Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của streptomycin 184 223

BỘ Y TẾ
TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI



NGUYỄN TIẾN TUẤN

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HP KHÁNG
SINH CỦA STREPTOMYCES 184.223

KHA LUN TT NGHIP DƯC S




H NỘI – 2015





BỘ Y TẾ
TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI

NGUYỄN TIẾN TUẤN

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HP KHÁNG SINH
CỦA STREPTOMYCES 184.223

KHA LUN TT NGHIP DƯC S



Ngưi hưng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thc hin: B môn Vi sinh & Sinh hc
Trưng Đại hc Dưc H Ni




H NỘI – 2015







LI CẢM ƠN
Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao
Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành
khóa luận này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang
giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược
trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa trường đại học khoa học tự nhiên Hà Nội đã
tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng
xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã
chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn
hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất mong
nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện
hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Tiến Tuấn











MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2

1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1.Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2.Phân loại kháng sinh 2
1.1.3.Cơ chế kháng sinh 2
1.1.4.Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 2
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3
1.3. Phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh 5
1.4. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 5
1.5. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 8
1.7. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 9
1.8. Sản xuất 8- demethylgeldanamycin và 4,5- epoxy-8 demethylgeldanamycin có
tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus 10
1.9. Sinh tổng hp các chất tương tự geldanamycin để ức chế Hsp90. 10
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu 11
2.1.1 Giống xạ khuẩn 11
2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 11
2.1. 3 Môi trưng nuôi cấy 11
2.1.4 Dụng cụ và hóa chất 14
2.2 Phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 184.223 14
2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống 14
2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 14
2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 15
2.3. Phương pháp thc nghim 15
CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 21
3.1.Kết quả chọn môi trưng nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định 22
3.2.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 184.223 23

3.3.Kết quả đột biến UV lần 1 24
3.4.Kết quả đột biến UV lần 2 25
3.5.Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhit độ đến độ bền của kháng
sinh trong dịch lọc 25
3.6.Kết quả chọn dung môi chiết suất kháng sinh. 27
3.7.Một số đặc điểm của Streptomyces 184.223 28
3.8.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29
3.9.Kết quả sắc ký lp mỏng chọn h dung môi 30
3.10.Kết quả sắc ký cột 31
3.11.Kết quả đo phổ IR, phổ UV, khối phổ MS và xác định sơ bộ các nhóm
chức đặc trưng của kháng sinh thu được 36
1.Kết luận 37
2.Kiến nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC.

DANH MỤC KÝ HIU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN
Acid 2'- deoxyribonucleic
B.cereus
Bacillus cereus
DM
Dung môi
DMHC
Dung môi hữu cơ
ĐB
Đột biến
Gr(-)
Gram âm
Gr(+)
Gram dương
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
ISP
International Streptomyces Project ( chương
trình Streptomyces quốc tế)
KS
Kháng sinh
MC
Mẫu chứng
MT

Môi trường
MTdt
Môi trường dịch thể
P.mirabilis
Proteus mirabilis
s
Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SLNN
Sàng lọc ngẫu nhiên
TB
Tế bào
UV
Ultra violet ( tử ngoại)
V
Thể tích
VSV Vi sinh vật








DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học . 2
Bảng 1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 11

Bảng 2.2. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). 12
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 12
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng 13
Bảng 3.1. Kết quả HTKS của bào tử Streptomyces 184.223 trên các MT 22
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 23
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 24
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 25
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. 26
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và 5 ngày. 26
Bảng 3.7. Kết quả HTKS pha DM và nước của 5 DMHC ở 5 pH 27
Bảng 3.8. Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 184.223 theo ISP 29
Bảng 3.9. Kết quả HTKS chọn môi trường lên men 29
Bảng 3.10. HTKS dịch lên men của các dạng chủng và biến chủng trên MT2dt 30
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31
Bảng 3.12. Kết quả thử HTKS các PĐ sắc ký cột lần 1 với hệ dung môi 3 32
Bảng 3.13. Kết quả SKLM các phân đoạn của sắc ký cột lần 1……………………33
Bảng 3.14. Kết quả SKLM dò hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2…………………34
Bảng 3.15. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1).34
Bảng 3.16. Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1).35







PHỤ LỤC
Hình P.0
Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Hình P.1

Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 184.223 sau 6 ngày nuôi cấy.

