Xác định đồng thời độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng LC MS và MS

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


ĐOÀN THỊ THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM
DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC
PHẨM BẰNG LC-MS/MS


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




HÀ NỘI - 2015





BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM
DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM
BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
1. ThS. Trần Cao Sơn
2. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm ngiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia



HÀ NỘI - 2015




LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn
thành khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những ngƣời đã
nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Trần Cao
Sơn, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Đặng Ngọc Lan đã định hƣớng cho tôi
trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện an toàn vệ sinh thực
phẩm quốc gia (NIFC) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng ban,
cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn
khác trong Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Đoàn Thị Thảo




MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về độc tố deoxynivalenol và zearalenone 2
1.1.1. Deoxynivalenol (DON) 2
1.1.2. Zearalenone (ZEA) 3
1.1.3. Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2] 5
1.2. Hàm lƣợng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm 6

1.3. Tổng quan phƣơng pháp xác định DON và ZEA 9
1.3.1. Các phương pháp đã được thực hiện 9
1.3.2. Phương pháp QuEChERS 11
1.3.3. Phương pháp LC-MS/MS 12
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 17
2.1.3. Dung môi, hóa chất 18
2.1.4. Chất chuẩn 18
2.1.5. Pha dung dịch chuẩn 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20
2.2.1. Khảo sát các điều kiện xác định độc tố vi nấm bằng LC-MS/MS 20
2.2.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 20
2.2.3. Thẩm định phương pháp 20
2.2.4. Ứng dụng phương pháp 20




2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS 20
2.3.2. Phương pháp thẩm định 21
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 23
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định mycotoxin trên thiết bị LC-MS/MS 24
3.1.1. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ 24
3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng 25
3.2. Lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu 27
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết 27

3.2.2. Khảo sát bước làm sạch 29
3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 31
3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc 31
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi 36
3.4. Kết quả xác định ZEA và DON trong một số mẫu thực phẩm ngô 39
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO




DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
Tiếng anh
Tiếng việt
AA
Acid acetic

ACN
Acetonitrile

AOAC
Association of Official Analytical
Community
Hiệp hội cộng đồng phân tích
chính thức
AF

Acid formic

APCI
Atmospheric pressure chemical
ionization
Chế độ ion hóa ở áp suất khí
quyển
CV
Coefficient of Variation
Hệ số biến thiên
DON
Deoxynivalenol

d-SPE
Dispersive Solid Phase Extraction
Chiết phân tán pha rắn
ESI
Electrospray ionization
Ion hóa phun điện tử
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện

LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lƣợng
ML
Maximum Limit
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa
MS
Mass spectrometry
Khối phổ
PSA
Primary Secondary Amine
Chất hấp phụ amin bậc 1, bậc 2
R(%)
Recovery
Hiệu suất thu hồi
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
SPE
Solid phase extraction
Chiết pha rắn
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
ZEA
Zearalenone

DANH MỤC BẢNG
STT
Bảng
Nội dung
Trang
1
Bảng 1.1.
Giới hạn cho phép deoxynivalenol trong thực phẩm
5
2
Bảng 1.2.
Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm
6
3
Bảng 1.3.
Hàm lƣợng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU
7
4
Bảng 1.4.
Hàm lƣợng ZEA (µg/kg) trong thực phẩm ở châu Âu
7
5
Bảng 1.5.
Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010
8
6
Bảng 1.6.
Ô nhiễm DON trong ngô tại Argentina từ 1999-2010
8

7
Bảng 1.7.
Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia
năm 2010
9
8
Bảng 1.8
Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia
năm 2005
9
9
Bảng 1.9.
Tóm tắt một số phƣơng pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm
ZEA và DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc
10
10
Bảng 1.10.
Các phƣơng pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực
hiện
10
11
Bảng 1.11.
Xác định độc tố vi nấm bằng phƣơng pháp QuEChERS
12
12
Bảng 2.1.
Các độc tố vi nấm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
17
13
Bảng 2.2.

Pha các dung dịch chuẩn xây dựng đƣờng chuẩn
19
14
Bảng 3.1.
Các điều kiện phân tích độc tố vi nấm bằng ESI(-)-MS/MS
24
15
Bảng 3.2.
Các thông số tối ƣu của MS đối vớ
25
16
Bảng 3.3.
Chƣơng trình gradient phân tích ZEA và DON
26
17
Bảng 3.4.
So sánh các loại dung môi chiết đến độ thu hồi của ZEA và
DON
28
18
Bảng 3.5.
Khảo sát ảnh hƣởng của việc sử dụng PSA và C18 đến độ thu
hồi của ZEA và DON
29
19
Bảng 3.6.
LOD và LOQ của ZEA và DON
33
20
Bảng 3.7.

Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của ZEA và DON
34
21
Bảng 3.8.
Độ lặp lại và độ thu hồi của DON trên nền mẫu ngô
36
22
Bảng 3.9.
Độ lặp lại và độ thu hồi của ZEA trên nền mẫu ngô
37
23
Bảng 3.10
Kết quả xác định hàm lƣợng các độc tố vi nấm trong một số sản
phẩm từ ngô tại Hà Nội tháng 5 - 2015
40





DANH MỤC HÌNH VẼ

TT
Hình
Nội dung
Trang
1
Hình 1.1.
Công thức cấu tạo của deoxynivalenol
3

2
Hình 1.2.
Công thức cấu tạo của Zearalenone
4
3
Hình 1.3.
Tình trạng nhiễm độc tố vi nấm do Fusarium tại 11
nƣớc
6
4
Hình 1.4.
Mô hình hệ thống LC-MS/MS
14
5
Hình 3.1.
Sắc kí đồ chuẩn hỗn hợp ZEA – DON phân tích
bằng chƣơng trình gradient 3
27
6
Hình 3.2.
Sắc ký đồ ZEA và DON khi sử dụng các dung môi
chiết khác nhau
28
7
Hình 3.3.
Sắc ký đồ ZEA khi sử dụng chất hấp phụ PSA, C
18

30
8

Hình 3.4.
Quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời ZEA và
DON
31
9
Hình 3.5.
Sắc ký đồ ZEA và DON ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và
mẫu thêm chuẩn
32
10
Hình 3.6.
Sắc đồ ZEA tại LOQ 2 ng/ml (tƣơng đƣơng 10
µg/kg trên mẫu)
33
11
Hình 3.7.
Sắc đồ DON tại LOQ 20 ng/ml (tƣơng đƣơng 100
µg/kg trên mẫu)
34
12
Hình 3.8.
Đƣờng chuẩn ZEA
34
13
Hình 3.9.
Đƣờng chuẩn DON
35
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề báo động với
toàn thể xã hội. Số lƣợng cũng nhƣ mức độ nguy hiểm của các vụ ngộ độc thực
phẩm ngày càng gia tăng, trong đó độc tố vi nấm là một trong những nguyên nhân
chính gây ngộ độc nhƣng lại ít đƣợc đề cập đến.
Độc tố vi nấm đƣợc sinh ra do nhiều loài nấm mốc khác nhau, chúng đƣợc
phát hiện trên nhiều loại lƣơng thực, thực phẩm khác nhau. Hiện nay, có đến hơn
400 loại độc tố vi nấm đã đƣợc xác định. Trong đó, các loại độc tố vi nấm chính
đƣợc quan tâm nhất bao gồm các aflatoxin, ochratoxin, fumonisin, deoxynivalenol,
zearalenone…
Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu xác định các độc tố vi nấm aflatoxin
B1, B2, G1, G2, ochratoxin A… Tuy nhiên, chƣa có nhiều nghiên cứu về phƣơng
pháp xác định các độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong thực phẩm,
hơn nữa các phƣơng pháp phân tích thông thƣờng chỉ hƣớng đến phân tích riêng lẻ
các độc tố mà chƣa xác định đồng thời đƣợc chúng.
Với lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xác định đồng thời độc tố vi
nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng
LC-MS/MS”. Thực hiện khóa luận này chúng tôi nhằm tới 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định đồng thời deoxynivalenol
và zearalenone bằng LC-MS/MS.
2. Áp dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng deoxynivalenol và
zearalenone cho một số sản phẩm trên thị trƣờng.

