệm sinh nhật Thánh John, 24 tháng Sáu mỗi năm. Tên
chi Hypericum được bắt nguồn từ một từ Hy Lạp – Hyper là ở trên và eikon là bức
ảnh nói đến truyền thống sử dụng cây để phòng trừ quỷ dữ bằng cách treo cây trong
nhà trong ngày lễ Thánh John. Tên loài chỉ sự có mặt của tuyến dầu nhỏ trong lá,
mà khi giữ dưới ánh sáng nhìn nó giống như ô cửa sổ.
Vào thời Trung cổ, Ban Âu đã được dùng để trừ ma qủy, làm trong sạch
không khí. Từ nhiều thế kỷ trước, nó được coi như có thể chữa được bệnh u sầu,
nhiễm trùng đường tiểu, diệt vi trùng, làm lành vết thương ngoài da.
Vào thế kỷ 19, King (1876) đã viết trong American Dispensatory về việc dùng
Ban Âu để chữa ỉa chảy, bệnh vàng da, trầm cảm và u sầu. Một dạng cồn thuốc từ
Ban Âu đã được chính thức đưa vào sử dụng chữa đau cột sống, choáng, sốc, chứng
kích động.
3
Duke (1985) liệt kê các bệnh được điều trị bằng Ban Âu theo dân gian gồm có:
hen phế quản, ỉa chảy, lỵ, suy nhược thần kinh, trầm cảm, kích động, bệnh dại, thiếu
máu, giun sán, ung thư tử cung, ung thư đường niệu, ung thư dạ dày và u lympho.
Từ những năm 1970 trở lại đây, Ban Âu đã trở thành một trong những cây
thuốc được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cả trong phòng thí nghiệm và trên lâm
sàng. Hàng loạt các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa học, dược lý, dược động
học đã được thực hiện. Các thành phần hoạt chất chính đã được xác định là
naphthodianthron, anthroglycosid, flavonoid và phloroglucin. Cây thuốc này đã trở
nên một cây thuốc phổ biến trong điều trị trầm cảm mức độ nhẹ và trung bình. Các
chế phẩm từ Ban Âu được bán ở khắp các siêu thị và nhà thuốc ở Mỹ và châu Âu.
1.2. Thành phần hóa học
Thành phần các chất đã được xác định có trong cây Ban Âu bao gồm:
naphthodianthron, phloroglucinol, flavonoid, biflavon, phenylpropanoid và
proanthocyanidin. Ngoài ra, còn có một lượng nhỏ tannin, xanthon, tinh dầu và acid
amin.
1.2.1. Naphthodianthron
Các hợp chất này là thành phần đặc trưng của chi Hypericum. Chúng có màu
đỏ tươi và có tính quang động. Hypericin và pseudohypericin là các chất chính
thuộc nhóm này đã được phân lập từ ban Âu. Các dẫn chất proto của chúng là
protohypericin pseudoprotohypericin cũng đã được phân lập nhưng chúng không
bền và dễ dàng chuyển thành hypericin và pseudohypericin [20][45][49].
4
OH O H
O HH
3
C
O HR
O HOH
O
O
Hypericin R= CH
3
Pseudohypericin R= CH
2
OH
OH OH
O HH
3
C
O HR
O HOH
O
O
Protohypericin R = CH
3
Pseudoprotohypericin R= CH
2
OH
1.1.
Hypericin và pseudohypericin có chủ yếu trong hoa và lá ban Âu. Hàm lượng
của chúng thay đổi theo thời kỳ sinh trưởng của cây và cao nhất khi cây ra hoa (từ
0,03% - 0,3% so với dược liệu khô). Hàm lượng pseudohypericin thường cao hơn
hypericin 2 đến 4 lần [15].
Các hợp chất naphthodianthron này rất ít tan trong hầu hết các dung môi.
Hypericin tinh khiết hầu như không tan trong nước ở điều kiện thường. Hypericin
tan trong các dung dịch kiềm, các bazơ hữu cơ như pyridin và các dung môi hữu cơ
phân cực như aceton, methanol, ethyacetat, ethyl methyl ceton. Khi tan trong các
dung dịch này, hypericin tạo ra các dung dịch màu đỏ có bước sóng phát xạ là
600nm [2].