Hình P.2
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương
pháp khối thạch.

Hình P.3
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp
giếng thạch.

Hình P.4
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp
khoanh giấy lọc.

Hình P.5
Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột và
sắc kí cột.

Hình P.6
Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 184.223

Hình P.7
Phổ tử ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223.

Hình P.8
Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223
Hình P.9
Phổ khối lượng vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223

1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh là nhóm thuốc có hiệu quả cao trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Nhờ tìm ra kháng sinh mà hàng loạt căn bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe
và tính mạng loài người như các chứng viêm nhiễm, nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi
được điều trị và khống chế có hiệu quả.
Nhưng đáng tiếc là trước hiệu quả điều trị rất rõ ràng, hầu hết các bệnh nhân và
nhiều thầy thuốc cũng đã lạm dụng kháng sinh, coi đây như thần dược. Thực tế không
như vậy, đối với các trường hợp viêm nhiễm do virus và bệnh cúm, viêm não B… thì
kháng sinh hầu như không có hiệu quả. Hiện nay, sử dụng kháng sinh không đúng
cách dẫn đến xuất hiện tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh với nhiều
cơ chế phức tạp.

Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới ít độc tính, điều trị hiệu quả là rất cần thiết.

Trong đó con đường truyền thống sàng lọc tìm kiếm kháng sinh có nguồn gốc từ vi
sinh vật vẫn là con đường quan trọng trong việc phát hiện ra các chủng mới có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt, đồng thời tìm ra các hoạt chất mới có khả năng ức
chế vi khuẩn kháng thuốc. Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.
Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
184.223 ” với các mục tiêu sau:
 Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ chủng giống
Streptomyces 184.223
 Bước đầu nghiên cứu hình thái Streptomyces 184.223 theo ISP.
 Nghiên cứu điều kiện lên men, chiết tách và tinh chế để thu được kháng sinh
tinh khiết.
 Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh thu được.

2



CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: ‘Kháng sinh là những
sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát
triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”.[3]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, hay theo
phổ tác dụng…trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất.
Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1. [4],
[8]
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.

STT
Nhóm kháng sinh
Ví dụ
1
β – lactam
Amoxicillin,cephalosporin 1,2,3…
2
Phenicol
Cloramphenico
3
Aminoglycosid
Streptomycin, gentamicin….
4
Tetracyclin
Tetracyclin, doxycyclin
5
Macrolid
Erythromycin,clarithromycin, …
6
Polypeptide
Polymycin, vancomycin,
7
Imidazol
Metronidazol,…
8
Lincosamid
Lincomycin, clindamycin,
9
Quinolon
Các Floroquinolon 1,2,3,4

10
Nhóm khác
Oxazolidinon

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3]
Các kháng sinh có một đích tác dụng khác nhau và hiện tại có 5 đích tác dụng
trên VSV như sau: Bảng 1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng KS
Ví dụ
Tổng hợp thành tế bào
β –lactam, glycopeptid
Màng tế bào chất
Polypeptid (colistin)
Tổng hợp protein
Nitrofuran, maclorid
Tổng hợp acid nuclenic
Phenicol,tetracyclin
Ức chế chuyển hóa acid folic
Co-trimoxazol
3




Cơ chế tác dụng được thể hiện ở phục lục P.0

1.1.4. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất

khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn,… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần
khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc trưng và
trên các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
- Phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch.
- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định.
- Phương pháp làm giàu đất
- Phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập.[6], [4]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có
dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như
nấm (myces).Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria).
Đa số là vi khuẩn Gr (+), có tỷ lệ G+C > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Do đó, có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao
đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzyme, vitamin, vì vậy, chúng được nghiên cứu
nhiều. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động vật.[6], [3],
[1]