2



Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone
Độc tố vi nấm là chất chuyển hóa thứ cấp độc hại đƣợc sinh ra bởi các loài
nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria [38]. Độc tố vi nấm có thể
đƣợc định nghĩa là “chất chuyển hóa của nấm mốc mà khi ăn phải, hít vào hoặc hấp
thu qua da gây ra bệnh tật hoặc gây tử vong cho ngƣời và động vật” [26] . Độc tố vi
nấm gây ra một loạt các tác dụng độc hại. Chúng là những chất gây ung thƣ, độc với
thần kinh, gây quái thai và gây suy giảm miễn dịch [22] [25].
Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây nhƣ thối rễ, thân, bắp,
củ… một số loài còn sinh ra độc tố nấm lẫn tạp trong ngũ cốc. Một số chất độc gây
tác hại đến sức khỏe con ngƣời có thể kể đến nhƣ độc tố T-2 toxin, fumonisin,
zearalenone, deoxynivalenol… dƣới đây sẽ đề cập đến 2 loại độc tố hay gặp trong
ngũ cốc, cây trồng tại Việt Nam: zearalenone, deoxynivalenol.
1.1.1. Deoxynivalenol (DON)
1.1.1.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý
DON là một loại độc tố vi nấm thuộc nhóm trichothecen. Đây là một nhóm
các hợp chất có cấu trúc liên quan đến một hệ thống vòng tetracyclic
sesquiterpenoid. Khoảng 170 trichothecen đã đƣợc xác định [16] [15] và đƣợc chia
thành bốn loại (A-D) dựa trên sự thay đổi nhóm chức hydroxyl và nhóm bên
acetoxy. Loại A, đại diện là HT-2 và T-2 toxin, loại B thƣờng gặp là
deoxynivalenol (DON), loại C và D thƣờng ít gặp hơn [21].
DON hay còn gọi là vomitoxin đƣợc sinh ra bởi các loài F. graminearum, F.
culmorum và F. cerealis [21]. DON có thể đƣợc sinh ra ở nhiệt độ từ 21-29
o
C và
độ ẩm trên 20%. DON dễ tan trong một số dung môi phân cực nhƣ methanol,
ethanol và acetonitril. DON là chất rất bền nhiệt và bền với môi trƣờng acid, không
bị ảnh hƣởng của quá trình chế biến [29].
3

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của deoxynivalenol
1.1.1.2. Độc tính
DON hoạt động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosome 60S dẫn đến ức chế
tổng hợp protein ở tế bào nhân thực. Deoxynivalenol đi vào tế bào và liên kết với
ribosome, truyền tín hiệu cho RNA làm hoạt hóa enzyme protein kinase và
hemoitopoeitic cell kinase. Sự phosphoryl hóa yếu tố phiên mã nhờ enzyme
mitogen-activedprotein kinase và kích hoạt apoptosis, gây ra các ảnh hƣởng lâu dài
và độc tính trên miễn dịch [24].
Rất nhiều nghiên cứu trên động vật đã đƣợc thực hiện nhằm đánh giá độc
tính và cơ chế gây độc của DON. Mặc dù DON không độc hại nhƣ một số
trichothecen khác nhƣ T2 hoặc HT-2, nhƣng nó là một trong những chất gây ô
nhiễm phổ biến nhất trong các loại ngũ cốc trên toàn thế giới. Liều gây chết trung
bình (LD50) ở chuột là 70 mg/kg thể trọng, và DON gây ra tác dụng ức chế miễn
nhiễm trên chuột ở liều thấp 0,025 mg/kg thể trọng và còn nhạy cảm hơn ở lợn.
Trên ngƣời, DON có thể gây nôn, buồn nôn, chóng mặt, nhức đầu [29].
Không có bằng chứng thực nghiệm về dịch tễ học đối với khả năng gây đột
biến và/hoặc gây ung thƣ của DON. IARC phân loại DON thuộc nhóm 3 là nhóm ít
có bằng chứng gây ung thƣ trên ngƣời và động vật [8].
1.1.2. Zearalenone (ZEA)
1.1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý
Zearalenone (ZEA) là một loại độc tố đƣợc sản xuất bởi một số loài
Fusarium nhƣ F. culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. verticillioides và F.
incarnatum [21]. Nói chung, các loài Fusarium phát triển và xâm nhập vào cây
trồng trong điều kiện môi trƣờng ẩm mát khi nở hoa, nhƣng sự tăng trƣởng và sinh
4

