Nghiên cứu triển khai kỹ thuật tách chiết ARN từ mô động vật và RT PCR

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




ĐẶNG LAN HƢƠNG

NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT
TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT
VÀ RT-PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



ĐẶNG LAN HƢƠNG


NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT
TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT
VÀ RT-PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
1.TS. Đào Thị Mai Anh
2.TS. Phùng Thanh Hƣơng
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội





HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô Trường Đại học
Dược đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức quý báu cho em trong suốt thời gian
em học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị
kỹ thuật viên bộ môn Hóa Sinh, bộ môn Thực vật, bộ môn Vi sinh – Ký sinh, bộ
môn Vi sinh – Công nghiệp Dược, bộ môn Dược lực – trường Đại học Dược Hà
Nội, cũng như Viện công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
quá trình nghiên cứu.
Đặc biệt, em xin tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất tới sự quan tâm và hướng dẫn
tận tình của TS. Đào Thị Mai Anh, người thầy tâm huyết đã trực tiếp hướng dẫn,
góp ý và truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để giúp em hoàn thành
khóa luận của mình một cách tốt nhất.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS. Phùng Thanh Hƣơng đã
luôn hết mình hỗ trợ chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Đồng thời em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp
đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh Viên

Đặng Lan Hƣơng
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………… 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. ARN 3
1.1.1. Cấu trúc 3
1.1.2. Phân loại, chức năng 4
1.1.3. Quá trình sinh tổng hợp ARN 8
1.1.4. Quá trình phiên mã ngược 9
1.2. Kỹ thuật tách chiết ARN 10
1.2.1. Yêu cầu chung của các phương pháp tách chiết ARN 10
1.2.2. Các phương pháp tách chiết ARN 11
1.2.3. Các thông số đánh giá chất lượng và số lượng ARN 12
1.3. Phương pháp RT-PCR 13
1.3.1. Phản ứng RT (Reverse transcription) 13
1.3.2. Kỹ thuật PCR 14
1.3.3. Các biến thể của RT-PCR 17
1.4. Vai trò của tách chiết ARN và RT-PCR trong lĩnh vực Y Dược 18
1.4.1. Vai trò của tách chiết ARN: 18
1.4.2. Vai trò của RT-PCR 19
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 21
2.1.1. Nguyên liệu 21

2.1.2. Hóa chất 21
2.1.3. Thiết bị 22
2.1.4. Dụng cụ 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 22
2.3. Phương pháp thực nghiệm 24
2.3.1. Phương pháp tách chiết ARN 24
2.3.2. Phương pháp kiểm tra chất lượng ARN 25
2.3.3. Phương pháp tiến hành phản ứng phiên mã ngược sử dụng enzym
reverse transcriptase (phản ứng RT) 26
2.3.4. Phương pháp PCR 27
2.3.5. Xử lí số liệu 28
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 29
3.1. Kết quả 29
3.1.1. Kết quả tách chiết ARN 29
3.1.2. Kết quả khảo sát một số thông số của RT-PCR 34
3.1.3. Kết quả sử dụng RT-PCR để nghiên cứu biểu hiện gen 36
3.2. Bàn luận 42
3.2.1. Về kết quả tách ARN tổng số bằng TRIzol 42
3.2.2. Về ứng dụng RT-PCR để nghiên cứu sự biểu hiện gen: 44
KẾT LUẬN 46
KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
Tên đầy đủ tiếng Anh
Tên tiếng việt
A

Adenin
ADN

Acid deoxyribonucleic
ARN

Acid ribonucleic
bps
Base pairs
cặp bazơ nitơ
C

Cytosin
cADN
Complementary DNA
ADN bổ sung
CTAB

Cetyltrimethylammonium
bromid
dNTPs

Deoxynucleosid triphosphat
G

Guanin
G6Pase

Glucose 6 phosphatase
GAPDH

Glyceraldehyd-3-phosphat

dehydroxylase
lncARN
Long noncoding RNA
ARN lớn không mã hóa
mARN
Message RNA
ARN thông tin
miARN
Micro RNA
ARN siêu nhỏ
NMP

ribonucleosid monophosphat
OD
Optical density
Mật độ quang
PCR
Polymer chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
PPi

Pyrophosphat
qRT-PCR
Quantitative Reverse transcription
Polymerase chain reaction

rARN
ribosom RNA
ARN ribosom
RT

Reverse transcription
Phiên mã ngược
RT-PCR
Reverse transcription Polymerase
chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen có
phiên mã ngược
S
Sedimentation
Hệ số lắng
siARN
Small interfering RNA
ARN can thiệp nhỏ
snARN
Small nuclear ARN
ARN nhỏ ở nhân
snoARN
Small nucleolar ARN
ARN nhỏ ở hạch nhân
STZ
Streptozotocine
Streptozotocin
T

