Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây thạch châu (pyrenaria sp )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
THẠCH CHÂU (Pyrenaria sp.)


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2015



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
THẠCH CHÂU

(Pyrenaria sp.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Bùi Hồng Cường
2. DS. Dương Thị Hảo
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội
Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu


HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nỗ lực nghiên cứu hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được
rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy: TS. Bùi
Hồng Cường - giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà
Nội và DS. Dương Thị Hảo đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên
tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phương Thiện Thương cùng các anh chị cán
bộ Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi và
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các Bộ môn và toàn thể thầy
cô giáo trường Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo tôi trong suốt 5
năm học vừa qua.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè,

những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó
khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Dung










MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. THỰC VẬT 2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Pyrenaria 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Pyrenaria 2
1.1.3. Phân loại thực vật chi Pyrenaria 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 6
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 6

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 7
2.3.1. Nghiên cứu về mặt thực vật 7
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học 7
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7
2.4.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 7
2.4.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học 8
2.4.3. Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học 8
2.4.4. Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM 15
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16
3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY THẠCH CHÂU 16
3.1.1. Đặc điểm hình thái 16
3.1.2. Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 19
3.1.3. Đặc điểm vi học 19
3.1.3.1. Đặc điểm vi phẫu 19
3.1.3.1.1. Đặc điểm vi phẫu lá 19


3.1.3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân 21
3.1.2.2. Đặc điểm bột 22
3.1.2.2.1. Đặc điểm bột lá 22
3.1.2.2.2. Đặc điểm bột thân 23
3.2. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 24
3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 24
3.2.2. Định tính các nhóm chất đặc trưng bằng sắc kí lớp mỏng 26
3.3. BÀN LUẬN 34
3.3.1. Về thực vật 34
3.3.2. Về thành phần hóa học 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên đầy đủ
AST
:
Ánh sáng thường
B
:
Butanol
C
:
Cồn (ethanol)
Dd

:
Dung dịch
E
:
Ethyl acetat
H
:
Hexan
P
:
page
N
:
Nước
NXB
:
Nhà xuất bản
Rf
:
Hệ số lưu
SKĐ
:
Sắc ký đồ
SKLM
:
Sắc kí lớp mỏng
TLC
:
Thin - layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
TP

:
Toàn phần
TT
:
Thuốc thử
UV
:
Ultraviolet (Phổ tử ngoại)










1. DANH MỤC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1: Kết quả định tính hóa học các nhóm chất trong Thạch
châu
24
2
Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan
28

3
Bảng 3.3: Kết quả SKLM cắn phân đoạn ethyl acetat
29
4
Bảng 3.4: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-butanol
30
5
Bảng 3.5: Kết quả SKLM định tính nhóm flavonoid trong cắn
ethanol (C) và cắn nước (N)
32
6
Bảng 3.6: Kết quả SKLM định tính tanin cắn ethanol và cắn nước
33

DANH MỤC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia
5
2
Hình 3.1: Ảnh cơ quan sinh dưỡng cây Thạch châu nghiên cứu
18
3
Hình 3.2: Ảnh cơ quan sinh sản cây Thạch châu nghiên cứu
18
4
Hình 3.3: Vi phẫu gân lá Thạch châu
20
5
Hình 3.4: Vi phẫu phiến lá Thạch châu
20
6
Hình 3.5: Vi phẫu thân Thạch châu
21
7
Hình 3.6: Một số đặc điểm bột lá Thạch châu
22
8
Hình 3.7: Một số đặc điểm bột thân Thạch châu
23

9
Hình 3.8: Sơ đồ quy trình chiết các phân đoạn Thạch châu
27
10
Hình 3.9: Sắc ký đồ định tính cắn n-hexan
28
11
Hình 3.10: Sắc ký đồ định tính cắnethyl acetat
29
12
Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính cắn n-butanol
30
13
Hình 3.12: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cắn ethanol (C) và
cắn nước (N)
31
14
Hình 3.13: Sắc ký đồ định tính tanin trong cắn ethanol (C) và cắn
nước (N)
33





