Nghiên cứu qui trình chiết tách (±) gossypol từ hạt cây bông gossypium hirsutum

Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược - HÀ NỘI
_
_____
*****
_____
_
HOÀNG NGUYÊN THÙY
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHIẾT TÁCH
(±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG
GOSSYPIUM HỈRSUTUM
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ
Người hướng dẫn;
1. TSTĐào Thanh Hiền
2. TS. Nguyễn Văn Tài
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền
2. Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu
Thời gian thực hiện : 10/2010 - 05/2011
HÀ NỘI-2011
t r iíủ n í; đh d u ík: hà nôi
T H Ư V IỆ Ì^ẳ
Nqày .,A

ínáng 0: năm 2Q.A-Ĩ
So ĐKCB:. . . J
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới:

TS. Đào Thanh Hiền - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền,
Trường ĐH Dược Hà Nội.
TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược
liệu.
TS. Nguyễn Thế Hùng - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền,
Trường ĐH Dược Hà Nội.
Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình làm khóa luận.
Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Khoa Hóa thực
vật, Viện Dược liệu đã luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo
trong trường, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong
học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể
tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý báu của các thầy
cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên
Hoàng Nguyên Thùy
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum 3
1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol
3
1.3. Tác dụng dược lý của gossypol 5
1.3.1. Tác dụng chống ung thư 5
1.3.2. Tác dụng tránh thai nam 8

1.3.3. Tác dụng khác 9
1.4. Một số qui trình chiết tách gossypol 10
1.4.1. Phương pháp 1 10
1.4.2. Phương pháp 2 11
1.4.3. Phương pháp 3 12
1.4.4. Phương pháp 4 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

16
2.1. Vật liệu nghiên cứu 16
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất 16
2.1.2. Máy móc và dụng cụ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol

17
2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất

17
2.3.1.2. Phương pháp tinh chế gossypol

18
2.3.2. Phương pháp kiểm tra cấu trúc và xác định hàm lượng G-AA có trong
sản phẩm tách được 18
2.3.2.1. Định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp sắc ký lóp
mỏng 18
2.3.2.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV- VIS) 19
2.3.2.3. Nhận dạng gossypol tách được

19
2.3.2.4. Định lượng gossypol có trong sản phẩm thu được

19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Kết quả thực nghiệm 21
3.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu 21
3.1.2. Chiết gossypol racemic
21
3.1.3. Kết tinh gossypol acid acetic 23
3.1.4. Kiểm tra cấu trúc chất tách được 25
3.1.5. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm thu được

26
3.1.6 . Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong qui trình chiết xuất

28
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp dung môi aceton/nước.28
3.1.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết

30
3.1.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân

32
3.1.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid H3PO4 dùng thủy phân33
3.1.7. Tóm lại 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XƯÁT 38
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẶN VĂN
DCM:
Dichlo methan

DEE: Diethyl ether
EtOH:
Ethanol
G-AA:
Gossypol acid acetic
IR:
Phổ hồng ngoại
MEK:
Methyl ethyl keton
SKLM:
Sắc kí lóp mỏng
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Trang
Bảng 3.1 : Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ acetone/ nước 29
Bảng 3.2- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết 31
Bảng 3.3- Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân 32
Bảng 3.4- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid và thời gian thủy phân 34
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ sơ ĐÒ TRONG LUẬN VÃN
Trang
Hình L l: Gossypol và các dạng đông phân quang học
Hình 3.1: SKLM của cao chiết so sánh với gossypol đổi chiếu
(l):Gossypol đổi chiếu; (2): Cao chiết
Hình 3.2: SKLM của sản phẩm chiết tách được so sánh với gossypol
đổi chiếu ' 25
(1). Gossypol đổi chiểu; (3): G-AA thu được
Hình 3.3: Phổ u v của sản phẩm G-AA thu được
Hình 3.4: Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp u v
Hình 3.5: SKLM của sản phẩm chiết được mẻ lớn so sánh với
gossypol đẻi chiếu
(1). Gossypol đổi chiếu; (4). G-AA thu được