Thiamin
tARN
Transfer RNA
ARN vận chuyển
TBE

Đệm Tris - Borat - acid
Ethylenediaminetetraacetic
U

Uridin
UTR
Untranslated region
Vùng không được dịch mã




DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 3.1
Nồng độ của ARN tách chiết từ mô gan
31
Bảng 3.2
Nồng độ của ARN tách chiết từ mô mỡ
31
Bảng 3.3
Tỷ lệ OD
260
/OD
230
và OD
260
/OD

280
của ARN tách chiết từ mô
gan
32
Bảng 3.4
Tỷ lệ OD
260
/OD
230
và OD
260
/OD
280
của ARN tách chiết từ mô
mỡ
32
Bảng 3.5
Kết quả phân tích đậm độ của băng bằng phần mềm ImageJ
39
Bảng 3.6
Kết quả phân tích đậm độ các băng bằng phần mềm ImageJ
và tính toán lượng ARN biểu hiện.
41
Bảng 3.7
So sánh khả năng biểu hiện của gen G6Pase so với GADPH
41
Bảng 3.8
Các hóa chất sử dụng trong tách chiết ARN
43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1
Cấu tạo của một ribonucleotid
2
Hình 1.2
Liên kết phosphodieste
4
Hình 1.3
Một số cấu trúc bậc 2 của ARN
4
Hình 1.4
Cấu tạo của phân tử mARN
5
Hình 1.5
Cấu trúc bậc hai của phân tử tARN
6
Hình 1.6
Quá trình phiên mã ngược của virus
9
Hình 1.7
Nguyên lý của phản ứng RT
14
Hình 1.8
Nguyên lý của kỹ thuật PCR
15

Hình 2.1
Đồ thị và hàm số biểu thị mối quan hệ giữa mật độ quang
và nồng độ ARN
25
Hình 3.1
Phổ hấp thụ của ARN tách từ mô gan từ bước sóng 200
nm đến 300 nm
29
Hình 3.2
Phổ hấp thụ của ARN tách từ mô mỡ từ bước sóng 200
nm đến 300 nm
30
Hình 3.3
Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN được tách từ mô gan
33
Hình 3.4
Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN được tách từ mô mỡ
33
Hình 3.5
Sự biểu hiện gen của GAPDH và G6Pase ở mô gan ở 28
chu kỳ
34
Hình 3.6
Sự biểu hiện gen của GAPDH và G6Pase ở mô gan ở 36
chu kỳ
35


Hình 3.7
Sự biểu hiện gen G6Pase ở mô gan và mô mỡ

36
Hình 3.8
Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số
chu kỳ PCR là 28 chu kỳ trên gel agarose
37
Hình 3.9
Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số
chu kỳ PCR là 30 chu kỳ trên gel agarose
37
Hình 3.10
Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số
chu kỳ PCR là 32 chu kỳ trên gel agarose
38
Hình 3.11
Đồ thị và hàm số mô tả sự phụ thuộc của đậm độ băng
sản phẩm và lượng ARN/cADN ban đầu
39
Hình 3.12
Sự biểu hiện gen của GAPDH ở các mẫu gan chuột
40
Hình 3.13
Sự biểu hiện gen của G6Pase ở các mẫu gan chuột
40
Hình 3.14
Sự biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm chuột
42
Sơ đồ 2.1
Nội dung nghiên cứu
23
Sơ đồ 2.2

Các bước tiến hành nghiên cứu
24

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cũng giống như carbohydrat và protein, ARN và ADN là những đại phân tử
quan trọng của cơ thể, trong đó ARN là một bản sao của ADN. Trong khi ADN
nắm giữ trình tự mã hóa các protein chỉ trong nằm ở trong nhân, thì ARN lại giúp
các thông tin di truyền này thể hiện ra ngoài thông qua quá trình phiên mã và dịch
mã [8]. Đây chính là quá trình biểu hiện gen. Nếu không có ARN thì những thông
tin trên ADN trở nên vô nghĩa, sẽ không bao giờ biết được đoạn gen nào có chức
năng gì. Số lượng gen là cố định và như nhau trong hầu hết tế bào, trong khi đó số
lượng ARN thì không như vậy. Trong mỗi loại tế bào chỉ có những ARN đặc trưng
cho tế bào đó được sao chép. Sự thay đổi số lượng và chất lượng ARN sẽ kéo theo
sự thay đổi số lượng và chất lượng protein [30, 49, 53]. Do đó những tác động làm
thay đổi ARN sẽ làm thay đổi mọi hoạt động của tế bào, suy rộng ra là hoạt động
của cơ thể [5]. Vì vậy những thay đổi dù là sinh lý hay bệnh lý đều có ý nghĩa quan
trọng đối với những nhà khoa học trong nghiên cứu cơ chế bệnh sinh ở mức độ
phân tử và từ đó tìm ra cơ chế cũng như đích tác dụng của thuốc.
Để có thể nghiên cứu được sự thay đổi, hay theo thuật ngữ chuyên ngành là
nghiên cứu biểu hiện gen, chúng ta cần có những công cụ đặc biệt. Trước hết là phải
lấy riêng được ARN ra khỏi tế bào, sau đó là sử dụng các phương pháp đặc hiệu để
phát hiện sự tăng hay giảm ARN đích như: Northern blot, vi mảng cADN, qRT-
PCR,…[60].
Trên thế giới các phương pháp tách chiết ARN và nghiên cứu biểu hiện gen
phát triển mạnh từ cách đây 30 năm [23].Kết quả của những công trình nghiên cứu
thuộc lĩnh vực này đã đóng góp nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực Y – Dược. Tại
Việt Nam, để bắt kịp với sự tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử thế giới, các
phòng nghiên cứu sinh học phân tử đã được thành lập, ví dụ như trường Đại học Y
– Dược thành phố Hồ Chí Minh đã có Trung tâm Y Sinh học phân tử. Tuy nhiên, tại