1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm đã tạo nên cho đất nước Việt Nam thảm
thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật khác nhau

[15]. Từ xa xưa, các lương y đã biết khai thác dược liệu từ thiên nhiên để làm thuốc
góp phần làm giàu thêm cho nền y học cổ truyền dân tộc. Trong vài thập kỷ gần
đây, với xu hướng “Trở về với thiên nhiên”, ngày càng có nhiều nước trên thế giới
đẩy mạnh nghiên cứu, bào chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên,
từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh. Tuy nhiên phần lớn nguồn tài nguyên này ở
Việt Nam được sử dụng theo kinh nghiệm y học cổ truyền mà chưa được nghiên
cứu đầy đủ.
Thạch châu là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm
Đồng, Quảng Trị, Lào Cai) [12], [30]. Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái
và sử dụng Thạch châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, loài này
còn được sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề
kháng…[6]. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên
cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái và
phân loại theo các phương pháp mới như Protein hay AND [9], [12], [15], [24],
[22], [31]. Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây
Thạch châu từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao
hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ cho công tác
tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm
thực vật, thành phần hóa học của cây Thạch châu (Pyrenaria sp.)” được thực
hiện với hai mục tiêu sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột của thân,
lá) và giám định chính xác tên khoa học của cây Thạch châu.
2. Xác định sơ bộ các nhóm chất trong cây Thạch châu (phần trên mặt đất)
bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC VẬT
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Pyrenaria
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [1], [8], [9], [29], vị trí của chi

Pyrenaria như sau:
Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ (Order): Thạch lam (Ericales)
Họ (Family) : Chè (Theaceae)
Chi (Genus): Pyrenaria.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Pyrenaria
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Pyrenaria
Cây bụi hoặc cây đại mộc sống nhiều năm, cao từ 8 đến 17 m. Thân trụ. Lá
mọc đối hoặc so le, có cuống nhỏ, mép lá khía răng, phiến lá hình bầu dục, thường
có rang tà, gân phụ, dài 8-14cm [1], [9], [12], [22], [23].
Hoa mọc ở nách lá, đơn độc, có cuống nhỏ hoặc gần như không cuống. Tiền
khai hoa kiểu vặn hoặc lợp. Đài hoa 5 hoặc 6, kích thước không đều nhau, phía
ngoài có phủ lông nhỏ và mịn, phía trong màu nâu và nhẵn. Tràng hoa 5 hoặc hơn,
màu trắng hoặc vàng nhạt, cánh hoa dính nhau ở đáy. Nhị nhiều, gắn vào đế hoa
theo nhiều vòng; bao phấn 2 ô, hướng trong, nứt dọc. Bầu trên, 2-6 ô, mỗi ô 2-5 lá
noãn [1], [12], [22], [23].
Quả nang hoặc quả đóng có hột cứng, thường là 2 hạt mỗi ô. Vỏ quả hóa gỗ
hoặc dai như da [12], [22], [23].
Hạt thuôn dài, bề mặt lồi và có góc cạnh, không cánh, vỏ hạt cứng, mịn, sáng
bóng; rốn tuyến tính; không có nội nhũ; phôi lớn; lá mầm mỏng [22], [23].
1.1.2.2. Phân bố
Pyrenaria là một chi nhỏ thuộc họ Chè. Theo các nghiên cứu công bố, ước
tính có khoảng hơn 50 loài trên thế giới thuộc chi này [22], [23], [30], phân bố chủ
yếu ở vùng núi cao, khí hậu mát mẻ như: Đài Loan, Trung Quốc, Malasia, Đông
3

Nam Á và một số nước Đông Bắc Châu Mỹ [22], [30]. Ở Việt Nam, theo thống kê
có khoảng 4 loài thuộc chi Pyrenaria phân bố ở Đà Lạt, Quảng Trị, Sapa [12].
1.1.3. Phân loại thực vật chi Pyrenaria