Hypericin và dẫn chất là thành phần đặc trưng và đáng chú ý nhất trong ban
Âu do chúng có tác dụng chống ung thư, chống virus và chống trầm cảm. Đặc biệt,
hypericin là một trong những hợp chất tự nhiên nhạy cảm ánh sáng nhất. Đặc tính
này đã được khai thác sử dụng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư vì
hypericin kết hợp với ánh sáng rất hiệu quả trong việc gây chết theo chương trình
hoặc gây hoại tử tế bào ung thư [3][6].
5
1.2.2. Phloroglucinol
O OH
OO
R
Hyperforin R = H
Adhyperforin R = CH
3
O OH
OO
R
Hyperfirin R = H
Adhyperfirin R = CH
3
1.2
Hai hợp chất phloroglucinol đã xác định được trong Ban Âu là hyperforin
(2,0% - 4,5%) và adhyperforin (0,2% - 1,9%) [20][24][33][45]. Chúng chỉ tìm thấy
trong hoa và quả: khoảng 2% trong hoa, 4,4% trong quả chín và 4,5% trong quả
xanh [53]. Furohyperforin và oxepahyperforin, các sản phẩm oxy hóa của
hyperforin cũng được tìm thấy với hàm lượng thấp trong dược liệu Ban Âu
[52][58]. Hypefirin và adhyperfirin cũng được phân lập và xác định trong Ban Âu ở
Hy Lạp [20].
Hyperforin rất kém bền, đặc biệt trong dung dịch nước và khi tiếp xúc ánh
sáng và nhiệt độ cao [32]. Không thấy có hoặc có rất ít chất này trong các loại chế
phẩm và trà từ Ban Âu.
Hyperforin có tác dụng ức chế hoặc điều hòa một số hệ dẫn truyền thần kinh,
ức chế mạnh serotonin, dopamin và noradrenalin với IC
50
khoảng 0,5mg/L [18]. Do
đó có thể nó cũng có vai trò trong tác dụng chống trầm cảm của dược liệu Ban Âu.
Ngoài ra, hyperforin còn được chứng minh là chất chống ung thư [48], chống ký
sinh trùng sốt rét [55].
6
1.2.3. Flavonoid
Flavonoid là một nhóm hoạt chất có hàm lượng 2-4% trong dược liệu Ban Âu.
Các flavonol aglycon đã phân lập được gồm có kaempferol, luteolin, myricetin và
quercetin [20][35][36][45]. Trong các glycosid phân lập được từ Ban Âu có
hyperosid (hyperin) rutin, quercitrin, isoquercitrin, miquelianin và astilbin
[16][20][45][46].
Các flavonoid trong Ban Âu cũng góp phần vào tác dụng chống trầm cảm của
dược liệu này và được chứng minh là các chất hiệp đồng tăng cường tác dụng của
các hoạt chất như hypericin [15][59].
Ngoài ra, các flavonoid trong Ban Âu cũng có hoạt tính kháng khuẩn [35].
OHO
OH
OH
OH
O
OR
Quercetin R = H
Hyperosid R = Gal
Rutin R = Glc-Rha
Quercitrin R = Rha
Isoquercitrin R = Glc
OHO
OH
OH
OH
O
O
Rhamnosyl
Astilbin
1.3
1.2.4.
Có 3 biflavon được xác định có trong Ban Âu là 3,8’’-biapigenin (0,1–0,5%),
amentoflavon (0,01–0,05%)[20][36] và 6’,8’’-diquercetin[29]. Amentoflavon đã
được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm đau và có thể gắn vào các receptor
của benzodiazepin ở não với ái lực có thể sánh với diazepam[8][15][27][38].
7
OHO
OH O
OH
O
HO
OH O
OH
Amentoflavon
OHO
OH
OH
O
O
HO
OH O
OH
3,8’’-Biapigenin
1.4.
1.2.5. Phenylpropanoid
Acid chlorogenic được xác định có khoảng 1% trong cao chiết Ban Âu [20]
[36]. Ngoài ra còn có acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid isoferulic, acid
gentisic và acid shikimic [24].
O
O
OH
HO
HO COOH
OH
R
Acid chlorogenic R = OH
Acid p-coumaric R = H
OH
O
RO
HO
Acid caffeic R = H
Acid ferulic R = CH
3
1.5.