ra độc tố này cũng có thể xảy ra sau khi thu hoạch trong điều kiện bảo quản kém
[4]. Những loài này có thể sinh ra một số lƣợng nhỏ các chất chuyển hóa có liên
quan, trong đó α –zearalenol và β-zearalenol là những dẫn xuất quan trọng nhất của
zearalenone [27].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của zearalenone
ZEA tồn tại ở dạng tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy trong khoảng
164-165
o
C. Do đó, ZEA rất khó bị phá hủy ở nhiệt độ chế biến thức ăn thông
thƣờng [11].
ZEA hòa tan trong dung dịch kiềm, chloroform, acetonitrile và một số dung
môi hữu cơ khác, trong khi không hòa tan trong nƣớc, carbon disulfide và carbon
tetrachloride. Nó phát huỳnh quang dƣới ánh sáng tia cực tím (UV) và bƣớc sóng
cực đại hấp thụ tia cực tím trong methanol ở 236, 274 và 316 nm [39].
1.1.2.2. Độc tính
ZEA có hoạt tính estrogen, khi vào cơ thể, ZEA và một số chất chuyển hóa
có liên quan, cạnh tranh liên kết với các thụ thể của estrogen. Nhƣ vậy, độc tính của
nó có liên quan đến vấn đề sinh sản ở các loài động vật và có thể ở ngƣời [14] [36].
ZEA là chất có độc tính cấp tƣơng đối thấp khi dùng đƣờng uống, tuy nhiên
độc tính tăng lên khi tiêm phúc mạc. Ở động vật, tác dụng độc hại khi tiếp xúc với
ZEA bao gồm ung thƣ, đột biến gen, độc tính trên sinh sản, tác động nội tiết, suy
giảm miễn dịch. Tính nhạy cảm trên sinh sản có ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản
xuất chăn nuôi. Vì vậy, khi vật nuôi mang thai, ZEA giảm tồn phôi và trọng lƣợng
của thai nhi, ngoài ra, ZEA làm âm hộ sƣng và đỏ, viêm âm hộ âm đạo, tắc hoặc
không có sữa và sa trực tràng. Ở giống đực, ZEA có thể làm giảm nồng độ
testosterone, trọng lƣợng tinh hoàn, và sự sinh tinh [42].
5

IARC đánh giá khả gây ung thƣ của ZEA và kết luận rằng nó không phải
chất gây ung thƣ trên ngƣời (nhóm 3) [8].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên ngƣời gần đây cho thấy ZEA có khả năng
kích thích tăng trƣởng của các tế bào có các thụ thể estrogen ở tuyến vú của con
ngƣời [40]. Từ đó có giả thuyết cho rằng ZEA có thể có một vai trò trong nguyên
nhân của bệnh ung thƣ vú ở ngƣời [41]. Hơn nữa, ZEA đã đƣợc tìm thấy trong các
mô nội mạc tử cung của phụ nữ bị ung thƣ tuyến và trong một số trƣờng hợp tăng
sản nội mạc tử cung. Giữa năm 1978 và 1981, ngƣời ta nghi ngờ rằng ZEA một
trong những tác nhân gây bệnh dậy thì sớm ở Puerto Rico [30].
1.1.3. Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2]
1.1.3.1. Giới hạn cho phép deoxynivalenol trong thực phẩm
Bảng 1.1. Giới hạn ô nhiễm deoxynivalenol trong thực phẩm
TT
Tên thực phẩm
ML
(µg/kg)
1
Ngũ cốc chƣa qua chế biến (không bao gồm lúa mì, yến mạch
và ngô)
1,250
2
Lúa mì và yến mạch chƣa qua chế biến
1,750
3
Ngô chƣa qua chế biến (không bao gồm ngô chƣa qua chế biến
dùng để chế biến bằng phƣơng pháp xay ƣớt)
1,750
4
Ngũ cốc, bột ngũ cốc, cám (bran), hạt mầm (germ) sử dụng

làm thực phẩm (không bao gồm sản phẩm quy định tại mục 7)
750
5
Mỳ ống (khô - hàm lƣợng nƣớc khoảng 12%)
750
6
Bánh mì, bánh nƣớng (pastries), bánh quy, bánh snack và đồ
ăn điểm tâm (breakfast) từ ngũ cốc
500
7
Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc và các thực phẩm khác dành
cho trẻ dƣới 36 tháng tuổi (dạng khô)
200




6



1.1.3.2. Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm
Bảng 1.2. Giới hạn ô nhiễm zearalenone trong thực phẩm
TT
Tên thực phẩm
ML
(µg/kg)
1
Ngũ cốc chƣa qua chế biến (không bao gồm ngô)
100

2
Ngô chƣa qua chế biến (không bao gồm ngô chƣa qua chế biến
dùng để chế biến bằng phƣơng pháp xay ƣớt)
350
3
Ngũ cốc, bột ngũ cốc, cám, hạt mầm dùng làm thực phẩm (không
bao gồm sản phẩm quy định tại mục 5; 6; 7)
75
4
Dầu ngô tinh chế
400
5
Bánh mì, bánh nƣớng, bánh quy, bánh snack và đồ ăn điểm tâm từ
ngũ cốc (không bao gồm bánh snack và đồ ăn điểm tâm từ ngô)
50
6
Ngô sử dụng làm thực phẩm, bánh snack và đồ ăn điểm tâm từ ngô
100
7
Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc và các thực phẩm khác dành cho
trẻ dƣới 36 tháng tuổi (dạng khô)
20