Một số loài thuộc chi Pyrenaria thường gặp ở Việt Nam:
1.1.3.1. P. garretiana Craib - Thạch châu Garrett
a, Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ hoặc trung bình, cao 4-15m. Cành, nhánh có lông dày, nâu, nhánh
già có màu nâu tro. Lá có nhiều lá dày, cứng, hình xoan thon ngược, kích thước 10-
14 x 4-5cm, mặt trên có màu vàng nhạt, gân-phụ không đều, 11-13 cặp, bìa có răng
nhọn; cuống 1 cm, có lông phún nâu [12], [23].
Hoa có cuống dài khoảng 5mm; chiều dài hoa 1-2cm; cánh đài dạng cánh
hoa; cánh hoa dính nhau ở đáy; đài 5; nhị ngắn, vàng; vòi nhụy 5 [12], [23].
Quả nhân cứng xoan tròn, to 18x20mm [12], [23].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở Sapa, độ cao 1000-1850m [12], [23].
1.1.3.2. P. jonqueriana Piere - Thạch châu Jonquier
a, Đặc điểm thực vật
Cây đại mộc 7-12m. Cành chia làm nhiều nhánh. Lá mọc so le, hình mác
thuôn, đầu nhọn, phiến lá dài, mỏng, bìa có răng, mặt dưới nâu lúc khô [12], [22].
Hoa không cọng hoặc có cuống nhỏ (3-6 mm); đài tràng không phân biệt rõ
ràng, đài 8-10, tràng 8-10, hơi vàng hay trắng, phiến to nhất dài 15mm, bìa rìa lông,
cánh hoa chóp lõm, màu ngà; 3-6 hàng tiểu nhị vàng; bầu trên, 3 ô [12], [22].
Quả tự mở, dài khoảng 35mm, tròn hoặc chia thùy mờ. Quả có vỏ dai như
da, trong chứa nhân cứng dài 35mm; hột 1-3 [12], [22], [23].
Hạt phẳng, có góc cạnh, không có cánh [23].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở núi cao 800-1700m: Vọng Phu, Bạch Mã, Đà Lạt [12].
1 1.3.3. P. polilaneana Gagn - Thạch châu Poilane
a, Đặc điểm thực vật
4

Cây đại mộc 13m; nhánh non mảnh, không lông. Lá dài 7-10cm, không lông,
tái ở mặt dưới (nâu lúc khô), bìa có răng [12].

Hoa trắng, rộng 3cm; lá đài như tơ ở mặt ngoài; cánh hoa dính nhau ở đáy;
nhị nhiều; vòi nhụy 3 [12].
Quả có nhân cứng tròn, dẹp, to 35mm; hột 20x8mm [12].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở vùng núi cao: Quảng Trị, Bạch Mã, Braian [12].
1.1.3.4. P. serrata Bl - Thạch châu răng cưa
a, Đặc điểm thực vật
Cây đại mộc cao khoảng 10m; nhánh tròn, có lông mịn. Phiến lá hình bầu
dục thon mượt, 7-10 x 3-5cm, cuống dài 15-20mm, nâu lúc khô [12].
Quả có nhân cứng to, bẹp, đầu lõm, rộng 2,5-3cm [12].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở Ba Vì, độ cao 800m [12].
1.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Theo các nghiên cứu, họ Chè (Theaceae) thường có thành phần hóa học
chính là các tanin, flavonoid, amino acid, polyphenol… [3], [8]. Theo một số bài
báo quốc tế được công bố gần đây, loại trà hoa Nhật (Camellia japonica) họ Chè có
chứa cafein, polyphenol, tanin (camelliatanin A và B), gemin D, casuariin [25],
[21]… Đặc biệt, loài trà Camellia sinensis đã và đang được quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất, các thành phần được biết đến gồm có flavonoid như epigallocatechin,
epicatechin, gallocatechin, catechin (Hình 1.1), nhất là hợp chất epigallocatechin
gallat (EGCG) có tác dụng tốt cho sức khỏe con người; ngoài ra còn có polyphenol,
amino acid, vitamin, alkaloid, polysaccharid [25], [28].
5