1.2.6.
Tinh dầu của Ban Âu chứa các hợp chất aliphatic (2-methyl octan, n-nonan, n-
decan, n-undecan, n-tetradecanol, 2-methyl-decan và 2-methyl-dodecan) và
terpenoid (-pinen, -pinen, geraniol, -caryophyllen, -farnesen, humulen và
germacren D) [4].
8
1.2.7.
- Hợp chất xanthon: 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon và kielcorin C (0,01%).
- Carotenoid, choline, nicotinamid, -sitosterol, acid béo, aminoacid, vitamin
C, pectin, tannin hydroperoxycadiforin [24].
1.3. Tác dụng dƣợc lý
Cây Ban Âu có rất nhiều tác dụng điều trị bệnh khác nhau. Những tác dụng
dược lý của cây do các thành phần đa dạng của cây đem lại, đặc biệt là hai thành
phần hypericin và hyperforin.
1.3.1.
Một trong những tác dụng rõ rệt nhất của Ban Âu phải kể đến là tác dụng
chống trầm cảm, trong đó 2 thành phần hypericin và hyperforin được cho là những
hoạt chất đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này.
Cơ chế tác dụng chống trầm cảm của hypericin là do ức chế sự tạo thành
cytokine interleukin 6 và 1β ở bạch cầu đơn nhân, dẫn đến làm giảm giải phóng
corticotropin, do đó giảm sự tạo thành cortisol [55]. Hypericin cũng có thể ức chế tái
thu hồi serotonin, norepinephrine và dopamine dẫn đến giảm mức độ biểu hiện của
beta adrenoreceptor và tăng mức độ biểu hiện của receptor serotonin 5-HT2A và 5-
HT1A [37][42][54].
Những nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng hyperforin cũng có thể là thành
phần có tác dụng chống trầm cảm [15][30]. Rất nhiều cơ chế chống trầm cảm khác
nhau của hypeforin đã được giả định, bao gồm ức chế sự tái thu hồi serotonin,
norepinephrine và acetylcholine. Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng hyperforin
tác động đến serotonin, dopamin, norepinephrine, acid γ-aminobutyric, và L-
glutamate, mặc dù serotonin được cho là đóng vai trò quan trọng nhất [43]. Ngoài ra
còn có một số cơ chế khác như giảm biểu hiện beta adrenoreceptor ở vỏ não và
receptor 5-HT2 và giải phóng synaptosome [42].
Một số thành phần khác của Ban Âu như flavonoid cũng có tác dụng ức chế
monoamine oxidase A [10][42][56].
9
Các chiết xuất từ các loại thảo dược wort St. John (Hypericum perforatum) đã
được sử dụng trong nhiều thế kỷ ở nhiều dân gian và thảo dược. Hiện nay ở châu Âu,
nó được sử dụng rộng rãi để điều trị trầm cảm nhẹ đến trung bình. Ở Hoa Kỳ, nó là
một trong các sản phẩm thực vật bán chạy hàng đầu. Trong một thử nghiệm 8 tuần
liên quan đến 340 bệnh nhân được chẩn đoán với trầm cảm nặng, wort St. John đã
được so sánh với một SSRI phổ biến và giả dược (viên đường). Cuộc thử nghiệm
thấy rằng wort St. John là không có hiệu quả hơn việc giả dược trong điều trị trầm
cảm nặng. Tuy nhiên, việc sử dụng Wort St. John cho trầm cảm nhẹ hoặc vừa phải có
thể có hiệu quả hơn [40].
Ban Âu được sử dụng điều trị trầm cảm theo mùa. Nghiên cứu cho thấy rằng
điều trị bằng thuốc với Ban Âu có thể là một liệu pháp hiệu quả ở những bệnh nhân
bị rối loạn tình cảm theo mùa [34].
Nói chung, có rất nhiều công trình nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác dụng
chống trầm cảm của Ban Âu so với giả dược (Placebo) và thuốc chuẩn. Theo thống
kê, có khoảng 35 – 40 bài báo nghiên cứu lâm sàng, trong đó có 26 nghiên cứu được
so sánh với giả dược và 14 nghiên cứu so sánh với thuốc chuẩn điều trị trầm cảm.