Sơ đồ 3.1: Chỉêt xuất và tinh chế G-AA
26
27
37
23
- 1 -
ĐẶT VẤN ĐÈ
Ung thư là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay
trên thế giới. Theo thống kê của Bộ Y tế, ước tính mỗi năm ở nước ta có
khoảng 150.000 bệnh nhân ung thư mới mắc và 75.000 người tử vong do ung
thư. Con số này có xu hướng ngày càng gia tăng [43]. Phưong pháp chủ yếu
điều trị ung thư là dùng các liệu pháp hoá trị, xạ trị. Tuy nhiên, hóa trị và xạ
trị lại làm suy giảm miễn dịch và ảnh hưởng đến các tế bào bình thưòng khác
làm cho sức khỏe bệnh nhân dần dần kiệt quệ.
Hiện nay, hướng đi mới trong điều trị ung thư là các thuốc điều trị ung
thư theo hướng đích, không chỉ cho hiệu quả hơn các thuốc hóa trị truyền
thống mà còn ít gây độc với các tế bào bình thường. Trong liệu pháp mới này
có thể kể đến các kháng thể đon dòng, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi
khối u, các chất chống proteasome, các chất ức chế Bcl-2 (họ protein gây cái
chết theo chưong trình của tế bào) như genasense, gossypol
Gossypol là một hợp chất polyphenol có nhiều trong hạt của các loài
thuộc chi Gossypỉum, họ Bông {Malvaceae). Gossypol được chứng minh là có
nhiều tác dụng sinh học, trong đó tác dụng gây độc tế bào của nó đã được biết
đến từ lâu [13]. Tuy nhiên, gần đây, các nhà khoa học mới phát hiện gossypol
có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Từ đó, gossypol
được kì vọng trở thành một thuốc chống ung thư theo hướng đích mới.
ở Việt Nam, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến để
lấy xơ, diện tích ước tính đạt 8.500 ha. Đây là một nguồn nguyên liệu sẵn có
và vô cùng phong phú cho việc sản xuất gossypol. Điều này mở ra hy vọng
Việt Nam có thể tự sản xuất được một loại thuốc điều trị ung thư bắt kịp xu

hướng điều trị mới với giá thành rẻ, phù hợp với khả năng kinh tế của người
dân.
- 2 -
Từ năm 1997 đến nay, ở nước ta đã có 2 tác giả nghiên cứu về chiết
xuất và tinh chế gossypol. Tuy nhiên phương pháp mà 2 tác giả này đưa ra
còn có nhiều nhược điểm, hiệu suất chưa cao và qui trình chưa phù hợp để áp
dụng vào sản xuất qui mô lớn.
Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“NGHIÊN CÚXJ QUI TRÌNH CHIÉT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY
BÔNG GOSSYPIUMHIRSUTUM'
Mục tiêu của đề tài:
- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế (±) gossypol từ hạt
cây bông Gossypỉum hirsutum.
- Khảo sát một số điều kiện trong qui trình chiết xuất, từ đó tìm ra qui
trình có hiệu suất cao, góp phần áp dụng vào qui mô sản xuất lớn.
- 3 -
CHƯOÍNG 1. TỎNG QUAN
1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum
Gossypol là một hơp chất polyphenol màu vàng, được chiết xuất từ cây
bông {Gossypỉum sp.) và 1 loài cây nhiệt đới Thepesia populnea, đều thuộc họ
bông Malvaceae [21, 24'.
Gossypol tồn tại trong nhiều bộ phận của cây như vỏ rễ, lá, hoa, vỏ
hạt Hạt bông chứa 16-24% protein và 13-24% dầu trong tổng khối lượng
nhân hạt. Ngoài ra còn có các flavonoid và các chất mầu mà chủ yếu là
gossypol. Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất màu
bên trong nhân, chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, và thưÒTig chiếm
khoảng 0,4- 1,7% khối lượng của nhân hạt [18]. ở Việt Nam có 5 loài thuộc
chi Bông (Gossypium) là G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum, G.
herbaceum và G. acuminatum [1]. Trong đó, G. hỉrsutum là một loài phổ biến.
Cùng với các hợp chất sesquiterpen trong tuyến sắc tổ, chức năng tự nhiên của

gossypol là một chất trừ sâu (kháng khuẩn) thiên nhiên giúp cây trồng kháng
lại các mầm bệnh và côn trùng.
1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol
Gossypol được phân lập lần đầu tiên năm 1886 dưới dạng hỗn hợp với
các sắc tố, acid béo và phospholipid trong suốt quá trình tinh chế dầu hạt
bông. Đến năm 1938, cấu trúc của gossypol mới được suy luận dựa vào các
tính chất vật lý và hóa học của nó. Tên gọi “gossypol” được dùng để ám chỉ
xuất xứ từ cây bông và là một hợp chất phenol thiên nhiên, cấu trúc hóa học
đã được chứng minh bởi Eward, người đã tổng hợp ra phân tử và chứng minh
được nó có cấu trúc là l,r,6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-
dimethyl-2 ,2 '-binaphthalen-8 ,8 '-dicarboxaldehyd [10]. cấu tạo của gossypol
- 4 -
gồm 2 khung naphthalen đối xứng, mỗi khung chứa 3 nhóm -OH và 1 nhóm -
CHO. Hai nhóm -OH ở vị trí 1- 1’ hoạt động hon 4 nhóm -OH còn lại, do
chúng ở gần 2 nhóm aldehyd ở vị trí 8- 8 ’. Hai nhóm aldehyd này cũng góp
phần lớn vào hóa tính đặc biệt của phân tử gossypol, nó đóng vai trò trong
việc tạo nên các dạng hỗ biến của gossypol, và được cho rằng là nhóm chức
đóng vai trò quan trọng tạo nên độc tính của gossypol [4]. Nhờ đó gossypol dễ
dàng chuyển hóa thành 3 dạng đồng phân tautomeric khác nhau là: aldehyd,
ketone, và hemiacetal trong các dung môi khác nhau. Nhóm aldehyd tự do này
cũng dễ dàng phản ứng với các amin tạo thành dẫn xuất base Schiff, do đó
trong tự nhiên gossypol chủ yếu tồn tại dưới dạng base Schiff với các nhóm
amino của protein.
HO CHO OHC OH
)f=Ầ OH HO
/ ĩõ\ ỉ X
.
/ ĩ i \
—{ \4 ìj y
ếằ& m