1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces
- Khuẩn lạc: khuẩn lạc xạ khuẩn Streptomyces khá đặc biệt, thường có dạng khô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que
cấy không di chuyển được khuẩn lạc xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu vào trong
thạch.
- Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ
0,3- 1,0 µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc khuẩn
ty rất phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi
trường một số loại sắc tố như: sắc tố tan trong nước, sắc tố tan trong DMHC, đặc biệt
Trao đổi chất hô hấp
Antimycin
4

có loài tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
- Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành khuẩn ty
khí sinh. Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các
chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, ).
- Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của chi xạ khuẩn Streptomyces. Bề mặt
bào tử có thể nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc, với các hình dạng phong phú: hình
cầu, hình ellipsoic, hình trụ…[3], [1]
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
- Thành tế bào: Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, đường kính 0,5-2,0 μm,
có chức năng duy trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Chi Streptomyces thuộc
nhóm CW I có chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin.
- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10 nm. Chúng có cấu trúc và chức năng
giống vi khuẩn nói chung.
- Mesosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình
ống. Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của CM và qua đó làm tăng cường hoạt tính
enzyme, tăng vận chuyển điện tử…
- Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat,
các hạt polysaccarid. [3], [15]
1.2.3. Đặc điểm sinh lý
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân
giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân
các hợp chất như gelatin, casein, chúng có thể khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là
loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ tối ưu thường là 25-30
0
C, pH tối thích thường
từ 6,5-8,0. [3]
1.2.4. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu để phân
loại, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Gauze,
đặc biệt để phân loại Streptomyces có 2 phương pháp phân lọai đang được sử dụng
phổ biến: phân loại ISP và phân loại theo giải trình tự gen.
 Phân loại theo ISP
Tại hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X (1970), khóa phân loại do Shirling &
Gottlieb đề xuất đã được chấp nhận để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
5



trong họ Streptomytaceae. Khóa phân loại dựa trên các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc khuẩn ty cơ chất, màu sắc khuẩn
ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và hình dạng bào
tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng sử
dụng nguồn hydratcarbon.
 Phân loại định tên theo giải trình tự gen
Phương pháp phân loại này sử dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc
phân tích gen 16S rADN. Trình tự nucleotid của gen hầu như không có sự trao đổi
giữa các loài, vì vậy phương pháp này có tính chính xác cao và đáng tin cậy hơn.
[3], [10]
1.3. Phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh
Vi sinh vật có ở trong các cơ chất khác nhau như : trong đất, nước, không khí.
Vi sinh vật được phân lập theo kỹ thuật sau:
+ Phân lập vi sinh vật trong không khí: sau khi cân MT, tiệt trùng và đổ vào các
hộp Petri, rồi để hộp không đậy nắp trong 20- 30 phút ở những nơi muốn phân lập.
Các VSV có trong không khí, sẽ mọc lên các khuẩn lạc sau 48-120 giờ nuôi.
+ Phân lập vi sinh vật từ các cơ chất rắn, nước : cân 1 g cơ chất rồi hòa vào 10 ml
nước vô trùng, sau đó dùng nước pha loãng đến nồng độ mong muốn, sử dụng pipet

nhỏ 0,1 ml lên bề mặt MT thạch, dùng que chang dàn đều trên mặt thạch của hộp Petri.
Sau thời gian nuôi trong tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho các nhóm VSV
sẽ hình thành khuẩn lạc và dùng que cấy cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
[3]
1.4. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật
1.4.1. Cải tạo giống vi sinh vật
 Mục đích
Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt
tính thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải
cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy
thích hợp nhằm các mục đích:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men,
6



tạo ít bọt hơn.
- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới. [3],
[4]
 Các phương pháp cải tạo giống
 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên:
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh tăng mạnh lên 20-30% những cá thể khác. Cần
phải chọn lấy cá thể có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp.
Việc chọn lọc này chỉ để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào
sản xuất. [7]
 Đột biến nhân tạo
Các tác nhân gây đột biến mạnh như tia UV, hay tác nhân hóa học như ethylenimin,

dimethylsulfat, nitrosoguanidin, acid nitrit…cho tác dụng với liều lượng và thời gian
thích hợp sẽ giết chết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen,
làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm
tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến dương tính).
Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật có
kích thước nhỏ (0,5 -3,0µm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Vì vậy, ánh sáng
UV được dùng phổ biến trong cải tạo giống. Liều lượng chiếu được đặc trưng bởi các
yếu tố: cường độ chiếu, thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Liều
lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến giới hạn nhất
định.
1.4.2. Bảo quản giống vi sinh vật
 Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị
biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các vi sinh vật lạ.
 Các phương pháp bảo quản:
- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2
0
C, định kỳ 3-6 tháng
cấy chuyền.
- Làm khô: trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng.
- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh.
7



- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo
quản ở nhiệt độ thấp (từ -78
0
C đến -20
0