Epigallocatechin gallate
Catechin

Gallocatechin
Epicatechin

Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia
Hiện nay các nghiên cứu về chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại
theo các phương pháp mới như Protein hay AND [24], [31], hầu như chưa có
nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
6

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Phần trên mặt đất (cành, lá, hoa, quả) của cây Thạch
châu được thu hái ở Mê Linh, Lâm Hà, Lâm Đồng vào tháng 3/2015. Mẫu được làm
sạch phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu, Khoa Hóa
phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường
đại học Dược Hà Nội theo Phiếu giám định số 02/2015. Mẫu được lưu tại Phòng
tiêu bản cây thuốc, Bộ môn Thực vật với số hiệu là HNIP/18110/15.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
 Thiết bị dùng cho nghiên cứu
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy.
- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60.
- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200.
- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng UV 254nm và UV 366nm).
- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn,
bình cầu, phễu, giấy lọc…
- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3.
- Máy vi tính với phần mềm winCATS và VideoScan.
- Bản sắc ký lớp mỏng Silicagel 60F
254

(Merck) (code: 1.05554.0001).
- Máy ảnh Canon, Samsung 10.3.
 Hóa chất, dung môi, dụng cụ
- Các dung môi: ethanol (C), methanol (Me), n-hexan (H), ethyl acetat (E), n-
buthanol (B), acid formic, cloroform, toluen, ether dầu hỏa… đạt tiêu chuẩn
phân tích theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Các thuốc thử dùng trong nghiên cứu bằng phản ứng hóa học: TT Lugol, TT
Bouchardat, TT Mayer, TT Dragendoff, TT Diazo,… được pha chế theo
hướng dẫn của DĐVN IV.
7

- Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất:
hỗn hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), anisaldehyd
trong cồn, acid sulfuric 10% trong cồn… pha theo các tài liệu tham khảo.
- Dụng cụ: các dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí
nghiệm (bộ dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, dao cắt, cốc có mỏ, đũa thủy tinh,
đĩa petri, ống nghiệm, pipet, bình gạn, bình nón, lam kính, chày cối, bát sứ,
mao quản, cốc chạy sắc ký…).
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về mặt thực vật
Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học: Quan sát, mô tả dược liệu
về đặc điểm thực vật, hình dạng, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng mắt thường và
chụp ảnh, làm tiêu bản ép, đối chiếu với các tài liệu phân loại thực vật để xác định
tên khoa học của mẫu nghiên cứu [1], [12], [18], [19].
Đặc điểm vi học: Nghiên cứu đặc điểm vi học theo tài liệu thực tập Thực tập
dược liệu (phần vi học) [4]. Kết quả được xem dưới kính hiển vi có tích hợp máy
ảnh kỹ thuật số.
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phần của Thạch châu
bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric).

Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 99,7%
chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan,
ethylacetat, n-buthanol. Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất
chính trong các phân đoạn bằng các thuốc thử đặc trưng.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
Mô tả đặc điểm theo phương pháp ghi trong tài liệu hướng dẫn thường quy,
đối chiếu các tài liệu tham khảo để xác định tên khoa học [1], [12].
8

2.4.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học
Sau khi thu hái, mẫu được đem xử lý bằng các phương pháp thích hợp rồi
nghiên cứu:
 - Vi phẫu: tiến hành làm vi phẫu theo các bước sau:
 + Chọn mẫu thích hợp.
 + Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay.
 + Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch javen, rửa
sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước cất,
ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất đến hết acid. Sau đó tiến
hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn.
 + Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch hỗn hợp
glycerin - nước (1:1) rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải
phẫu, chụp ảnh bằng máy ảnh qua kính hiển vi.
 - Bột dược liệu:
 + Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột.
 + Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
 + Lên tiêu bản bột dược liệu bằng dung dịch hỗn hợp glycerin - nước (1:1),
quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính
hiển vi có kết hợp máy ảnh để lưu mẫu.
2.4.3. Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học

Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60
0
C. Đem ra tán
nhỏ bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng
mát, khô ráo.
Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Thạch châu bằng phản
ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [3], [5], [6].
2.4.3.1. Định tính flavonoid
Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml ethanol
90%. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a, Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
9