FoTTTiụ]a:
MW: m3
(’ Ị“CífâKvpỉ>ỉ
P“Fí)rm
IS
HO CHO
}i -> si
IM
_
>
Hình 1.1: Gossypol và các dạng đông phân quang học
- 5 -
Gossypol tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học là (+)-gossypol và (-
)-gossypol. Trong hạt cây bông đều có tồn tại cả hai dạng đồng phân này, tuy
nhiên tỉ lệ của chúng ở các loài và các giống khác nhau là khác nhau. Hai
dạng đồng phân này cũng thể hiện các tác dụng dược lý khác nhau, trong đó
(-)-gossypol được chứng minh là có hiệu quả hơn.
Do các nhóm -OH và -CHO hoạt hóa nên gossypol dễ bị oxy hóa, đặc
biệt khi có các tác nhân là ánh sáng, nhiệt độ cao và oxy không khí. Gossypol
dễ bị oxy hóa trong dung dịch kiềm, có màu đỏ sáng với dung dịch H2SO4
đậm đặc, và màu xanh đậm trong dung dịch FeCls.
Do trong cấu trúc có chứa nhiều nhóm phân cực (6 nhóm -OH và 2
nhóm -CHO) nên gossypol tan trong nhiều dung môi hữu cơ phân cực như
methanol, ethanol, butanol, diethyl ether, aceton, chloroform, dichlo methan,
ethyl acetat Gossypol it tan trong hexan, ether dầu (30°C- 60°C) v à do CÓ 2
nhóm dialkylnaphthalen nên nó không tan trong nước.
Điểm chảy của tinh thể gossypol tinh sạch phụ thuộc vào dung môi
dùng để kết tinh nó. Gossypol kết tinh trong diethyl ether có điểm chảy là
184°c, kết tinh trong chloroform có điểm chảy là I9 9 V , kết tinh trong ligroin
có điểm chảy là 214°c [20^.

1.3. Tác dụng dược lý của gossypol
1.3.1. Tác dụng chống ung thư
Tác dụng chống ung thư của gossypol được phát hiện đã tạo ra một sự
thay đổi cơ bản trong nhận thức của các nhà khoa học. Gossypol không còn bị
coi là một họp chất bất lợi có trong hạt bông, mà là một hợp chất tự nhiên có
các tính chất dược lý và hóa học có giá trị khai thác.
Có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư ỉn vitro của gossypol
trên nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau như ung thư buồng trứng, ung
- 6 -
thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyến thượng thận, ung thư cổ tử cung, ung thư tế
bào phổi nhỏ [11, 34, 36, 39].
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng đồng phân (-) có hiệu lực mạnh
hơn trên hầu hết các hệ thống sinh học khi so sánh với đồng phân (+) và hỗn
hợp racemic. Nguyên nhân là đồng phân (-) ở nồng độ thấp ảnh hưởng đến
quá trình biệt hóa tế bào, điều này không thấy ở (+)-gossypol và nồng độ cao
của (-)-gossypol [2 2 ].
(-)-Gossypol có tác dụng gây độc tế bào mạnh hơn so với hỗn họp
racemic và (+)-gossypol. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol gây độc tế bào
mạnh hơn 2- 14 lần so với (+)-gossypol trên tất cả các dòng tế bào ung thư
'5]. Tác dụng gây độc tế bào của gossypol cũng đã được quan sát trên các tế
bào kháng lại adriamycin, vinblastin, và cisplatin [22]. Các nghiên cứu so
sánh cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính chống ung thư mạnh hơn cisplatin,
melphalan và dacarbazin trên 2 dòng ung thư sắc tố, cispaltin và daunorubicin
trên dòng ung thư phổi, và mạnh hơn hydroxyure và busphalan trên một số
dòng ung thư máu [35]. Một số dẫn chất của gossypol cũng được tổng họp và
so sánh với gossypol về tác dụng gây độc tế bào. Dan xuất base Schiff của (-)-
gossypol với L- phenylalanin methyl ester được chứng minh là có hoạt tính
mạnh hơn (-)-gossypol trên các dòng tế bào ung thư sắc tố ác tính (SK- MEL-
19), ung thư cổ tử cung (Sihas), ung thư tế bào phổi nhỏ (H69) và ung thư
bạch cầu nguyên bào tủy (K562) [34'.

Nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng gây độc tế bào của gossypol đã
được thực hiện. Nghiên cứu lâm sàng pha 1 trên 34 bệnh nhân ung thư đã
kháng thuốc ở nhiều type khác nhau, dùng theo đưòng uống gossypol racemic
30-180 mg/tuần; kết quả cho thấy có hiệu quả lâm sàng tối thiểu nhưng không
có bằng chứng của ức chế tủy xương [36]. Trong thử nghiệm với 21 bệnh
nhân ung thư tuyến thượng thận di căn, cho uống gossypol với liều 30- 70
- 7 -
mg/ngày, cho thấy đã có dung nạp tốt với chỉ một tác dụng phụ nguy hiểm
nhất là tắc ruột [11]. Nghiên cứu trên bệnh nhân u thần kinh đệm ác tính tái
phát, cho uống gossypol 20 mg/ngày, kết quả là đã có sự dung nạp, tỉ lệ đáp
ứng tuy thấp nhưng có thể đo được [7]. Nghiên cứu trên 20 bệnh nhân nữ ung
thư vú di căn đã kháng, các thử nghiệm lâm sàng pha I/ II bao gồm cho uống
gossypol 30-50 mg/ngày , kết quả cho thấy sự đáp ứng không đáng kể ở một
bệnh nhân, có độ ổn định bệnh với sự giảm trên 50% các maker ung thư ở 2
bệnh nhân [39].
Nghiên cứu về cơ chế tác dụng chống ung thư của gossypol đã đưa ra
nhiều giả thuyết. Nghiên cứu của Floridi và cộng sự năm 1983 chỉ ra rằng sự
gián đoạn của quá trình chuyển hóa năng lượng có thể là cơ chế mà gossypol
ảnh hưởng đến các tế bào phân chia nhanh với yêu cầu chuyển hóa cao, thay
vì thông qua tác động trực tiếp đến sự nhân đôi của ADN [13]. Các nghiên
cứu khác trên nhiều dòng tế bào ung thư đã quan sát được tác dụng ức chế của
gossypol trên các enzyme liên quan đến sự tổng họp và sửa chữa ADN, đặc
biệt là ADN- polymerase, nucleotide reductase và ADN potoisomerase [3, 26,
33], và trên các enzyme giúp các dòng tế bào này chống lại việc bị phá hủy
bởi sự oxy hóa [14’.
Gossypol ức chế một số enzym, có thể là kết quả của sự hình thành base
Schiff thông qua phản ứng của nhóm aldehyd của gossypol với nhóm amin
của lysin có trong các enzym, thông qua liên kết hydro hình thành với
catechol hydroxyl. Gossypol ức chế các loại khác nhau của NAD(P) liên kết-
enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa và NAD(P)H liên kết- enzym xúc tác

cho sự khử, quá trình tạo thành năng lượng cho tế bào, ví dụ con đưòng đường
phân, chu trình Kreb xảy ra trong ty thể, và chuỗi vận chuyển electron xảy ra
bên trong màng ty thể [6 ]. Các enzym dehydrogenase trong bào tương và
trong ty thể đều bị ức chế bởi gossypol [15, 38'.
- 8 -
Nghiên cứu của Flack và cộng sự năm 1993 đưa ra giả thuyết gossypol
ức chế nitơ oxyd, do đó gây ra sự co mạch và làm giảm dòng máu đến mô và
tế bào ung thư [12].
Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học gần đây đã
phát hiện ra tác dụng gây độc tế bào của gossypol có liên quan đến các protein
Bcl-2. Đây là một họ protein có vai trò kiểm soát cái chết theo chương trình
của tế bào (apoptosis) theo con đường ty thể [41]. Sự biểu hiện quá mức của
các protein này, chủ yếu là Bcl-2 và Bc1-Xl, ngăn cản apoptosis thông qua con
đường ty thể, thường được thấy trong các dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc.
Gossypol có hoạt động như một chất bắt chước domain BH
3, liên kết với các
domain BH3 của các protein anti-apoptosis, phát động quá trình apoptosis
[17]. (-)-Gossypol làm giảm biểu hiện của Bcl-2, Bc1-Xl và Mcl-1 trên dòng tế
bào ung thư bàng quang đã kháng thuốc (ƯM-UC9), và do đó làm cho các
dòng tế bào ung thư bàng quang đã kháng với các thuốc hóa trị liệu như
carboplatin, gemcitabin, và paclitaxel trở nên nhạy cảm trở lại [23’.
Tóm lại, gossypol được hứa hẹn như là một trong những họp chất đi
đầu trong nhóm các thuốc chống ung thư mới, đặc biệt để chống lại tính
kháng với liệu pháp hóa học và xạ trị của các tế bào ung thư.
1.3.2. Tác dụng tránh thai nam
Vào năm 1978, một thử nghiệm lâm sàng với qui mô lớn tại Trung
Quốc trên 10.000 nam giới tình nguyện khỏe mạnh, họ được uống gossypol
20mg/ngày trong vòng 75 ngày (liều tấn công), và 50mg/tuần (liều duy trì).
Tương đối ít các tác dụng phụ quan sát được, 0,75% số người phát triển
nghiêm trọng chứng hạ kali máu, và có 10% số người uống gossypol trên 1