1.2. Hàm lƣợng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm
Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hàm lƣợng độc tố vi nấm đặc biệt là
DON và ZEA trong thực phẩm trên thế giới. Theo báo cáo từ SCOOP (Scientific
Co-operation on Questions relating to Food) mục 3.2.10. “Dữ liệu tổng hợp sự có
mặt của độc tố vi nấm do Fusarium trong thực phẩm và đánh giá chế độ ăn hàng
ngày tại các nƣớc thành viên liên minh châu Âu” [31] tại 11 nƣớc, trong tổng số

11022 mẫu có 57 % mẫu dƣơng tính với DON.

Hình 1.3. Tình trạng nhiễm độc tố vi nấm do Fusarium tại 11 nước
7



Trong các đối tƣợng nhiễm DON, lúa mì là đối tƣợng nhiễm cao nhất. Trong
khi đó, đối với mặt hàng ngũ cốc, ngô là mặt hàng nhiễm DON với hàm lƣợng cao
nhất. Tỉ lệ mẫu ngũ cốc và bột sống nhiễm với hàm lƣợng cao ( ≥ 750 µg/kg) là 7%,
tỉ lệ mẫu thực phẩm ngũ cốc nhiễm với hàm lƣợng ≥ 500 µg/kg là 6 % [31].
Theo báo cáo của cơ quan thực phẩm châu Âu năm 2011 [4], lúa mì và ngô là
mặt hàng nhiễm DON với tỉ lệ cao nhất, hàm lƣợng DON trung bình từ 37 µg/kg đến
594 µg/kg, có rất ít mẫu có hàm lƣợng DON vƣợt quá giới hạn cho phép là 750 µg/kg
[10].
Bảng 1.3. Hàm lượng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU [4]
Mẫu
Số lƣợng
Số mẫu
dƣơng tính
Giá trị
trung bình
(µg/kg)
Giá trị
lớn nhất
(µg/kg)
Lúa mì và bột mì
6350
3891 (61%)
205

3600
Ngô
520
463 (89%)
594
8850

Cũng trong báo cáo này, đối với ZEA, trong các loại hạt ngũ cốc cho ngƣời,
ngô cũng là đối tƣợng nhiễm độc tố này với tần suất lớn nhất (44 %) và với hàm
lƣợng trung bình tƣơng đối cao (14 µg/kg) [4].
Bảng 1.4. Hàm lượng ZEA (µg/kg) trong thực phẩm ở châu Âu [4].
Mẫu
Số lƣợng
Số mẫu
dƣơng tính
Giá trị
trung bình
(µg/kg)
Giá trị lớn nhất
(µg/kg)
Lúa mì và bột mì
3088
432 (14%)
5,7
140
Ngô
838
369 (44%)
14
509

Dữ liệu về sự có mặt của các độc tố vi nấm trong ngô trong quá trình bảo
quản bao gồm cả DON và ZEA tại Argentina từ năm 1999-2010 đƣợc tổng hợp ở
bảng 1.5 và bảng 1.6 [13].
8



Bảng 1.5. Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010 [13]
Năm
Số mẫu dƣơng
tính/ tổng số mẫu
Giá trị trung bình
(µg/kg)
Giá trị lớn nhất
(µg/kg)
1999
1/54
197,5
10000
2002
2/117
24,0
916
2003
2/71
29,9
1082
2004
4/64

33,3
919
2005
9/370
19,6
712
2006
5/251
20,5
889
2007
3/162
15,2
222
2008
1/66
18,6
412
2009
0/98
-
-
2010
1/338
16,4
1318

Bảng 1.6. Ô nhiễm DON trong ngô tại Argentina từ 1999-2010 [13]
Năm
Số mẫu dƣơng

tính/ tổng số mẫu
Giá trị trung bình
(µg/kg)
Giá trị lớn nhất
(µg/kg)
1999
0/54
-
-
2002
0/117
-
-
2003
0/71
-
-
2004
1/64
18,1
368
2005
2/370
15,5
720
2006
0/251
-
-
2007

3/162
15,2
222
2008
1/66
26,2
1050
2009
0/98
-
-
2010
1/338
14,2
589

9



Tại châu Á dữ liệu về hàm lƣợng DON và ZEA trong các sản phẩm thực
phẩm còn hạn chế. Một báo cáo của Setyabudi và Nuryono về sự nhiễm DON
(2010) trong ngô và các sản phẩm từ ngô ở Indonesia [32] cho thấy tất cả các mẫu
nhiễm loại độc tố này nhƣng ở mức thấp hơn giới hạn cho phép là 750 µg/kg [10].
Bảng 1.7. Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2010 [32]
Độc tố
vi nấm
Tổng
số mẫu
<100