Trường Đại học Dược Hà Nội, những nghiên cứu trên phân tử ARN còn khá mới
mẻ, số lượng đề tài có liên quan đến lĩnh vực này còn hạn chế. Với mong muốn
nhằm góp phần đẩy mạnh những nghiên cứu ARN và biểu hiện gen ở trường Đại
2
học Dược Hà Nội, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu triển khai kỹ thuật tách
chiết ARN từ mô động vật và RT-PCR” với các mục tiêu sau:
1. Tách chiết được ARN từ mô động vật
2. Thực hiện RT-PCR từ ARN tách chiết được
3. Dùng RT-PCR để kiểm tra sơ bộ sự biểu hiện gen G6Pase trên mô hình
chuột gây đái tháo đường bằng STZ.




3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. ARN
ARN (acid ribonucleic) là chuỗi gồm các ribonucleotid được nối với nhau bởi
các liên kết phosphodieste. ARN cùng với ADN là một trong ba loại đại phân tử
thiết yếu cho cuộc sống. Các phân tử ARN đóng vai trò tích cực trong các tế bào
thông qua việc sao chép và lưu trữ thông tin từ ADN, tham gia và điều hòa quá trình
biểu hiện gen, sinh tổng hợp protein, qua đó kiểm soát hoạt động và giúp tế bào
hoàn thành chức năng của mình. ARN là phân tử duy nhất vừa có chức năng lưu trữ
và truyền đạt thông tin di truyền, vừa đóng vai trò như một chất xúc tác phản ứng.
1.1.1. Cấu trúc
1.1.1.1. Cấu trúc bậc 1
a) Ribonucleotid
Ribonucleotid là đơn vị cấu tạo của
phân tử ARN. Cấu tạo của các ribonucleotid
gồm 3 phần: base nitơ, đường pentose và

nhóm phosphat (Hình 1.1).
Trong đó, các base nitơ bao gồm:
Adenin (A), Guanin (G) là base purin;
Cytosin (C) và Uracil (U) là base pyrimidin.
Đường pentose là đường ribose ở dạng mạch vòng β-D-ribofuranose, được đánh số
từ 1’ đến 5’. Base nitơ liên kết với đường ribose tại vị trí 1’. Nhóm phosphat liên
kết tại vị trí 5’-OH của đường ribose [1, 2].
b) Liên kết phosphodieste
Các ribonucleotid liên kết với nhau thông qua cầu nối phosphodieste: nối đầu
5’-phosphat của nucleotid này với nhóm 3’-OH của nucleotid tiếp theo. Với kiểu
liên kết này, chuỗi ARN có 2 đầu: đầu 5’ có nhóm phosphat tự do và đầu 3’ có
4
nhóm -OH tự do. Trình tự các nucleotid trên
mạch đơn của phân tử ARN luôn được viết
theo chiều từ đầu 5’ đến 3’ (Hình 1.2).
Liên kết phosphodieste này dễ bị thủy
phân đặc biệt là khi có mặt của nhóm 2’-OH
như trong phân tử ARN [40].
1.1.1.2. Cấu trúc bậc 2
ARN tìm thấy trong tự nhiên thường tồn
tại ở dạng sợi đơn. Trong cùng một phân tử
ARN có sự tương tác với nhau, tạo nên sự đa
dạng cấu trúc bậc 2 của phân tử ARN.
Các ribonucleotid của hai phân tử hoặc
trên cùng một phân tử ARN tương tác với
nhau chủ yếu bằng liên kết hydro theo nguyên
tắc bổ sung tạo nên cấu trúc vòng hoặc cặp
tóc (Hình 1.3). Cấu trúc cặp tóc thường kết
thúc bằng chuỗi nucleotid đặc biệt (UUCG)
[13]. Đặc biệt, với ARN, A có thể liên kết với