C). [4], [10], [2]
1.5. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh
1.5.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất
trung gian cho chúng.
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành lúc gần kết thúc quá
trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng. [4], [12]
1.5.2. Các phương pháp lên men
Dựa vào đặc điểm công nghệ có thể chia làm 2 phương pháp:
 Lên men bề mặt
Là quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, đặc, lỏng. VSV hấp thu các chất
dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi
trường. Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và không quá
sâu (5-10cm).
- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
ban đầu thấp.
- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng trường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động
hóa, tốn nhân công.
 Lên men chìm
Là phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men, trong điều kiện sinh
lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều.
- Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện tích,
chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ cần
chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các phương pháp lên men chìm:
- Lên men mẻ: VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với thể tích môi trường
xác định, ở điều kiện sinh lý tối thích. Trong suốt thời gian lên men, không tác
động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH. Kết

thúc quá trình, thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm.
8



- Lên men bán liên tục: là lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát
triển tạo ra nồng độ sinh khối cần thiết ta lấy bớt đi dịch lên men rồi bổ sung thêm
lượng môi trường mới bằng lượng dịch đã lấy.
- Ngoài ra còn có lên men liên tục, lên men có bổ sung. [7], [4], [2]

1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Tùy theo đặc tính của loài mà kháng sinh đó được tiết vào môi trường nuôi cấy
(penicillin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin ). Vì vậy để thu lấy
hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp để
sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và giúp hạ giá thành sản phẩm.
 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:
 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
 Phương pháp tạo phức kết tủa.
 Phương pháp trao đổi ion.
 Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, ).
 Các phương pháp khác.
 Chiết xuất
- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển
chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng (1
pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ).
- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau.
- Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng
lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế
bào nên tiến hành chiết rắn lỏng.
 Phương pháp sắc ký :

- Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng
chất. Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha
động chạy qua pha tĩnh và phát hiện vết cần tách.
- Nguyên lý tách: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động, sau đó được đưa lên
pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Các chất tan của mẫu sẽ di
chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh,
9



pha động, chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần sẽ được tách
riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ.
- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:
 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị
hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).
Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf.
R
f
=
dm
v
d
d
trong đó: d
v
: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
d
dm
: Khoảng cách dung môi chạy.

Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt động của chất hấp phụ, tính chất của
dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
 Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo hành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn (chất mang) được nhồi vào cột, pha
động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình rửa giải được
thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha động. [10], [7], [4]
1.7. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh.
1.7.1. Phổ hồng ngoại (IR)
- Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thu bức xạ hồng ngoại
của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ.
- Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ để nhận biết nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có
dải hấp thụ đặc trưng, đây chính là cơ sở để phân tích cấu trúc bằng phổ IR. [3], [9],
[14]
1.7.2. Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)
- Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân
tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Đường cong biểu diễn sự phụ
thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại.
- Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn,
liên kết bội, nhân thơm,…hoặc cặp electron tự do không tham gia vào liên kết của
O, N, halogen. Vì vậy, dựa vào phổ hấp thụ UV ta có thể xác định các đặc điểm
về cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu. [7], [5]
10



1.7.3. Phổ khối lưng (MS)
- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng

cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ
số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân
tử hoặc nguyên tử của mẫu.
- Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Khi các phân tử ở trạng thái khí va
chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion
và trở thành ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2. Loại ion này gọi là ion
gốc hay ion phân tử. Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có
năng lượng lớn hơn thì chúng sẽ bị vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc
hay các phân tử trung hòa khác nhau. Khi tách ion có số khối khác nhau và xác
định được xác suất có mặt của chúng ta vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan xác
suất có mặt (cường độ I) và số khối z. Đó là phổ khối lượng.
- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần nhận
dạng cấu trúc hóa học của hợp chất. [10], [14]
1.8. Sản xuất 8- demethylgeldanamycin và 4,5- epoxy-8 demethylgeldanamycin có
tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus
- Geldanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus, trong quá
trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5- deoxy- 8 demethylgeldanamycin được tinh chế từ
dịch lên men bằng sắc kí cột và sắc kí lỏng hiệu năng cao.
- Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon, đặc tính có tác dụng chống ung
thư do tác dụng mạnh lên ATP là bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào ung
thư.Hiện tại đang được dung ở gian đoạn 2 của giám sát lâm sàng.Tinh chế 2 thành
phần trên bằng sắc kí cột HP20, dịch rửa giải methanol. [16]
1.9. Sinh tổng hợp các chất tương t geldanamycin để ức chế Hsp90.
- Geldanamycin một sản phẩm tự nhiên polyketid có vai trò đáng kể trong sự phát triển
của các thuốc điều trị ung thư mới mà mục tiêu là ức chế Hsp90.
- Trong khi các nhóm hóa học của geldanamycin đang được khai thác để tạo ra một
chất tổng hợp tương tự, bao gồm cả 17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin( 17-