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại
(khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5) giọt. Để yên một vài phút, nếu có
flavonoid sẽ thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam.
b, Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô
rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt
dịch chiết đối chứng. Nếu có flavonoid sẽ thấy vết màu vàng đậm lên.
Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm
vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu có flavonoid sẽ thấy xuất hiện tủa vàng và khi
thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm.
c, Phản ứng với FeCl
3

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl
3
5%,
nếu có flavonoid sẽ thấy xuất hiện dung dịch màu xanh đen.

d, Phản ứng với diazo hóa
Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 9ml HCl đậm đặc
(đun nóng), pha loãng với nước đến 100ml. Lấy 10ml dung dịch ngâm trong nước
đá rồi cho thêm 10ml dung dịch NaNO
2
4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá.
Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0
o
C trong 15 phút. Dung dịch chỉ pha để dùng ngay.
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH,
KOH, Na
2
CO
3
), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng
trên nồi cách thủy vài phút), nếu có flavonoid sẽ xuất hiện màu đỏ.
2.4.3.2. Định tính coumarin
Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến
hành các phản ứng sau:
a, Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:
- Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
- Ống 2: để nguyên.
10

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát. Nếu có coumarin quan
sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong. Thêm vào cả hai ống
nghiệm mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:
- Ống 1: dd vẫn đục.
- Ống 2: trong suốt.

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại trong như ống 2.
b, Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH
10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo, nếu có
coumarin sẽ có màu đỏ gạch.
c, Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác
dụng với dung dịch kiềm
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%.
Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại
(chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại
ra. Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại, nếu có coumarin sẽ thấy: phần không bị che có
huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ
sáng dần lên. Sau vài phút cả hai phần sẽ phát quang như nhau.
2.4.3.3. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích
250ml, thêm 5ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi 15 phút. Lọc nóng qua giấy lọc,
dịch lọc được đưa vào làm các phản ứng:
a, Phản ứng tạo bọt
Cho 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, bịt ống nghiệm
bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm trong 30 giây. Để yên. Quan sát cột bọt sau
15 phút. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa
saponin.
b, Phân biệt 2 loại saponin
Lấy hai ống nghiệm có đường kính trong bằng nhau:
11

- Ống 1: cho 5ml HCl 0,1N.
- Ống 2: cho 5ml NaOH 0,1N.
Cho thêm 1ml dịch chiết ethanol vào mỗi ống rồi bịt miệng ống nghiệm bằng
ngón tay cái, lắc mạnh cả hai ống trong 30 giây. Để yên, quan sát cột bọt sau 15

phút.
Nếu cột bọt ở cả hai ống bằng nhau thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin
triterpenoid.
Nếu cột bọt ở ống chứa NaOH cao hơn thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa
saponin steroid.
c, Phản ứng Salkowski
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm. Nghiêng ống nghiệm 45 độ, cho từ từ
theo thành ống nghiệm 2-3 giọt acid sulfuric đặc, nếu có saponin sẽ xuất hiện vòng
màu đỏ tía ở mặt phân cách. Lắc nhẹ dung dịch chuyển sang màu đỏ.
2.4.3.4. Định tính glycosid tim
Cho 20 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn 25
o
,
lắc đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng
chì acetat 30% để dư. Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dung dịch Na
2
SO
4
bão
hòa đến khi không còn tủa với Na
2
SO
4
nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2
lần với hỗn hợp cloroform : ethanol (4:1), mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết,
loại nước bằng cách lọc qua bông. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được
sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được để làm phản ứng định tính.
a, Phản ứng Liberman
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết
cắn. Nghiêng ống 45

o
. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H
2
SO
4
đặc để dịch
lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp. Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có
vòng màu hồng tím đến xanh ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng.
b, Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết
cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid
12

picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) mới pha vào ống nghiệm. Nếu
có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ cam.
c, Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết
cắn. Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%,
lắc đều. Nếu có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ.
d, Phản ứng Keller-Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn.
Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng
ống 45
o
. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H
2
SO
4
đặc, tránh xáo trộn chất lỏng
trong ống nghiệm. Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vòng màu tím đỏ ở mặt