Phần lớn các nghiên cứu đều chỉ ra rằng Ban Âu có hiệu quả chống trầm cảm được so
sánh với amitryptilin, imipramin, fluoxetin [22][34][50][60].
Hiện nay Ban Âu được biết đến nhiều nhất như một thảo dược để điều trị bệnh
trầm cảm. Ở một số nước như Đức, Ailen thông thường nó được dùng để điều trị
bệnh trầm cảm nhẹ, đặc biệt đối với trẻ em, thanh thiếu niên và những vùng dân
nghèo.
Trường đại học Duke được Viện Quốc Gia Bệnh Tâm Thần trợ cấp trên 4 triệu
đôla để thực hiện dự án trong 3 năm nghiên cứu sự an toàn và công hiệu của Ban Âu
trong việc trị bệnh trầm cảm.
Tại Châu Âu, đặc biệt ở Đức, Ban Âu thường là loại thuốc được các bác sĩ kê
đơn cho bệnh nhân bị bệnh trầm cảm mức độ nhẹ và vừa.
10
Hiện nay ở Hoa Kỳ, Ban Âu được rất nhiều người dùng để chữa trầm cảm vì
được coi là an toàn, công hiệu, rẻ tiền và không cần bác sĩ kê đơn.
1.3.2.
Trong những năm gần đây, nhiều người cho rằng quá nhiều gốc tự do trong cơ
thể hoặc một số yếu tố môi trường khác như các thuốc diệt côn trùng, đặc biệt là
rotenon có thể dẫn đến Parkinson. Vì vậy, với đặc tính chống oxi hóa, cây Ban Âu
được lựa chọn thử nghiệm trên mô hình động vật mắc bệnh Parkinson gây ra bởi
rotenon. Để xác định thành phần nào trong cây có hoạt tính chống oxi hóa thần kinh,
nhóm nghiên cứu ở Đại học Complutense tại Madrid (UCM) đã tiến hành nhiều thí
nghiệm với các chiết xuất từ ban Âu. Kết quả cho thấy dịch chiết từ loài thực vật này
có tác dụng làm giảm tác hại của rotenon trên mô hình động vật. Các thông số về
nồng độ các enzym chống oxy hóa như superoxid dismutase, catalase, glutathione
peroxidase chứng tỏ dịch chiết từ Ban Âu làm tăng nồng độ các loại enzym này. Tác
động bảo vệ neuron thần kinh ở vùng chất đen trong não (Substantia Nigra) cao nhất
ở lô thí nghiệm với dịch chiết chứa 0,3% hypericin. Điều này cho thấy hoạt tính
chống oxi hóa của cây do nhiều thành phần hợp thành [1].
1.3.3.
Hypericin là thành phần có tác dụng điều trị ung thư. Cơ chế tác động của
hypericin là kính thích hình thành các gốc tự do dưới tác dụng của ánh sáng và chính
sự sản xuất các gốc tự do này dấn tới phản ứng gây độc cho tế bào ung thư. Do đó, nó
được dùng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư [3][5][6][25].
Hypericin có tác dụng chống ung thư trong liệu pháp quang động dưới sự có
mặt của ánh sáng [6], hoạt động chống ung thư trong bóng tối của hypericin cũng đã
được nghiên cứu [11][25][56].
Những nghiên cứu về hyperforin cũng đã chứng minh rằng hoạt chất này có tác
dụng chống khối u trên động vật và in vitro [25]. Hyperforin có tác dụng ức chế sự
sinh trưởng đối với ung thư vú ở người và ở động vật in tro cũng như trên các dòng tế
bào ung thư tế bào sừng, ung thư hắc tố, ung thư hạch bạch huyết tốt hơn hoặc bằng
11
những thuốc chống ung thư như camptothecin, paclitaxel và vincristin. Hyperforin
gây chết tế bào khối u theo chương trình thông qua sự hoạt hóa ty thể, giải phóng
cytochrome c và hoạt hóa capase [46].
1.3.4.
Ban Âu được các chuyên viên về bệnh AIDS của Viện Ung Thư Quốc Gia
Hoa Kỳ nghiên cứu vì hoạt chất của cây này có tác dụng chống một vài loại virus,
trong đó có HIV.
Hypericin là thuốc thử chống virus mạnh và được dùng để ức chế
Murinecyomegalo virus (MCMV), Sindbis virus, HIV loại 1[9], đặc biệt trong khi
có mặt của ánh sáng huỳnh quang.
Tác dụng chống virus H5N1 đã được các nhà khoa học Trung Quốc tiến hành
nghiên cứu và thu được kết quả rất tốt. Kết quả cho thấy chất hypericin được chiết
xuất từ thảo dược có thể chữa khỏi 100% gia cầm nuôi bị cấy virus H5N1 và cũng
có tác dụng phòng chống đối với virus cúm gia cầm týp A H9N2 [2][9].
1.3.5.
Theo truyền thống Hy Lạp, cây Ban Âu còn được sử dụng để chống viêm. Cơ
chế chống viêm là do sự ức chế prostaglandin E
2
. Tác dụng chống viêm do nhiều
thành phần quyết định [9][21]. Ngoài ra, câu Ban Âu còn kìm hãm, ức chế sự phát
triển của vi khuẩn [35][47].
Dầu của cây Ban Âu còn được sử dụng để làm liền sẹo, làm thuốc chống viêm,
làm lành vết thương và làm dịu chỗ đau nhanh chóng [9]. Nó dùng để điều trị sẹo,
bong gân, vết bỏng, sưng tấy da bên ngoài hay những vết thương của mô thần kinh.
Chính phủ Đức cho phép các chất của Ban Âu được gắn nhãn mác để điều trị các
vết thương trầy da hay các cơn đau, chứng đau cơ, vết bỏng. Kết quả điều trị bằng
dược liệu này đều cho tác dụng tốt.
Do hiệu quả điều trị chống trầm cảm của cây Ban Âu và thực tế cho thấy cả
trầm cảm và chứng nghiện rượu đều có chung những chất dẫn truyền thần kinh nên
loại thực vật này cũng đã được nghiên cứu về tác dụng có lợi đối với những người
12
nghiện rượu. Những khảo sát trên người tình nguyện đã cho thấy mức độ uống rượu
ở những đối tượng này đã giảm đáng kể sau khi dùng cao chiết Ban Âu[44].
1.3.6.
Khi sử dụng Ban Âu để điều trị trầm cảm, có thể sẽ có một số tác dụng phụ
không phổ biến hoặc nhẹ như khô miệng, chóng mặt, táo bón, vấn đề về dạ dày -
ruột, và nhầm lẫn [51].
Hypericin là chất có tính nhạy cảm với ánh sáng mạnh vì vậy một số nghiên
cứu đã chỉ ra rằng Ban Âu có thể gây ảnh hưởng đến da và mắt do tính nhạy cảm
với ánh sáng [13][23][31].
Ngoài ra, dịch chiết của Ban Âu có xảy ra tương tác thuốc khi sử dụng một số
liệu pháp điều trị khác. Tương tác của những thuốc này thông qua enzyme CYP-
450-3A4 trong gan làm giảm hoạt tính của một vài thuốc như warfarin, cyclosporin,
thuốc tránh thai, theophylline [7][35][36]. Do vậy, cảnh báo đối với những bệnh
nhân dương tính với HIV đang điều trị chất ức chế protease, bệnh nhân ung thư
đang được điều trị hóa trị liệu, và những bệnh nhân ghép cơ quan đang điều trị
thuốc ức chế miễn dịch không nên dùng kết hợp với Ban Âu. Không nên dùng kết
hợp giữa Ban Âu với thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc thu hồi serotonin SSRI
[26].
1.4. Các quy trình chiết xuất Ban Âu trong và ngoài nƣớc
1.4.1.
Viện Dược liệu đã nghiên cứu di thực thành công cây Ban Âu Hypericum
perforatum L. trong đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu di thực và quy trình trồng
trọt cây ban Hypericum perforatum L. để chiết xuất sản phẩm chứa hypericin”
từ năm 2007 – 2011. Kết quả của đề tài cho thấy cây Ban Âu phù hợp với điều kiện
khí hậu và đất đai của các vùng có khí hậu mát như Tam Đảo, Mai Châu, Mộc
Châu, Sa Pa. Cây Ban di thực này có hàm lượng hoạt chất hypericin khá cao (>
0,1% trong khi tiêu chuẩn dược điển châu Âu là 0,08% và tiêu chuẩn Mỹ USP 25 là
0,04%)[57]. Quy trình chiết xuất dùng cồn 60-70% làm dung môi chiết dược liệu.
13
Việc loại tạp nâng cao hàm lượng hypericin được thực hiện bằng cách dùng aceton.
Dịch chiết aceton sau đó được cô áp suất giảm và sấy chân không đến khô kiệt thu
được cao khô tơi màu nâu sẫm. Sản phẩm chứa > 0,7% hypericin từ dược liệu di
thực (hình 1.6).
1.4.2.
Đã có nhiều tác giả ở các nước đăng ký bản quyền phát minh sáng chế các quy
trình chiết xuất hoạt chất chống trầm cảm từ Ban Âu.
Theo Erdelmeier et al. (2001), từ 1 kg dược liệu Ban Âu, chiết với cồn 70% có
thể thu được 0,44 kg cao chiết toàn phần. Khi chiết bằng n-heptan thì hiệu suất sản
phẩm cao thu được là 5,25% so với dược liệu ban đầu nhưng sản phẩm chứa hàm
lượng hyperforin cao hơn chiết cồn (1,7% so với 0,37%) [19]. Phương pháp chiết
bằng CO2 siêu tới hạn cũng được Erdelmeier et al. (2001) và Castor et al. (2001) sử
dụng, cho sản phẩm khá ổn định với hiệu suất chiết sản phẩm là 2,6%, chứa 1,9%
hyperforin [17][19].
Bombardelli et al. (2002) không dùng cao chiết toàn phần mà xây dựng quy
trình chiết xuất dược liệu bằng methanol hoặc aceton và sau đó loại tạp để nâng cao
hàm lượng các hoạt chất trong sản phẩm bằng cách hòa cao toàn phần với nước và
chiết theo phương pháp ngược dòng với dung môi hữu cơ (ethyl acetat hoặc butyl
acetat). Sản phẩm cao chiết thu được từ pha dung môi hữu cơ được tiếp tục tinh chế
bằng dung dịch acid citric loãng trong cồn 95% thu được sản phẩm chứa 20%
hyperforin, 0,9% hypericin và 1% diapigenin với hiệu suất 8% so với dược liệu ban
đầu [12]. Một phương pháp loại tạp và tinh chế khác đã được Koch et al. (2007) sử
dụng là đưa cao toàn phần lên cột Diaion HP-20, rửa giải bằng ethanol 92% và
aceton 100% thu được sản phẩm chứa 6,3% hyperforin, 0,5% hypericin và 6,4%
flavon [28].
Các biện pháp ổn định sản phẩm, chống oxy hóa hoạt chất đã được Erdelmeier
et al. (2001), Koch et al. (2007) sử dụng gồm có: sục khí trơ cho dung môi chiết,
tránh ánh sáng, dùng chất phụ gia chống oxy hóa như acid ascorbic [19][28].
14
1.6.
Bột dược liệu (1 kg)
10 lít cồn chiết ở 55ºC/1h lọc dịch
chiết qua vải
Bã dược liệu
Dịch chiết 1
Dịch chiết 3
Dịch chiết 2
Bã dược liệu
Bã dược liệu
10 lít cồn chiết ở 55ºC/1h lọc
dịch chiết qua vải
10 lít cồn chiết ở 55ºC/1h
lọc dịch chiết qua vải
Cô áp suất giảm, tº< 50ºC đến dịch
đặc thêm EtOH 70% thành 0,5 lít,
khuấy kỹ
Dịch đặc 0,5l
Thêm 5 lít aceton khuấy kỹ để lắng
qua đêm, gạn dịch trong
Dịch aceton
Cô áp suất giảm, tº< 50ºC
đến dịch đặc
Cao đặc
Sản phẩm
Sấy chân không, tº<60ºC đến khô
15
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
Phần trên mặt đất của cây Ban di thực từ Nhật Bản được trồng tại Trạm nghiên
cứu cây thuốc Tam Đảo mùa vụ 2013-2014 được thu hoạch khi cây bắt đầu ra hoa
vào tháng 8/2014. Dược liệu sau khi phơi khô có:
- Độ ẩm 9,77%.
- Tro toàn phần 6,4%.
- Hàm lượng hypericin (%) phương pháp HPLC so với chất chuẩn ( phytolab-
Đức) là 0,19%.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng trung bình 20 -22 g cung cấp bởi
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được nuôi ổn định ít nhất 1 tuần trước khi tiến
hành thí nghiệm.
2.1.3
- Dung môi chiết xuất được sử dụng để chiết suất là EtOH công nghiệp cất lại.
- Dung môi dùng để pha chế định lượng là dung môi tinh khiết Trung Quốc:
acetonitril, methanol
- Dung dịch Hypericin chuẩn của phytolab – Đức.
2.1.4
- Dụng cụ bình cầu, bình nón, bình chiết quả lê, phễu lọc, của các hãng
Bomex, IsoLAB.
- Bếp cách thủy các cỡ cho bình chiết từ 100ml, 250ml, 500ml, 1 lít.
- Máy xay dược liệu.
- Cân kỹ thuật Sarturius TE612.
- Cân phân tích Sarturius CPA 224S- Viện Dược liệu
- Máy cất quay Rotavapor R-200 của hãng Buchi- Viện Dược liệu
16
- Máy xác định độ ẩm Presica HA60 – Viện Dược liệu
- Máy HPLC Shimadzu - Viện Dược liệu.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết cao Ban di thực để thu được bán thành
phẩm có hàm lượng hypericin cao thông qua khảo sát các yếu tố: dung môi, nhiệt
độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, chất chống oxy hóa.
- Nghiên cứu tác dụng giải lo âu của cao chiết trên chuột nhắt trắng bằng thử
nghiệm hành vi khám phá không gian.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
hypericin
Tham khảo Dược điển Châu Âu và Dược điển Hoa Kỳ [57], ta tiến hành
phương pháp HPLC định lượng hypericin bằng phương pháp đường chuẩn.
*Nguyên tắc:
Nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
*Chuẩn bị mẫu thử
- : Cân chính xác khoảng 1 (g) dược liệu vào bình cầu tối màu
(tránh ánh sáng), bổ sung chính xác 50 ml hỗn hợp dung môi Acetonitril : methanol
(tỷ lệ 1:1), để yên khoảng 5 phút, đem cân thu được khối lượng m
1
. Tiến hành chiết
hồi lưu ở 60ºC trong 2 giờ, sau đó để yên về nhiệt độ phòng, đem cân và bổ sung
đến khối lượng m
1
bằng hỗn hợp dung môi chiết. Tiến hành lọc thu được dịch chiết,
dịch chiết được lọc qua màng cellulose 0,45 µm thu được dịch phân tích HPLC có
nồng độ chính xác khoảng 20 mg/ml.
- : Cân chính xác khoảng 0,2g cao, cho vào bình định mức 10ml.
Bổ sung chính xác hỗn hợp dung môi Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1). Lọc qua
màng lọc cellulose 0,45 µm thu được dung dịch phân tích.
17
*Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn Hypericin, hòa tan hoàn toàn trong
chính xác 5 ml hỗn hợp Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1), lắc đều, thu được dung
dịch Hypericin chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml. Từ dung dịch này, tiến
hành pha loãng bằng hỗn hợp Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1) để thu được các
dung dịch chuẩn với nồng độ nhỏ hơn.
Tất cả các dung dịch này đều được lọc qua màng cellulose 0,45 µm trước khi
tiến hành phân tích HPLC.
*Điều kiện sắc ký
- Cột: C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động: Acetonitril : methanol : nước (50 : 20 : 30)
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Chế độ rửa giải: đẳng dòng
- Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl
- Bước sóng định lượng: 590 nm.
*Xử lý kết quả:
Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị
HPLC. Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với diện tích pic được thiết lập bằng
phương pháp bình phương tối thiểu với hệ số tương quan.
Sử dụng các phương pháp thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc
trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsolf Office Excel.
2.3.2.
Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao Ban di thực giàu hypericin dựa
vào việc khảo sát lựa chọn: dung môi chiết xuất, tỷ lệ dược liệu/dung môi chiết
xuất, lượng vitamin C cho vào quy trình chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, thời gian
chiết xuất.