µg/kg
100-200
µg/kg
200-400
µg/kg
Khoảng
hàm lƣợng
(µg/kg)
Giá trị
trung bình
(µg/kg)
DON
50
21
23
6
47,5-348,0
124,6

Trƣớc đó, cũng trong nghiên cứu của Nuryono năm 2005 [23] về sự nhiễm
ZEA trong các mẫu ngô và thực phẩm từ ngô, trong tổng số 51 mẫu có 11 mẫu
dƣơng tính với ZEA và 2 mẫu trong số mẫu dƣơng tính có hàm lƣợng ZEA cao hơn
nhiều (148 và 589 µg/kg) so với giới hạn cho phép là 100 µg/kg [10].
Bảng 1.8. Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2005 [23]
Độc tố vi
nấm
Tổng số
mẫu
Số mẫu
dƣơng tính

Khoảng hàm
lƣợng (µg/kg)
Hàm lƣợng trung
bình (µg/kg)
ZEA
51
11 (21,7 %)
5,5-526
49,5

1.3. Tổng quan phƣơng pháp xác định DON và ZEA
1.3.1. Các phương pháp đã được thực hiện
Rất nhiều phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng và áp dụng để xác định DON và
ZEA trong đó nhƣ TLC, ELISA, GC với kĩ thuật ECD hoặc MS , LC – UV hoặc
FLD, và LC-MS. Các phƣơng pháp này tập trung vào xác định từng loại độc tố vi
nấm hoặc nhóm độc tố riêng biệt, do đó có nhiều ƣu điểm về tính đặc hiệu.
10



Bảng 1.9. Tóm tắt một số phương pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm ZEA và
DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc.
Độc tố vi nấm
Loại nền mẫu
Phƣơng pháp tiêu
chuẩn
Làm
sạch
Định
lƣợng

Zearalenone
Ngô, lúa mạch, sản
phẩm ngũ cốc
Dự thảo TCVN
(EN 15850:2010)
IAC
HPLC-Fl
Deoxynivalenol
Ngô và sản phẩm
ngô
Dự thảo TCVN
(EN 15891:2010)
IAC
HPLC-UV

Đặc điểm chung của các phƣơng pháp này là sử dụng kỹ thuật làm sạch bằng
cột ái lực miễn nhiễm (IAC). Đây là kỹ thuật cho độ đặc hiệu cao, nhƣng chi phí
khá lớn. Hơn nữa, do mỗi độc tố vi nấm cần có một phƣơng pháp riêng nên gây
lãng phí lớn khi thực hiện phân tích nhiều độc tố vi nấm trên một loại nền mẫu, nhƣ
các nền mẫu ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc.
Do đó, các tác giả trên thế giới hƣớng đến phƣơng pháp để xác định đồng
thời nhiều loại độc tố vi nấm trong thực phẩm, đặc biệt là ngũ cốc và sản phẩm từ
ngũ cốc.
Bảng 1.10. Các phương pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực hiện
Năm
Nền
mẫu
Đối tƣợng
Dung môi
chiết

Làm sạch
Kỹ thuật
Độ thu
hồi
LOD
2000
[34]
Ngũ cốc
Trichothecene,
ZEA
ACN –
H
2
0 (3:1)
Cột Florisil, rửa
giải bằng
chloroform -
methanol (9:1)
GC-MS
81-94%
5-10
ng/g
2005
[7]
Ngô
Trichothecene type
A, B , ZEA
ACN –
H20
(84:16)

Cột MycoSep
®

#226
LC–
APCI–
MS/MS
50-99%
0,3-3,8
µg/kg
2009
[35]
Thực
phẩm
ngũ cốc
DON, ZEA và các
chất chuyển hóa
ACN –
H
2
0 –AA
(79:20:1)
Không tìm đƣợc
cột thích hợp
LC–ESI-
MS–MS
51% -
124%
0,5-100
µg/kg

11



Năm
Nền
mẫu
Đối tƣợng
Dung môi
chiết
Làm sạch
Kỹ thuật
Độ thu
hồi
LOD
2010
[28]
Ngũ cốc,
thực
phẩm trẻ
em
DON, ZEA, T-2,
HT-2