G, do đó cấu trúc xoắn kép của ARN không
song song giống như trong cấu trúc ADN [6,
32, 36].
Chính sự đa dạng trong cấu trúc tạo nên
sự đa dạng trong chức năng của phân tử ARN.
1.1.2. Phân loại, chức năng
Trong số các hệ thống phân loại ARN hiện nay, hệ thống phân loại dựa vào
chức năng của ARN trong quá trình sinh tổng hợp protein là phổ biến nhất. Theo hệ
5
thống này ARN được phân thành 4 nhóm: ARN thông tin, ARN vận chuyển, ARN
ribosom và các ARN khác.
1.1.2.1. ARN thông tin (mARN)
ARN thông tin, chiếm 5% ARN tổng số, là ARN mang thông tin mã hóa
protein từ ADN ở trong nhân đến ribosom ngoài bào tương. Vì vậy, gen mã hóa
mARN chính là gen mã hóa protein.
Phân tử của mARN gồm: vùng mã hóa và vùng không mã hóa (Hình 1.4) [44].

Hình 1.4. Cấu tạo của phân tử mARN
- Vùng mã hóa chứa trình tự nucleotid mã hóa protein được sắp xếp thành các
codon hay còn gọi là bộ ba mã hóa. Mỗi codon gồm trình tự của 3 nucleotid mã hóa
cho 1 acid amin, trừ codon kết thúc.
- Vùng không mã hóa gồm: vùng không mã hóa 5’ (5’-UTR) và vùng không
mã hóa 3’ (3’-UTR). Các vùng này nằm ở phía trước và phía sau vùng mã hóa với
mục đích là bảo vệ vùng mã hóa và tham gia vào điều hóa quá trình sinh tổng hợp
protein.
Ngoài ra đầu 5’ của chuỗi có chứa nhóm 7-methylguanosin, đầu 3’ chứa đuôi
poly(A) cũng nhằm mục đích bảo vệ cấu trúc không gian của mARN [11, 44].
1.1.2.2. ARN vận chuyển (tARN)
ARN vận chuyển, chiếm khoảng 15% lượng ARN tổng số, là ARN chịu
trách nhiệm vận chuyển acid amin đến ribosom. Chuỗi tARN chứa 76 đến 90

nucleotid, tự xoắn tạo ra hình chạc ba (Hình 1.5).
Cấu trúc tARN gồm:
6
- Vùng tiếp nhận: gồm 7 đến 9 cặp nucleotid,
được tạo bởi đầu 5’ và 3’ của chuỗi nucleotid,
trong đó chuỗi cytosin-cytosin-adenosin ở đầu 3’
là nơi acid amin (phù hợp với anticodon) sẽ được
gắn vào.
- Cánh tay T gồm 4 đến 5 nucleotid, cánh tay
D gồm 4 đến 6 nucleotid, kết thúc bởi 1 vòng
chứa dihydrouridin.
- Cánh tay anticodon gồm 6 cặp nucleotid, trong đó vòng chứa anticodon – có
trình tự bổ sung với codon trên mARN.
tARN đọc thông tin trên chuỗi mARN bằng cách khớp trình tự anticodon của
nó với codon của mARN, vận chuyển acid amin phù hợp đến ribosom để tổng hợp
nên chuỗi polypeptid [9, 11].
1.1.2.3. ARN ribosom (rARN)
ARN ribosom là loại có số lượng lớn nhất trong tế bào, chiếm tới 80% lượng
ARN tổng số, với vai trò tham gia cấu trúc của ribosom – bộ máy tổng hợp protein.
rARN ở tế bào nhân thực gồm các loại 5S, 28S (cấu tạo tiểu phần lớn của ribosom)
và 18S (cấu tạo nên tiểu phần bé của ribosom).
Chức năng của rARN thể hiện thông qua chức năng của ribosom. Tiểu phần bé
của ribosom nhận biết mã mở đầu của mARN, sau đó liên kết với tiểu phần lớn,
đảm bảo mỗi codon bắt cặp chính xác với anticodon trên tARN. Tiểu phần lớn của
ribosom chứa vùng hoạt động của ribosom, hình thành liên kết peptid [40].
1.1.2.4. Các ARN khác:
a) ARN nhỏ ở nhân (small nuclear RNA – snARN )
ARN nhỏ ở nhân chứa 100 đến 200 nucleotid. Loại ARN này tham gia vào
phức hợp cắt (spliceosome) giúp loại bỏ các đoạn intron trên pre-mARN, biến pre-
mARN thành ARN trưởng thành [30, 63].

7
b) ARN nhỏ ở hạch nhân (small nucleolar ARN – snoARN)
ARN nhỏ ở hạch nhân có độ dài từ 60 đến 300 nucleotid. Gen mã hóa của
snoARN nằm ở trong đoạn intron của 1 số gen và được phiên mã cùng với các gen
này [18]. Chức năng của snoARN là tham gia vào quá trình hoàn thiện rARN [40].
c) ARN lớn không mã hóa (long noncoding RNA – lncARN)
ARN lớn không mã hóa có độ dài hơn 200 nucleotid. Đây là nhóm ARN
phong phú nhất nhưng lại được biểu hiện rất thấp. Cấu trúc của lncARN gồm 3
vùng: vùng liên kết protein, vùng liên kết ARN và vùng liên kết ADN [48, 54].
Chức năng của lncARN cũng rất phong phú và phức tạp: điều hòa quá trình
phiên mã gen, hậu phiên mã, và điều hòa các di truyền ngoài nhân [31, 48].
d) ARN siêu nhỏ (micro RNA – miARN)
ARN siêu nhỏ có kích thước khoảng 22 cặp nucleotid. Cấu trúc của miARN có
một vùng tương đồng với mARN đích, do đó nó có thể gắn với phân tử này, và làm
phân hủy hoặc ức chế quá trình dịch mã mARN đích đó. Chính vì vậy, ARN siêu
nhỏ có vai trò quan trọng trong điều hòa gen hậu phiên mã [50].
miARN được tổng hợp trong nhân nhờ ARN polymerase II và tồn tại ở dạng
cặp tóc. Khi ra ngoài tế bào, cặp tóc bị cắt bởi enzym Dicer và được enzym tháo
xoắn tạo thành miARN trưởng thành có hoạt tính [4].
e) ARN enzym
ARN enzym hay còn gọi là các ribozym, có kích thước từ 40 đến 400 nuleotid.
Đây là các ARN có khả năng xúc tác cho các phản ứng sinh học giống protein.
Cơ chất của các ribozym thường chính là các phân tử ARN. Với hai hoạt tính
cơ bản là chuyển vị este và thủy phân liên kết phosphodieste, các ribozym tham gia
xúc tác cho nhiều phản ứng quan trọng của ARN trong quá trình hoàn thiện hậu
phiên mã như: tạo miARN, quá trình tự cắt của 1 số đoạn intron. rARN cũng được
cho là 1 ribozym [22].
8
1.1.3. Quá trình sinh tổng hợp ARN
Trong tuyệt đại đa số các tế bào, ARN được tạo thành từ khuôn ADN thông

quá quá trình sinh tổng hợp ARN. Ở tế bào nhân thực, quá trình sinh tổng hợp phức
tạp hơn so với tế bào nhân sơ, mặc dù cơ chế phiên mã của chúng cơ bản là giống
nhau. Cụ thể, ở tế bào nhân thực có sự tham gia của 3 loại enzym ARN polymerase
khác nhau trong khi ở tế bào nhân sơ chỉ có 1 loại enzym ARN polymerase duy
nhất. Đặc biệt, thay vì enzym ARN polymerase liên kết trực tiếp với vị trí khởi đầu
trên mạch ADN như ở tế bào nhân sơ, thì ở tế bào nhân chuẩn, enzym này chỉ bám
vào vị trí khởi đầu phiên mã khi có sự tham gia của các yếu tố phiên mã [17].
Thành phần cơ bản cần có của quá trình sinh tổng hợp ARN ở tế bào nhân
thực bao gồm: Khuôn ADN, enzym ARN polymerase, các ribonucleosid
triphosphat và Mg
2+
, ngoài ra còn có các yếu tố phiên mã điều hòa quá trình này.
Quá trình sinh tổng hợp được bắt đầu bằng sự liên kết của phức hợp các yếu
tố phiên mã vào một trình tự đặc biệt nằm trước vị trí khởi đầu, tạo điều kiện cho
enzym ARN polymerase bám vào vị trí khởi đầu phiên mã và hoạt hóa enzym này.
Tại vị trí khởi đầu này này, các ADN xoắn kép được tháo xoắn bởi enzym helicase
tạo điều kiện để các ARN polymerase hoạt động. ARN polymerase ngay lập tức sẽ
kéo dài chuỗi mới bằng cách thêm ribonucleotid vào đầu 3’-OH theo nguyên tắc bổ
sung với sợi ADN khuôn mà không cần mồi. Nhóm 3’-OH hoạt động như một tác
nhân ái nhân, tấn công vào vị trí nhóm phosphat α của ribonucleosid triphosphat,
giải phóng ra pyrophosphat:
(NMP)n + NTP -> (NMP)n+1 -> PPi
Việc hình thành liên kết phosphodiester được xúc tác bởi 2 ion Mg
2+
: 1 ion
Mg
2+
sẽ tạo thuận lợi cho nhóm OH tấn công vào nhóm phosphat α của
ribonucleosid triphosphat, ion Mg
2+

còn lại liên kết với nhóm phosphat tiếp theo,
tạo điều kiện thuận lợi để giải phóng nhóm pyrophosphat.
Khi gặp trình tự kết thúc, ARN polymerase sẽ dừng lại, chuỗi ARN sau khi
tạo ra sẽ được loại bỏ các đoạn intron hoặc gắn thêm các nhóm bảo vệ, hoàn thiện
9
để tạo nên ARN trưởng thành [40].
ARN polymerase chỉ kéo dài chuỗi ARN theo hướng 5’->3’, do đó nó chỉ
hoạt động trên 1 mạch 3’-5’ ADN trong ADN sợi kép, hay còn gọi là mạch khuôn.
Ở tế bào nhân thực có 3 loại ARN polymerase: I, II, III.
- ARN polymerase I chịu trách nhiệm tổng hợp các rARN 18S, 28S [29].
- ARN polymerase II chịu trách nhiệm tổng hợp các mARN, miARN và một
số ARN khác. Đây là enzym được nghiên cứu nhiều nhất vì nó trực tiếp liên quan
đến quá trình biểu hiện gen [10, 39, 44].
- ARN polymerase III chịu trách nhiệm tổng hợp các tARN, rARN 5S và 1 số
loại ARN đặc biệt khác [73].
ARN polymerase không có khả năng đọc và sửa sai, vì thế mà sai sót trong
quá trình tổng hợp ARN nhiều hơn so với quá trình sao chép ADN.
1.1.4. Quá trình phiên mã ngƣợc
Quá trình phiên mã ngược là quá trình tổng hợp ADN dựa trên khuôn ARN
nhờ enzym reverse transcriptase. Quá trình này diễn ra ở các hạt virus có vật chất di
truyền là ARN (retrovirus) (Hình 1.6) [44].
Enzym reverse transcriptase có 3 hoạt tính: Tổng hợp ADN dựa mạch khuôn
ARN; phân hủy ARN; tổng hợp ADN dựa vào mạch khuôn ADN. 3 hoạt tính này
do 3 trung tâm hoạt động nằm ở 3 vị trí khác nhau
trên phân tử enzym đảm nhiệm. Để xúc tác được
cho phản ứng tổng hợp ADN, reverse transcriptase
cần có mồi. Mồi chính là tARN của vật chủ. Mồi
này liên kết bổ sung với vị trí gắn mồi của mạch
ARN. Khi chuỗi ADN mới được hình thành, chuỗi
ARN sẽ bị ribonuclease H phân hủy. Sau khi hoàn

thành mạch ADN thứ nhất, mạch ADN thứ 2 sẽ
được tổng hợp nhờ hoạt tính tổng hợp ADN dựa
vào mạch khuôn ADN.
10
Enzym reverse transcriptase không có hoạt tính sửa sai 3’-5’, vì vậy tỷ lệ đột
biến diễn ra ở retrovirus là khá cao và nhanh (1/20000 nucleotid).
1.2. Kỹ thuật tách chiết ARN
Thế giới về ARN rất đa dạng và cung cấp nhiều thông tin về các quá trình sinh
tổng hợp cũng như hoạt động của tế bào, chính vì thế cùng với sự phát triển không
ngừng của cơ sở dữ liệu ARN, các kỹ thuật tách ARN cũng đạt được hiệu quả ngày
càng cao về chất lượng và số lượng ARN cũng như thời gian tách chiết.
1.2.1. Yêu cầu chung của các phƣơng pháp tách chiết ARN
Bất cứ một phương pháp tách chiết ARN nào cũng phải đối mặt với các khó
khăn sau: (1) Lượng ARN trong tế bào rất ít, trong tế bào còn chứa nhiều hợp chất
khác với hàm lượng lớn hơn như: protein, carbohydrat, lipid,…; (2) ADN và ARN
đều là acid nucleic, có tính chất khá giống nhau, ARN tách ra có thể lẫn ADN; (3)
ARN nằm trong phức hợp với protein (được gọi là nucleoprotein); (4) đặc biệt ARN
dễ bị phân hủy bởi cấu trúc không bền của nó và dễ bị phá hủy bởi các enzym
RNase nội và ngoại sinh [20, 70].
Một phương pháp tách chiết ARN hiệu quả phải đạt được các tiêu chí sau:
- Phá vỡ tế bào hoàn toàn
- Thoái hóa các phức hợp nucleoprotein
- Ức chế hoạt động của các RNase
- Không bị nhiễm protein, carbohydrat, lipid, ADN
Để làm được điều này, các phương pháp tách ARN được trình bày ở mục 1.2.2
dưới đây đều có những cách riêng để đạt được ARN với chất lượng và số lượng
mong muốn [15]. Tuy nhiên quy trình chung của các phương pháp tách chiết này
đều trải qua các bước sau:
- Phá vỡ tế bào [20]:
 Sử dụng lực cơ học để đồng nhất mô hay để phá vỡ tế bào: (1) Dùng chày

cối; (2) Máy nghiền đồng thể
11
 Sử dụng các enzym như lysozym, zymolase, hoặc lysostaphin để phá bỏ lớp
thành tế bào
 Sử dụng các đệm ly giải
- Thoái hóa và loại bỏ protein, tách ADN ra khỏi ARN: Tùy thuộc đặc điểm
các mẫu cần tách ARN và đặc điểm acid nucleic để lựa chọn các vật liệu cũng như
phương pháp cho phù hợp. Các vật liệu sử dụng trong bước này là cơ sở để phân
loại các phương pháp tách chiết ARN.
- Tập trung hay tủa ARN, có thể sử dụng các hóa chất:
 Isopropanol: Cần ít thể tích hơn, thời gian tủa nhanh hơn so với ethanol
[26].
 Lithium chlorid: LiCl chỉ làm tủa ARN mà không kết tủa ADN, nhưng nếu
mục đích là ARN nhỏ thì không hiệu quả [72, 78].
 Ethanol 75%: Cần 1 thể tích gấp đôi, và phải làm lạnh, thời gian tủa ARN
lâu hơn so với sử dụng isopropanol. Tuy nhiên ưu điểm của Ethanol là khả năng bay
hơi, do đó ethanol được sử dụng để rửa tủa ARN [72].
- Xác định nồng độ và kiểm tra sự nguyên vẹn của phân tử ARN.
1.2.2. Các phƣơng pháp tách chiết ARN
Một cách tổng quát, dựa vào thể chất vật liệu tách ARN, có thể chia các
phương pháp tách chiết ARN làm 2 nhóm.
- Sử dụng các dung dịch tách chiết
- Sử dụng các vật liệu rắn
1.2.2.1. Các phương pháp sử dụng các dung dịch tách chiết:
Các phương pháp này sử dụng dung dịch hóa chất để tách ARN khỏi tế bào.
Quy trình tách chiết được thực hiện như quy trình chung đã trình bày ở mục 1.2.1.
Các hóa chất được sử dụng ở bước “Thoái hóa và loại bỏ protein, tách ADN ra khỏi
ARN” là cơ sở để phân loại phương pháp tách chiết, có thể kể đến như [15]:
- Guadinin thiocyanat – phenol – chloroform
12

- Dung dịch ly giải alkalin
- CTAB (Cetyltrimethylammonium bromid)
- Cesium chlorid (CsCl)- Ethidiumbromid (EtBr)
1.2.2.2. Các phương pháp sử dụng vật liệu rắn
Các phương pháp này được thực hiện trên cột. Ngoài các bước như quy trình
chung, các phương pháp sử dụng vật liệu rắn còn bao gồm thêm các bước sau:
- Hoạt hóa vật liệu trên cột bằng sử dụng dung dịch đệm với pH khác nhau
làm chuyển bề mặt rắn hoặc các nhóm chức năng sang dạng hoạt động.
- Cho mẫu sau khi đã ly giải tế bào lên cột đã được hoạt hóa, ARN sẽ được giữ
lại trên cột trong khi các tạp chất khác sẽ bị rửa trôi.
- Rửa giải cột bằng nước hoặc đệm TE, giải phóng ARN
Có nhiều loại vật liệu rắn được sử dụng cho tách ARN, trong đó có 3 vật liệu
phổ biến được sử dụng: cột oligo(dT)-cellulose, bột thủy tinh, cột hấp thụ từ tính
oligo (dT) [20, 64, 70].
1.2.3. Các thông số đánh giá chất lƣợng và số lƣợng ARN
1.2.3.1. Nồng độ ARN
Nồng độ của ARN có thể được xác định bằng cách đo mật độ quang ở 260
nm (OD
260
) do các đơn phân nucleotid có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng
này. Để đảm bảo ý nghĩa, mật độ quang phải nằm trong khoảng từ 0,2 – 0,8.
Cần chú ý là khi đo mẫu ARN phải chắc chắn rằng cuvette không bị nhiễm
RNase, đặc biệt là khi muốn sử dụng lại ARN sau khi đo quang [45].
1.2.3.2. Độ tinh sạch của ARN
Quá trình tách chiết ARN sử dụng các thuốc thử hữu cơ, những hợp chất này
đều hấp thụ quang, trong đó, phenol có bước sóng cực đại là 270-275 nm, guanidin
isothiocyanat có bước sóng cực đại là 230 nm. Ngoài ra, các acid amin của protein
cũng có bước sóng cực đại là 280. Để đánh giá độ tinh sạch của ARN, người ta so
13
sánh tỷ lệ OD

260
/OD
280
và OD
260
/OD
230
[22, 33].
1.2.3.3. Sự nguyên vẹn của phân tử ARN
Sự nguyên vẹn ARN có thể được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose
1,2%. ARN tổng số không bị phân hủy cho hai vạch sắc nét của hai ARN ribosome
28S và 18S ở một tỷ lệ xấp xỉ 2:1 khi nhuộm với ethidium bromid. Nguyên nhân
thường gặp nhất dẫn đến sự thoái hóa ARN có thể là do nhiễm RNase trong dung
dịch ARN lưu trữ, cũng có thể do ARN bị phân hủy trong lúc điện di.
1.3. Phƣơng pháp RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) là một trong nhiều
biến thể của phản ứng khuếch đại ADN (PCR). Phản ứng này gồm có 2 giai đoạn:
chuyển ARN thành cADN bằng phản ứng RT và khuếch đại cADN bằng phản ứng
PCR.
1.3.1. Phản ứng RT (Reverse transcription)
1.3.1.1. Cơ sở lý thuyết
Nguyên tắc phản ứng RT là từ mạch ARN khuôn, với sự có mặt của mồi,
deoxynucleosid triphosphat (dNTP), các ion Mg
2+
, enzym reverse transcriptase,
cADN sẽ được tạo thành trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (hình 1.7).
1.3.1.2. Các thành phần
- Khuôn ARN: ARN được tách chiết từ các mô động thực vật, tế bào nuôi cấy,
vi sinh vật hoặc virus đều có thể sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cADN.
Khuôn có thể giàu GC, hoặc giàu cấu trúc bậc 2. Để làm biến tính ARN, giảm cấu