năm không hồi phục được quá trình sinh tinh trùng. Một cuộc nghiên cứu
mang tính quốc tế bao gồm 151 người Brazil, Nigeria, Kenya và Trung Quốc
- 9 -
được uống gossypol 15 mg/ ngày trong 12 đến 16 tuần, sau đó duy trì liều 7,5
hoặc 10 mg/ ngày trong 40 tuần. Không có ai trong số những người tham gia
phải ngừng gossypol do hạ kali máu, và sự sinh tinh trùng phục hồi ngay sau
khi ngừng gossypol [8’.
Tác dụng tránh thai nam của gossypol được cho là do sự ức chế LDH-
C4 của ty thể (LDH-X), enzym mà chỉ có ở tinh hoàn, tinh trùng và là thiết
yếu cho sự sản xuất năng lượng, (-)-gossypol chống lại sự phát triển của tinh
trùng in vivo, lí do là sự liên kết của gossypol với hàng rào máu- ống sinh tinh
bằng cơ chế tạo phức hợp albumin- gossypol [42].
Cơ chế của tác dụng tránh thai nam cũng đồng thời do ức chế nhiều hệ
enzym khác, ví dụ ribonucleotide reductase [26], malate dehydrogenase
(MDH), glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase (GA3PDH), protein
kinase c (PKC), và cytoplasmic phospholipase A2 (cPLA2) [37]. Enzym cuối
cùng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử cực đầu của tinh trùng trong
sự trưởng thành của tinh trùng.
Một cơ chế khác là gossypol ức chế mạnh các enzyme hủy đầu tinh
trùng như acrosin, azocoll proteinase, arylsulfatase, neuraminidase, và
hyaluronidase. Vai trò của các enzyme này là phá vỡ màng ngoài của trứng,
nhờ đó tinh trùng có thể thâm nhập vào trứng để thụ tinh.
1.3.3. Tác dụng khác
Gossypol được chứng minh là có tác dụng diệt virus và kí sinh trùng.
Nó thể hiện tác dụng chống virus đối với các virus có vỏ, ví dụ như HIV1 và
HSV2, nhưng không thể hiện trên virus không có vỏ như poliovirus [25, 31 .
(-)-Gossypol (nồng độ ức chế trung bình [IC50= 5,2 |LiM) có hiệu lực mạnh hơn
(+)-gossypol (IC50= 50,7|^M) khi chổng lại sự sao chép của HIVl nhưng lại
không mạnh bằng zidovudin (AZT). Khi kết họp điều trị với AZT, (-)-
- 10-

gossypol không có các tác dụng phụ nghiêm trọng gây độc trên tủy xương
[25].
Gossypol có tác dụng ức chế các chủng kí sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum nhạy cảm và đề kháng với chloroquin [32, 38]. Các
dẫn xuất của gossypol cũng thể hiện tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét tương
tự như gossypol (IC50 = 7-15ịxM) [32].
Tác dụng diệt kí sinh trùng khác bao gồm ức chế Entamoeba histolytica
và Tỉypanosoma cruzi [15, 29].
Gossypol cũng là một chất chống oxy hóa tự nhiên có hiệu quả. Các
dẫn xuất base Schiff của gossypol được chứng minh là có tác dụng chống oxy
hóa tương đương với gossypol. Nhưng khi thay đổi nhóm hydroxyl phenolic
của gossypol thì hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn xuất bị giảm, chứng tỏ
rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết định trong tác dụng chống oxy hóa
của gossypol [40].
1.4. Một số qui trình chiết tách gossypol
L4.1. Phương pháp 1:
Nguyên liệu: vỏ rễ của cây bông Gossypỉum barbadense
Phương pháp: Chiết gossypol toàn phần bằng dung môi aceton, dịch
chiết đem kết tinh trong hệ dung môi aceton : acid acetic để thu sản phẩm
gossypol acid acetic (G-AA).
Mô tả: Nguyên liệu đem ngâm lạnh với aceton ở nhiệt độ phòng. Hết
thời gian, đem lọc. Dịch lọc, đem cất thu hồi dung môi trên máy cất chân
không đến một thể tích xác định. Sau đó thêm vào một lượng acid cetic phù
họp, để kết tinh qua đêm. Hết thời gian, đem lọc, rửa tinh thể bằng hexan.
Tinh thể thu được đem sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng cho hết
-11 -
hexan. Ket tinh lại một lần nữa với aceton và acid acetic như trên, thu được
sản phẩm G-AA [28'.
Nhận xét:
- ư u điểm; phương pháp chiết và kết tinh đơn giản. Sản phẩm kết tinh