MeOH-
H
2
0 (4:1)
IAC
LC–

MS/MS
60–100%
10 -
60µg/kg
2011
[19]
Thực
phẩm từ
ngũ cốc
Aflatoxins,
ochratoxin A,
DON, ZEA, T‐2,
HT‐2
ACN –
H
2
0
(84:16)
SPE -Oasis
®

HLB column
LC/ESI‐
MS/MS
64-114%
0,1 –
59,2
µg/kg
2012
[33]

Ngũ cốc
aflatoxins,
ochratoxin A,
ZEA, DON,
fumonisins, T-2
toxin HT-2
ACN –
H
2
0 –AA
(79:20:1)
Không làm sạch
UPLC-
MS/MS
83,5-
107,3%
0,01 - 25
ng/g
2012
[9]
Ngũ cốc
DON, ZEA, T-2-
toxin và các chất
chuyển hóa
ACN –
H
2
0 –AA
(79:20:1),
loại béo

bằng n-
hexan
Không làm sạch
LC-
MS/MS
80 -
110%
5 -13
ng/g

1.3.2. Phương pháp QuEChERS
QuEChERS là tên viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và
Safe là phƣơng pháp do hai nhà khoa học Anasstasiades và Lehotay phát triển để
phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả [5].
Phƣơng pháp QuEChERS có nhiều ƣu điểm vƣợt trội so với các phƣơng
pháp trƣớc đây:
- Nhanh (với 10 mẫu có thể tiến hành xử lý mẫu trong 30 phút)
- Đơn giản, dễ thực hiện (ít tốn thiết bị, dụng cụ đơn giản, tối thiểu đƣợc
nguồn gây sai số)
- Ít tốn kém cho quá trình phân tích
12



- Tăng độ nhạy của phƣơng pháp do dung dịch chiết không bị pha loãng
nhiều lần
- Ổn định
- An toàn cho ngƣời và môi trƣờng
Các tác giả đã ứng dụng nguyên tắc của phƣơng pháp này để áp dụng đối với
độc tố vi nấm. Một số nghiên cứu đƣợc tổng hợp ở bảng 1.11.

Bảng 1.11. Xác định độc tố vi nấm bằng phương pháp QuEChERS
Năm
Nền
mẫu
Đối tƣợng phân
tích
Làm sạch
Kỹ thuật
Độ thu
hồi
LOQ
2012
[12]
Bỏng
ngô
DON, ZEA,
nivalenol, 15-
acetyl-fusarenon
d-SPE
(MgSO
4
+
C
18
)
GC-MS
61-
118%
65-196
µg/kg

2012
[18]

Gạo
14 độc tố vi nấm
d-SPE
(MgSO
4
, PSA,
C
18
, nhôm
trung tính)
(UHPLC–
MS/MS
70–
98%
1,5-45
µg/kg
2013
[37]
Gia vị
17 độc tố vi nấm
Không làm
sạch
HPLC–
MS/MS
75-
117%
2,3-146

µg/kg
2014
[20]
Bơ
vừng
26 độc tố vi nấm
d-SPE
(MgSO
4
+C
18
)
UPLC-
MS/MS
60–
120%
0,11-
21,74
µg/kg

Có thể nhận thấy điểm chung của các phƣơng pháp QuEChERS là sử dụng
các kỹ thuật sắc ký hiện đại nhƣ GC-MS và đặc biệt là LC-MS/MS. Sỡ dĩ nhƣ vậy
là do phƣơng pháp QuEChERS không có sự làm giàu mẫu nên cần phối hợp với các
kỹ thuật phân tích hiện đại, có độ nhạy tốt. Trong đó, LC-MS/MS cho thấy có nhiều
ƣu điểm về tính đặc hiệu, độ nhạy và độ chính xác.
1.3.3. Phương pháp LC-MS/MS
Sắc kí lỏng khối phổ là một kỹ thuật mới nhƣng đã đƣợc ứng dụng để phân
tích độc tố vi nấm trên nhiều đối tƣợng khác nhau do có nhiều ƣu điểm:
13

- Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất phù
hợp để phân tích các mẫu có hàm lƣợng độc tố vi nấm ở mức thấp
- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z, do đó cùng với khả năng tách các chất
nhờ HPLC thì phƣơng pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều độc tố vi
nấm trong cùng một lần chạy
- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lƣợng và
cấu tạo của chất nên rất đặc trƣng cho từng chất
- Có khả năng phân tích đƣợc những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí,
nhƣ các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt
Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ phận
phát hiện là detector khối phổ.
1.3.3.1. Sắc kí lỏng (HPLC)
Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn). Khi tiến hành chạy sắc kí, các chất phân
tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân
tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng
tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển
với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
a. Pha tĩnh trong HPLC [1][3]
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ 2 – 5 µm. Tùy
theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc kí lỏng pha liên kết thƣờng chia
làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC) và sắc kí pha đảo (RP-HPLC).
- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica đƣợc gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các nhóm chức
phân cực: -NH
2
, -CN…)

- Sắc kí pha đảo: pha tĩnh thƣờng là các silica đã đƣợc alkyl hóa, không phân
cực, loại thông dụng nhất là –C
18
H
37
.
14



b. Pha động trong HPLC [1][3]
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các
chất phân tích trong quá trình sắc kí nhất định. Có thể chia pha động thành hai loại:
- Pha động phân cực: có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích
các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực nhƣ methanol,
acetonitrile. Pha động loại này đƣợc dùng trong sắc kí pha liên kết pha đảo
- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực nhƣ
xyclopentan, n-pentan, n-hexan, n-heptan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS
2
),
clorobutan, CCl
4,
toluene…
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng
rửa giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ
phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha
động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
1.3.3.2. Khối phổ [6]
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng

và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa, … Các ion tạo thành này đƣợc tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.
Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS đƣợc trình bày ở hình 1.4. Cấu
tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân tích khối
và bộ phận phát hiện.

Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS/MS
Sắc kí
lỏng
Ion hóa
Bộ phân tích
khối
Detector/lƣu
giữ số liệu
Chân không
15



a. Nguồn ion hoá
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và đƣợc ion hóa nguyên tử. Các kĩ thuật ion hóa thƣờng đƣợc sử
dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở
áp suất khí quyển (APCI) . Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI.
Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí.
Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc duy trì ở hiệu điện
thế khoảng 1- 5kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện
và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc

khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi
dung môi. Có hai chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng ESI(+) và ion âm
ESI(-). Đối với chế độ ESI(+), ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M+H]
+
, còn đối
với chế độ ESI(-), ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M-H]
-

b. Bộ phận phân tích khối
Sau khi đã đƣợc ion hóa, các ion đƣợc đƣa đến bộ phận phân tích khối nhằm
loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn phá thêm
để thu đƣợc các ion con. Các kỹ thuật phân tích khối đƣợc sử dụng phổ biến là bộ
phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay. Bộ
phân tích khối ba tứ cực đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây
chính là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực có cấu tạo gồm 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng
trống để các ion bay qua. Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc
này. Tứ cực thứ 1 (Q1) và thứ 3 (Q3) có vai trò nhƣ là các bộ lọc khối. Còn tứ cực
thứ 2 (Q2) có vai trò nhƣ là buồng va chạm, tại đó các ion sau khi qua Q1 (ion mẹ)
đƣợc bắn phá bởi năng lƣợng và khí trơ để tạo thành các ion nhỏ hơn (ion con). Các
ion này đƣợc lựa chọn tại Q3.
c. Bộ phận phát hiện:
16



Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo
ra một tín hiệu của các ion dƣơng tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch
đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển.

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ
nhạy cao. Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron.
Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo ra các electron
thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Cứ nhƣ vậy tín hiệu sẽ đƣợc
khuếch đại và đƣợc ghi lại. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với lƣợng ion do đó tỷ lệ với
nồng độ chất phân tích ban đầu.


17



Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1. Độc tố vi nấm
Đối tƣợng nghiên cứu là 2 độc tố vi nấm deoxynivalenol (DON) và
zearalenone (ZEA).
Bảng 2.1. Các độc tố vi nấm được sử dụng trong nghiên cứu
TT
Độc tố vi nấm
Ký hiệu
Công thức phân
tử
Khối lƣợng phân
tử
1
Deoxynivalenol
DON
C

15
H
20
O
6
296
2
Zearalenone
ZEA
C
18
H
22
O
5

318

2.1.1.2. Đối tượng phân tích
Đối tƣợng mẫu đƣợc lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
là các mẫu ngô đại diện cho nền mẫu ngũ cốc. Đây là đối tƣợng thực phẩm có chứa
nhiều nguy cơ nhiễm nhiều loại độc tố vi nấm nhất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ hai lần (LC-MS/MS) gồm máy sắc
kí lỏng LC- 20AD
XR
của Shimadzu, Nhật và máy khối phổ ba tứ cực ABI
5500 của hãng ABSciex, Mỹ.
- Máy lắc xoáy, IKA.

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips
- Máy li tâm Z383K, Hermle
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.
- Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01 g), Metter Toledo.