AAG). Hiện tại đang đánh giá trên lâm sàng. Sử dụng kĩ thuật gen để sửa đổi một số vị
trí của gen mã hóa geldanamycin VSV tạo ra các dẫn xuất 2- dimethyl,6-demethoxy,8-
11



demethyl và 14-demethylgeldanamycin. Điều này sẽ rất hữu ích sự phát triển của tác
nhân hóa học trị liệu.[19]
CHƯƠNG II. ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.223 được phân lập từ mẫu đất của Tây Ninh
tại bộ môn Vi sinh-sinh Học Trường Đại Học Dược Hà Nội.
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định
Đặc trưng
Tên VSV kiểm định
Tên viết tắt
Vi khuẩn Gram dương (+)

Bacillus cereus ATCC 6633
B. cereus
Bacillus subtilis ATCC 10241
B. subtilis
Bacillus pumilus ATCC 10241
B. pumilus
Sarcina lutea ATCC 9341
S. lutea

Staphyllococus aureus ATCC 1128
S. aureus
Vi khuẩn Gram âm (-)
Escherichia coli ATCC 25922
E. coli
Proteus mirabilis BV108
P. mirabilis
Shigella flexneri DT 112
S. flexneri
Salmonella typhi DT 220
S. typhi
Pseudomonas aeruginosa VM 201
P. aeruginosa

2.1.3. Môi trưng nuôi cấy
 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2.

12





Bảng 2.2: Thành phần các môi trưng nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)
Thành phần
MT1
MT2
MT5
MT6

MT7
Tinh bột
2
2
2,4
2

Lactose





Glucose



1

Cao ngô





Saccarose

3
Bột đậu tương



1,5

Bột ngô


2

0,1
Pepton


0,3

0,3
Cao thịt


0,3

0,5
KNO
3
0,1

KCl

0,05



NaNO
3

0,2



NH
4
NO
3





CaCO
3


0,4
0,2

FeSO
4
,7H
2
O
0,01




K
2
HPO
4
0,05
0,1



MgSO
4
,7H
2
O
0,05
0,05

NaCl
0,05


0,1

Cao nấm men




0,5
Thạch
1,8
2
2
2
2
Nước
100
100
100
100
100
pH
7,0 - 7,2
6,8- 7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: bảng 2.3.
Bảng 2.3. Môi trưng nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
NaCl (g)
Pepton (g)
Cao thịt (g)
Thạch (g)
Nưc (ml)
pH
MT canh thang
0,5
0,5
0,3
0
100
7,0 -7,5
MT thạch thường
0,5
0,5
0,3
1,6-1,8
100

13



 Các môi trường ISP dùng để xác định hình thái của Streptomyces 184.223 (ký
hiệu từ môi trường ISP 2 đến ISP 3).
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl

2
.4H
2
O 0,1g; FeSO
4
.7H
2
O 0,1 g;
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1g; nước cất vđ 100ml ; pH = 7,0 – 7,2.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose 4,0g; thạch 20,0g; nước cất
vđ 1000ml; pH=7,3.
ISP3: Yến mạch 20,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 18,0g; nước cất vđ
1000ml; pH=7,2.
2.1.4. Dụng cụ và hóa chất.
 Các dung môi sử dụng: bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng
Dung môi
Khối lượng riêng (g/ml)
Nhit độ sôi (
0
C)
Methanol
0,791-0,793
64,5
Ethylacetat
0.897

77,1
Ethanol
0,789-0,791
78,3
Chloroform
1,470-1,480
60-62
n- Butanol
0,81
116- 118
Aceton
0,790
56
Triethylamin
0,726-0,728
89,5
Amoniac 25%
0,880
37,7
Diethyformamid
0,946-0,950
153
n-Butylacetat
0,880- 0,885
117- 118
Acetonitril
0,782-0,783
80-82
Diclometan
1,33

39,6
n-hexan
0.655
69

 Vật liệu dùng cho sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254 Mreck.
- Dung môi chạy sắc ký (bảng 2.4).
- Bình chạy sắc ký, cột sắc ký.
- Hạt Silicagel 60 Mreck (0,040- 0,063mm).
14



- Ống mao quản.
- Ống đong, hộp Petri, ống nghiệm, pipet….
 Tác nhân gây đột biến:
- Ánh sáng UV (= 254nm) nguồn phát Toshiba 60W – 220V.
 Máy móc, thiết bị, dụng cụ:
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48. Nồi hấp vô trùng Hyrayama model HL 3030.
- Tủ sấy Sanyo Clean Bench, tủ lạnh, tủ lạnh sâu.
- Tủ ấm Memmert, Binder
- Cân kỹ thuật, cân phân tích Santorius.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 LF.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 184.223
- Xác định một số đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 184.223.
2.2.2. Chn lc và cải tạo giống
- Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184.223.
- Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G (+) và 1 vi khuẩn G (-)) để làm VSV

kiểm định cho các nghiên cứu về sau.
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1- 2 lần hoặc đột biến hóa học để nâng cao khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc.
2.2.3. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh
- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến
chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
- Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc.
- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất.
- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất.
- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.
2.2.4. Sơ b xác định mt số tính chất của kháng sinh thu đưc
15



- Xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS.
2.3. Phương pháp thc nghim
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng
* Mục đích: Bảo quản các chủng giổng thuần khiết đã phân lập, các dạng chủng
sau sàng lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các nghiên cứu tiếp
theo.
* Tiến hành: Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào
các ống nghiệm, mỗi ống 5 - 6ml. Tiệt trùng ở 1 at/30 phút rồi đặt nghiêng cho đông.
Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử Streptomyces
184.224 đã thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 28
o
C trong 6 ngày cho xạ

khuẩn phát triển, sau đó cất giữ trong tủ lạnh 2
o
C . Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng.
2.3.2. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái xạ khuẩn theo ISP
Chuẩn bị ống giống gốc hoặc sàng lọc ngẫu nhiên được nuôi cấy trong ống thạch
nghiêng đủ 6 ngày tuổi.
Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan:
MT xác định: ISP2, ISP3 đã được hấp tiệt trùng, đổ vào ống nghiệm, mỗi MT
làm 4 ống nghiệm. Cấy zigzac bào tử của Streptomyces 184.223 lên bề mặt thạch. Ủ ở
28
o
C, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7 -14 ngày.
- Màu của khuẩn ty khí sinh: Quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc có thể có:
màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (G
y
), trắng
(W), trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
- Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới ống
nghiệm), thường có các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh
xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1),
nếu không thấy ký hiệu là (0).
- Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ
phóng đại cao.
+ Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S). Nếu
chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm (ví dụ: SRA: chuỗi lò xo
16



móc câu).

+ Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: phẳng nhẵn (sm), sần sùi mụn cơm (wa),
có gai (sp), có tóc (ha).
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
 Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm
định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát
triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
 Tiến hành:
- Tạo hỗn dịch vi khuẩn kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi
trường canh thang, ủ trong tủ ấm ở 37
o
C trong 18-24h tạo hỗn dịch vi khuẩn có nồng
độ 10
7
-10
8
tế bào/ml.
- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường ở 45 – 50
o
C sau khi đã hấp tiệt
trùng với tỷ lệ V giống/V thạch thường = 5/200. Lắc đều để vi khuẩn kiểm định phân
tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
 Các phương pháp thử:
- Phương pháp khối thạch: Đưa các mẫu thử là các khối thạch ( = 6mm) chứa vi
sinh vật cần thử lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường vi sinh vật kiểm
định ( = 6mm), sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng.
- Phương pháp khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc (= 6mm) đã sấy khô tẩm
dung dịch thử (3 lần), sấy khô ở 45
o
C, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi

trường vi sinh vật kiểm định.
Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37
o
C trong 18-24h.
Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo
bằng thước kp Palmer độ chính xác 0,02 mm và được đánh giá theo công thức:
2
11
()
1
nn
ii
ii
D D D
Ds
nn







D
(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn.

D
i
(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.