là G-AA là dẫn chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác
dụng dược lý của gossypol. Hơn nữa G-AA còn được chứng minh là
bền hon gossypol.
- Nhược điểm của phương pháp là tác giả không đưa ra hiệu suất của
qui trình. Hơn nữa qui trình đi từ vỏ rễ của cây bông, đây là nguyên liệu
không sẵn có do phải phá bỏ cả cây mới lấy được.
1.4.2. Phương pháp 2:
Nguyên liệu: Gôm hạt bông (cottonseed gum), hoặc soapstock: đây đều
là những sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất dầu hạt bông, chứa gossypol
dưới dạng liên kết với một số chất khác như phospholipid, protein trong nhân
hạt bông.
Phương pháp: Phương pháp của Dowd và cộng sự [27]. Thủy phân
gossypol dưới dạng liên kết bằng acid thích hơp, sau đó dùng một dung môi
hữu cơ tách lấy gossypol tự do, ly tâm để tách riêng pha hữu cơ chứa gossypol
và pha nước chứa phospholipid, pha hữu cơ đem thu hồi một phần dung môi
rồi kết tinh bằng cách thêm acid acetic, tách riêng tinh thể G-AA tạo thành.
Mô tả: Dung môi được dùng là methyl ethyl keton (MEK) chứa acid
phosphoric hoặc acid oxalic. Nồng độ acid là 0,2 M với acid oxalic hoặc 0,4
M với acid phosphoric. Nguyên liệu được cho vào bình thích họp, thêm MEK
đã được acid hóa, đun hồi lưu ở 75°c, thời gian thủy phân là Ih nếu dùng acid
oxalic và 2 giờ nếu dùng acid phosphoric, trong thời gian thủy phân có khuấy
trộn. Hết giờ, làm lạnh bình về 1 o^c, sau đó cho hỗn họp vào li tâm để phân
- 12-
tách riêng ra hai pha: pha MEK chứa gossypol và pha nước chứa phosphatid.
Pha nước này được rửa lại khoảng 3 lần với MEK. Gộp pha MEK ở trên với
các phần MEK rửa pha nước, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến
còn khoảng một thể tích phù hợp cho kết tinh, rồi thêm acid acetic để kết tinh.
Lượng acid acetic thêm vào bằng khoảng 1/3 lượng MEK. Kết tinh ở 25®c,
trong điều kiện tránh ánh sáng để ngăn cản quá trình gossypol bị oxy hóa. Hết
thời gian kết tinh, tách lấy tinh thể G-AA bằng cách lọc dưới áp suất giảm

hoặc li tâm. Rửa tinh thể bằng hexan đến khi dung dịch rửa hết màu. Cuối
cùng tinh thể G-AA đem sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng. Có
thể tinh sạch sản phẩm bằng cách kết tinh lại nhiều lần bằng acid acetic và
MEK như trên.
Phưong pháp cho sản phẩm có độ tinh sạch đạt khoảng 87%, hiệu suất
của cả quá trình từ 2,1- 3,0% [27].
Nhận xét: Bước quan trọng nhất của phương pháp này là bước thủy
phân giải phóng gossypol tự do từ dạng liên kết. Phương pháp dễ thực hiện và
có thể nâng lên thực hiện ở qui mô lớn. Hơn nữa, phưooig pháp này sử dụng
các nguyên liệu là các sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất dầu hạt bông, vì
thế nguyên liệu rẻ tiền. Sản phẩm thu được cuối cùng là G-AA, là chất được
sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác dụng dược lý của gossypol. Quá
trình chiết gossypol toàn phần cũng như kết tinh tạo G-AA yêu cầu ít thời gian
(khoảng 30 giờ đến 48 giờ), tránh được sự tác động của nhiệt độ cao và ánh
sáng nên giảm thiểu được sự oxy hóa gossypol.
1.4.3. Phương pháp 3:
Nguyên liệu: Nhân hạt của cây bông Gossypium hirsutum, giống 43-04.
- 13 -
Phương pháp: Sử dụng phương pháp Carruth [9], nguyên liệu được
chiết bằng ether dầu nhiệt độ sôi thấp để loại dầu béo, rồi chiết gossypol bằng
DEE. Dịch chiết DEE thêm acid acetic bãng để kết tinh thu G-AA.
Mô tả; Nguyên liệu được chiết với ether dầu có nhiệt độ sôi thấp trong
48 giờ để loại hết dầu béo, lượng dung môi gấp 10 lần nguyên liệu (v/w). Tiếp
đó, bã nguyên liệu được tiếp tục chiết bằng DEE trong 24 giờ, lưọng DEE gấp
8 lần nguyên liệu. Dịch chiết DEE thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp
suất giảm đến còn một thể tích thích hợp. Phần dịch chiết DEE đã cô đặc được
đem lọc, rồi thêm acid acetic băng. Đe kết tinh qua đêm trong tủ lạnh. Sau đó
lọc thu tinh thể và rửa tinh thể bằng hexan.
Hiệu suất của quá trình trên là 0,45%. Tuy nhiên sản phẩm thu được
vẫn có màu hơi nâu. Do đó, tác giả đã tiến hành kết tinh lại 3 lần nữa trong