tiếp xúc 2 lớp chất lỏng.
2.4.3.5. Định tính anthranoid (dạng tự do)
a, Phản ứng Bortraeger
Chiết xuất: Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml
nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua
giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm
nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform
để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch
amoniac 10%. Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp
cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic. Thêm tiếp
tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu
vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch
NaOH 10%, lắc nhẹ. Nếu có anthranoid lớp nước sẽ có màu đỏ sim.
Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn
toàn tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5ml nước cất bằng 5ml
H
2
SO
4
1N.
13

b, Phản ứng vi thăng hoa
Đặt khoảng 3g bột dược liệu trong một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên bếp điện cho
bay hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên phiến kính
đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh. Để đĩa nhôm trực tiếp trên bếp điện.
Sau 5-10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển vi thì thấy tinh thể
hinh kim màu vàng. Sau khi nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính, dung dịch sẽ có

màu đỏ.
2.4.3.6. Định tính tanin
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml
nước cất, đun sôi trong 2 phút, để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để làm các phản
ứng định tính sau:
- Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc. Thêm 2 giọt dung dịch FeCl
3

5% (TT) nếu có tanin sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh
nâu nhạt.
- Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc. Thêm 2 giọt chì acetat 10%
(TT), nếu có tanin sẽ xuất hiện tủa bông.
- Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin
1% nếu có tanin sẽ xuất hiện tủa bông trắng.
2 4.3.7. Định tính alcaloid
Cân 0,5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch
acid sulfuric 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml,
kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9-10 (thử
bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid bằng cloroform (chiết 3
lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết cloroform. Loại nước bằng natrisulfat khan.
Lấy một phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần
5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ
vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:


14

Ống nghiệm
Thuốc thử đặc trưng
Kết quả phản ứng nếu có

alkaloid sẽ xuất hiện
Ống 1
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Bouchardat
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
nâu đến đỏ nâu
Ống 2
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Dragendorff
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
vàng cam đến đỏ
Ống 3
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Mayer
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
trắng đến vàng
2.4.3.8. Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml
nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội. Lọc. Dịch lọc được dùng để làm phản ứng
định tính sau:
Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước. Thêm vào 5
giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 10 phút. Nếu
có đường khử: đáy ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn. Cho vào mỗi ống:
- Ống 1: 4ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol.
- Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.
Quan sát và so sánh hai ống nghiệm: nếu có polysaccharid, ống 1 có màu
xanh đậm hơn ống 2.
Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước. Thêm vào 3
giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi 10 phút. Nếu có acid amin, xuất

hiện dung dịch màu xanh tím.
Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4ml dịch chiết nước. Thêm một ít
bột Na
2
CO
3
vào ống nghiệm. Nếu có acid hữu cơ, xuất hiện bọt khí bay lên.
2.4.3.9. Định tính chất béo, sterol, caroten
Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml. Đổ ngập ether dầu hỏa.
Ngâm qua đêm. Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:
15

Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc. Hơ nóng cho
bay hơi hết dung môi. Nếu có chất béo thì quan sát thấy vết mờ trên giấy lọc.
Định tính sterol: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách
thủy bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ.
Để nghiêng ống nghiệm 45 độ, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống
nghiệm. Quan sát nếu có sterol thì sẽ thấy tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng
có vòng tròn màu tím đỏ.
Định tính caroten: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa. Cô cách
thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm 2 giọt H
2
SO
4
đặc vào cắn. Quan sát: nếu có
caroten sẽ thấy dung dịch chuyển sang màu xanh lá đậm.
2.4.4. Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM
Chiết xuất dịch chiết toàn phần bằng ethanol 99,7% bằng phương pháp chiết
nóng hồi lưu, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Lắc phân đoạn bằng phân bố cắn
dịch chiết ethanol vào nước và chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực

tăng dần theo thứ tự lần lượt là n-hexan, ethyl acetat, n-butanol kết hợp thu hồi dung
môi dưới áp suất giảm.
Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ dung môi
cho kết quả phân tách tốt nhất đối với từng phân đoạn kết hợp quan sát ở các bước
sóng UV-VIS và thuốc thử hiện màu đặc trưng, lưu giữ bằng máy ảnh.
Các thông số đặc trưng:
- Bản mỏng: Bản mỏng Silica gel 60 F
254
(Merck) kích thước 10x20cm.
- Dung môi khai triển: khảo sát theo các tài liệu hướng dẫn có thay đổi theo
kết quả thực tế phân tích.
- Dung dịch chấm bản mỏng: dịch chiết toàn phần và các phân đoạn.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10-15μl các dung dịch phân
tích. Sau khi triển khai bản mỏng bằng các hệ dung môi đã lựa chọn, để khô trong
không khí hoặc sấy nhẹ. Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng có các nhóm chất
và sấy ở nhiệt độ phù hợp. Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm,
366nm, ánh sáng thường trước và sau khi phun thuốc thử.
16


Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY THẠCH CHÂU
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây gỗ 7-15m, sống lâu năm. Thân có màu nâu, tiết diện tròn. Cành chia
nhiều nhánh (Hình 3.1a). Lá đơn, mọc so le (Hình 3.1b); hình mác thuôn, đầu nhọn,
phiến lá dài, mỏng, dai; không có lá kèm; dài khoảng 5-15cm; mặt trên nhẵn, có
màu xanh nõn chuối khi non (Hình 3.1d), xanh đậm khi già (Hình 3.1a); mặt dưới
của lá non và đầu chồi có lông nhỏ, trắng, mịn (Hình 3.1c); gốc lá thuôn hoặc tròn,
ngọn lá nhọn; mép lá: phía gốc lá nguyên, phía ngọn lá: khía răng cưa; gân lá hình
lông chim, gân chính nổi rõ (Hình 3.1d).

Hoa mọc đơn độc ở đầu cành, nách lá hoặc ở các vết sẹo trên thân; không
cuống hoặc có cuống nhỏ (Hình 3.1b); màu vàng, mẫu 5, lưỡng tính (Hình 3.2b). Đế
hoa lõm hình chén (Hình 3.2b). Bao hoa xếp xoắn. Đài: 10-15 cánh đài gần tròn,
hình trứng, có lông phủ ở mặt ngoài và ở mép (Hình 3.2e). Tràng 14-15, đều, hình
gần tròn hoặc hình trứng, cả mặt trong và mặt ngoài của cánh hoa phủ một lớp lông
mịn (Hình 3.2e), phiến to nhất dài 1,5cm. Nhị nhiều, hơi dính nhau ở gốc chỉ nhị
thành ống, xếp thành nhiều vòng trên đế hoa (Hình 3.2c); chiều dài bộ nhị 0,5-1cm,
bộ nhị gồm 3-6 hàng tiểu nhị, màu vàng đậm; chỉ nhị dài, nhẵn; bao phấn đính lưng,
2 ô, hình thận, hướng trong, nứt dọc (Hình 3.2c). Bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành
bầu trên hình cầu (Hình 3.2g) 3 ô; bầu, vòi hàn liền, núm rời; đính noãn trung trụ
(Hình 3.2h).
Quả đóng dài 1-1,5 cm, có vỏ dai, ít nhiều hóa gỗ, màu xanh khi non (Hình
3.2k), màu nâu khi già hay khô (Hình 3.2i), trong chứa 3 hột (Hình 3.2l).
Ảnh đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1, 3.2:
18





Hình 3.1: Ảnh cơ quan sinh dưỡng cây Thạch châu nghiên cứu
Chú thích: a. Toàn cây; b. Cành mang lá, hoa; c. Chồi cành; d. Lá
Hình 3.2: Ảnh cơ quan sinh sản cây Thạch châu nghiên cứu
Chú thích: a. Hoa; b. Đế hoa; c. Bộ nhị; d. Nhị; e. Đài tràng; g. Bộ
nhụy; h. Bầu cắt ngang; i. Quả khô; k. Quả tươi; l. Quả cắt ngang,
hạt.