trúc bậc 2, tạo thuận lợi cho mồi bắt cặp vào khuôn và sự hoạt động enzym, mồi và
khuôn sẽ được ủ ở 65
o
C trước khi xảy ra phản ứng.
14
- Enzym reverse transcriptase: Hiện nay, có 2 loại enzym reverse transcriptase
và các biến thể của chúng được thương mại hóa, để sử dụng cho phản ứng RT trong
ống nghiệm. Hai enzym này có nguồn gốc từ hai loại retrovirus: Moloney murine
leukemia virus (MMLV-RT), và Avian
myeoblastosis virus (AMV-RT) [76].
- Mồi: Enzym reverse transcriptase
hoạt động cần có mồi. Có 3 loại mồi
thường được sử dụng trong phản ứng
phiên mã ngược: Oligo (dT), mồi ngẫu
nhiên và mồi đặc hiệu [34].
 Oligo deoxyThymin (dT): oligo
d(T) bắt cặp với chuỗi polyA ở đầu 3’
của mARN
 Mồi ngẫu nhiên: là các đoạn oligonucleotid ngắn (hexame, oxame…), các
mồi này sẽ liên kết với mARN theo nguyên tắc bổ sung với một vị trí bất kỳ phù
hợp trên toàn bộ chuỗi ARN, do đó khả năng toàn bộ mARN được phiên mã ngược
cao hơn so với oligo d(T).
 Mồi đặc hiệu: là đoạn mồi có trình tự đặc hiệu cho ARN mục tiêu, chỉ sao
chép lại ARN mục tiêu.
Ngoài ra còn có các ion kim loại như Mg
2+
, Zn
2+
tham gia nhằm xúc tác cho
các phản ứng xảy ra dễ dàng và nhanh hơn [40].

1.3.2. Kỹ thuật PCR
1.3.2.1. Cơ sở lý thuyết
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, nhằm khuếch đại một
đoạn ADN thành nhiều bản sao bằng các chu trình nhiệt. Phản ứng này được nhà
khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985.
Các máy tạo chu kỳ nhiệt được lập trình để tăng, giảm nhiệt độ tự động. Ban
15
đầu, hỗn hợp phản ứng được đun nóng để tách ADN sợi đôi thành hai sợi đơn. Sau
đó, hạ nhiệt độ xuống để mồi bắt cặp khuôn. Tiếp theo, đưa nhiệt độ lên nhiệt độ
phản ứng tối ưu, ADN polymerase bắt đầu tổng hợp sợi ADN mới từ điểm mồi bắt
cặp trên khuôn. Kết quả vào cuối mỗi chu kỳ, mỗi phân tử ADN sợi kép bao gồm
sợi ADN cũ và sợi ADN mới. Các ADN mới tổng hợp là khuôn cho các chu kỳ sau,
cho phép khuếch đại các ADN đích lên gấp hàng triệu lần (Hình 1.8) [61].

Hình 1.8. Nguyên lý của kỹ thuật PCR
1.3.2.2. Các thành phần
- Khuôn ADN: Có thể là ADN được tách chiết từ mô động thực vật, tế bào
nuôi cấy, vi sinh vật, hoặc là đoạn cADN được tổng hợp từ quá trình phiên mã
ngược, tùy vào mục đích nghiên cứu.
- Mồi: là yếu tố quan trọng, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng: Đoạn
ADN đích được khuếch đại bằng mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn ADN ngắn, nhân
tạo, không quá 50 (thường 18-25) nucleotid, có trình tự phù hợp với điểm bắt đầu
và kết thúc của đoạn ADN cần khuếch đại. Nó gắn chặt với ADN khuôn ở những
điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà ADN polymerase sẽ gắn vào và bắt đầu quá trình
tổng hợp của sợi ADN mới.
Nhiệt độ biến tính (Tm) của mồi được định nghĩa là nhiệt độ mà dưới nhiệt
độ đó mồi có thể bám vào ADN mẫu và trên nhiệt độ đó mồi tách ra khỏi ADN
mẫu. Nhiệt độ biến tính của mồi phụ thuộc vào chiều dài, tỷ lệ GC, cấu trúc của