điều kiện như trên, thu được sản phẩm G-AA có màu vàng sáng, hiệu suất đạt
0,28% [30].
Nhận xét:
- ư u điểm: Phưong pháp đơn giản, dễ thực hiện.
- Nhược điểm: sử dụng tốn dung môi, và các dung môi đều dễ cháy nổ,
không được sử dụng trong sản xuất lớn. Cụ thể, tác giả chiết 1,5 kg nguyên
liệu cần đến 15 lít ether dầu, 12 lít DEE và 0,4 lít acid acetic băng cho giai
đoạn kết tinh. Mặt khác, thời gian chiết dài có thể làm tăng khả năng sản
phẩm bị oxy hóa. Giai đoạn kết tinh yêu cầu thực hiện trong thời gian dài, và
ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh), điều này khó thực hiện được ở qui mô sản xuất
lón.
1.4.4. Phương pháp 4:
Nguyên liệu: Bột nhân hạt bông của cây bông Gossypium barbadense
- 14-
Phương pháp: Cải tiến phương pháp Caưuth [9]: chiết gossypol toàn
phần bằng phương pháp Soxhlet, tinh chế gossypol bằng 2 phương pháp sắc kí
cột silicagel hoặc phương pháp kết tinh.
Mô tả: Nguyên liệu được chiết trong ether dầu (nhiệt độ sôi 30°c -
60°C) ở nhiệt độ 60°c trên bếp cách thủy bằng thiết bị chiết Soxhlet cho đến
khi dịch chiết ether dầu trở nên không màu (điều này đạt được sau khoảng 24
giờ chiết). Cuối giai đoạn này, bột hạt bông được lấy ra, sấy trong tủ sấy chân
không ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lấy ra tiếp tục chiết bằng diethyl ether (DEE)
ở nhiệt độ 40 "c trong 24 giờ trên bếp cách thủy bằng dụng cụ Soxhlet. Dịch
chiết DEE được lọc, thu hồi dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở
nhiệt độ phòng, thu được cao chiết DEE.
Tinh chế bằng sắc kí cột silicagel: cao chiết DEE cho chạy sắc kí qua
cột silicagel, hệ dung môi rửa giải là n-hexan : ethyl acetat: acid acetic với độ
phân cực tăng dần: 100:0:1 - 80:20:1, thu được chất rắn màu vàng. Hòa tan
chất rắn trên trong DEE và thêm acid acetic băng để kết tinh tạo sản phẩm G-
AA, sau 24 giờ lọc, rửa sản phẩm kết tinh bằng ether dầu rồi sấy trong tủ sấy

chân không ở nhiệt độ phòng, thu sản phẩm cuối cùng là G-AA.
Tinh chế bằng phương pháp kết tinh: cao chiết DEE được hòa tan trong
một thể tích DEE xác định, sau đó thêm acid acetic băng, đậy kín và tránh ánh
sáng để kết tinh trong 24 giờ. Sau đó đem lọc, rửa tinh thể bằng ether dầu (30
°c - 60 ”C). Sấy sản phẩm trong tủ sấy chân không ở 25 trong 24 giờ, thu
được sản phẩm G-AA.
Hiệu suất của quá trình chiết xuất và tinh chế gossypol là 0,32%, sản
phẩm có độ tinh khiết cao (>98%) [2].
Nhận xét:
- ưu điểm; phương pháp Sohxlet là chiết được lượng tối đa gossypol ra
khỏi nguyên liệu, mà tốn ít dung môi.
- 15-
- Nhược điểm: phương pháp này khó phát triển lên qui mô lớn vì không
có dụng cụ chiết Soxhlet cũng như là dụng cụ để tiến hành sắc kí cột ở qui mô
công nghiệp. Mặt khác, thời gian chiết Shoxlet khá dài (trên 48 giờ), và tiến
hành ở nhiệt độ cao nên có khả năng ảnh hưởng đến độ bền, độ tinh khiết của
sản phẩm. Dung môi DEE dễ cháy nổ, không được phép dùng trong sản xuất
lớn cũng là một nhược điểm của phương pháp.
* Tóm lại:
ở Việt Nam, Viện Dược liệu đã nghiên cứu chiết tách gossypol dựa trên
phương pháp 4 của tác giả Lê Thị Xoan. Gossypol tách được đã được khẳng
định cấu trúc bằng các phương pháp: đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ
khối, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại.
Quá trình nghiên cứu cho thấy phương pháp của tác giả Lê Thị Xoan
tuy đơn giản nhưng mất nhiều thời gian, và chỉ phù hơp với qui mô phòng thí
nghiệm, không thể áp dụng vào các qui mô lớn hơn. Mặt khác, hiệu suất thu
được vẫn thấp (0,32%).
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu dựa trên phương pháp 2 của
Michael Dowd và cộng sự, vói mục đích đưa ra được qui trình chiết tách
gossypol có hiệu suất cao hơn và có thể áp dụng vào qui mô lớn hơn.

- 16-
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: Hạt của cây bông Gossypỉum hirsutum giống D I6-2 và
VN 36-P đã được cán loại xơ do Thạc sĩ Trần Văn Tâm, Phòng di truyền và
chọn giống, Viện nghiên cứu và phát triển cây bông, Nha Hố, Ninh Thuận
cung cấp.
Hóa chất: Dung môi dùng cho chiết xuất là dung môi công nghiệp đã
cất lại. Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế, đo các loại phổ là
dung môi tinh khiết của Trung Quốc.
Gossypol đối chiếu được điều chế tại Khoa Hóa Thực vật- Viện Dược
liệu, và đạt độ tinh khiết 98% (định lượng bằng phương pháp HPLC).
Gossypol đối chiếu được sử dụng làm chất chuẩn cho các nghiên cứu tiếp
theo.
2.1.2. Máy móc và dụng cụ
- Dụng cụ bình cầu, bình nón, bình chiết quả lê, phễu lọc của các
hãng Bomex, IsoLAB.
- Máy cất quay Rotavapor R- 200 của hãng Buchi- Viện Dược liệu.
- Máy xác định độ ẩm Prescisa HA60- Viện Dược liệu.
- Máy xác định điểm nóng chảy SMP3 (Stuart)- Viện Dược liệu.
- Máy phân cực kế Electronic Polarimeter P3001- Viện Dược liệu.
- Máy quang phổ UV- Visible Spectrophotometer Carry lE (Varian)-
Viện Dược liệu.
- 17-
- Máy quang phổ hồng ngoại Impact 410 Nicolet- Viện Hóa học.
- Máy sắc kí lỏng- khối phổ Shimadzu LC- MS 2010EV- Viện Hóa học.
2.2. Nội dung nghiền cứu
- Nghiên cứu qui trình chiết tách gossypol từ hạt cây bông Gossypỉum

hirsutum.
- Kiểm tra cấu trúc chất tách được
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến qui trình chiết tách.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và tỉnh chếgossypol
2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất
Từ ưu nhược điểm của các phương pháp đã trình bày ở trên, chúng tôi
chọn phương pháp chiết gossypol từ hạt bông với mục đích: phưoTig pháp đơn
giản, chi phí thấp, có thể nâng lên sản xuất ở qui mô lớn; nguyên liệu sẵn có,
có thể tận dụng được các phụ phẩm trong quá trình chiết xuất; sản phẩm thu
được là G-AA có thể sử dụng luôn cho các nghiên cứu khác, mặt khác G-AA
được chứng minh là bền hơn gossypol, nó vẫn đạt độ tinh khiết trên 98% sau
30 năm bảo quản ở nhiệt độ - 6 ^c [19].
Phương pháp này cải tiến phương pháp của Michael Dowd và cộng sự
(phương pháp sổ 2 ) cho phù hợp với mục đích trên và nguyên liệu sử dụng.
Phương pháp như sau:
Hạt bông G. hirsutum (giống D I26) sau khi đã cán loại xơ bông được
phơi khô, xay nhỏ và phân tách nhân ra khỏi lớp vỏ bên ngoài. Bột nhân thu
được sau đó đem xác định độ ẩm. Bảo quản bột nhân hạt bông trong tủ lạnh ở
nhiệt độ 8 °C- lOV cho đến khi sử dụng.
'rRUỒNiỈĐ'-! 'n7 ) ỉ I
'V H o ,1
- 18-
Bột nhân hạt bông được ngâm với dung dịch acid thích hợp để thủy
phân gossypol ra khỏi dạng liên kết. Sau đó chiết với hỗn họp dung môi
aceton : nước. Quá trình thủy phân và chiết đều được tiến hành trên nồi đun
cách thủy, có lắp sinh hàn để hồi lưu. Dịch chiết thu được đem cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm, còn lại pha nước chứa gossypol và dầu hạt bông
không tan. Pha nước này đem lắc với dichlo methan (DCM), gossypol tan
trong DCM, thu pha DCM đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu

được cao chiết.
Nghiên cứu này cũng tiến hành khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởng
trong quá trình chiết gossypol toàn phần ra khỏi nguyên liệu như: loại acid
dùng để thủy phân, nồng độ acid, tỉ lệ aceton : nước trong hỗn hợp dung môi,
lượng dung môi dùng để chiết.
2.3.1.2. Phương pháp tinh chế gossypol
Kết tinh gossypol từ cao chiết thành dạng gossypol- acid acetic (G-AA)
bằng dung môi aceton và acid acetic. Cao chiết được hòa tan trong một thể
tích aceton xác định trong bình cầu, dung dịch thu được sau đó được thêm từ
từ một thể tích acid acetic xác định. Ngay sau đó bình cầu được đậy kín, bao
bọc tránh ánh sáng để ngăn quá trình oxy hóa. Quá trình kết tinh tiến hành ở
nhiệt độ phòng, có khuấy trộn liên tục bằng máy khuấy từ. Sau 24 giờ, lọc
dung dịch, rửa tinh thể G-AA bằng ether dầu (30°C- 60°C). Sản phẩm thu
được đem sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng cho hết ether dầu rồi
đem cân bằng cân phân tích.
2.3.2. Phương pháp kiểm tra Cẩu trúc và xác định hàm lượng G-AA có
trong sản phẩm tách được
2.3.2.1. Định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng