Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mảnh bát (coccina indica)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHAN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CỦA CÂY MẢNH BÁT
(COCCINIA INDICA)


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CỦA CÂY MẢNH BÁT
(COCCINIA INDICA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. TS. Nguyễn Văn Tài
Nơi thực hiện:

1. Khoa hóa thực vật – Viện Dược Liệu
2. Bộ môn Dược liệu


HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM
ƠN

Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập tại trường Đại học
Dược
Hà
Nội và quá trình nghiên cứu, học tập của em tại Viện Dược
liệu.

Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân
đến TS. Nguyễn
Văn
Tài và TS. Hoàng Quỳnh Hoa dù bận rất nhiều công
việc nhưng đã tận tình hướng
dẫn,
giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên
cứu đề tài và hoàn thành khóa
luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ, các anh chị kĩ thuât viên tại
khoa
Hóa Thực vật - Viện Dược liệu đặc biệt là chị Nguyễn Thị Huyền
Phương và các thầy cô ở bộ môn Thực Vật, Dược Liệu trường Đại
học

Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình
học
tập và
nghiên cứu.
Mặc dù bản thân đã rất cố gắng
nhưng
chắc chắn khóa luận không
tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận
được
những ý kiến đóng
góp quý giá của các thầy
cô.



Hà Nội, tháng 5 năm
2014


Sinh
viên



Phan Thị Hường




MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1 Đặc điểm thực vật chi Coccinia 2
1.2 Đặc điểm thực vật loài mảnh bát (Coccinia indica Wight and Arn.) 3
CHƯƠNG
2: ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN
C
Ứ
U
. 12
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12
2.2 Nội dung nghiên
c
ứu
13
2.3 Phương pháp nghiên cứu 13
CHƯƠNG
3: THỰC
NGHIỆM,
KẾT QUẢ
VÀ
BÀN
LU
ẬN
16
3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ có trong thân lá
mảnh bát (Coccinia indica) bằng phản ứng hóa
h

ọc
16
3.2 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl acetat thân, lá
mảnh bát Coccinia indica 21
3.3 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan, ethyl acetat của mảnh bát
bằng sắc ký lớp mỏng. 24
3.4. Phân lập và xác định cấu trúc một số chất trong phân đoạn n - hexan
26
3.5 Phân lập và xác định cấu trúc một số chất trong phân đoạn ethyl
acetat: 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
43
TÀI LIỆU THAM
KHẢO
44
PHỤ LỤC 1





DANH MỤC CÁC KÝ
HIỆ
U
CÁC CHỮ VIẾT
T
Ắ
T

CTCT

DCM
Dd
EtOAc
EtOH
MeOH
kl
IR
NMR
MS
R
f

SKLM
tt
TT
Công thức cấu
tạo
D
ichloromethan
Dung
dịch
Ethyl
acetat
Ethanol
Methanol
Khối lượng
Phổ hồng ngoại
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ khối
Hệ số lưu

Sắc ký lớp
mỏng
Thể tích
Thuốc thử






DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân, lá
mảnh bát (Coccinia indica)
bằng phản ứng hóa
h
ọc ………… 20

Bảng 3.2: Phổ
1
H,
13
C - NMR của MH41………………………………… 34

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy
trình
chiết phân đoạn từ thân lá mảnh bát…… 23

Sơ đồ 3.2: quy trình phân lập các chất trong cắn n – hexan………………….28
Sơ đồ 3.3: quy trình phân lập cắn ethyl acetat……………………………….37















DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1: Cây mảnh bát Coccinia indica…………… ………………

Hình 3.2: Sắc kí đồ phân đoạn n – hexan dưới ánh sáng tử ngoại hai bước
sóng λ = 254 nm và λ = 365 nm …………………

Hình 3.3. Sắc kí đồ phân đoạn EtOAc dưới ánh sáng tử ngoại hai bước
sóng λ = 254 nm và λ = 365 ……………………………………

Hình 3.4. Sắc kí đồ chất MH1 (3) và MH2 (9) …………………………
Hình 3.5 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và
phân đoạn (41 – 50)……


Hình 3.6 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và
chất kết tinh MH41 thu
được
trong
hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10) ……………………

Hình 3.7 CTCT của MH1…………………………………………………
Hình 3.8 CTCT của MH2…………………………………………………
Hình 3.9 Công thức cấu tạo của MH41 (β - sitosterol)……………………

Hình 3.10 Sắc kí đồ phân đoạn 34 - 40
thu được
trong
hệ dung môi
DCM: MeOH (90: 10)
…………………………………………………….

Hình 3.11 Sắc kí đồ cắn EtOAc và chất ME40 trong
hệ dung môi
DCM: MeOH (90: 10)
……………………………………………………

Hình 3.12 Sắc kí đồ chất chuẩn daucosterol và
chất ME40 thu được

trong
hệ dung môi DCM: MeOH (90: 10)………………………………

12

25

26
29
30

31
32
33
34

38

38

39

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người càng ngày càng có xu hướng sử dụng nguồn dược
liệu làm thuốc. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa với nguồn
thảo dược phong phú. Trong đó, cây mảnh bát phân bố rộng rãi ở khắp các
tỉnh nước ta, tất cả các bộ phận của cây đều có giá trị y học. mảnh bát được sử
dụng chữa bệnh đái tháo đường, phát ban da, ghẻ lở, mụn nhọt, vết thương bị
rắn cắn, đau khớp, viêm phế quản… Ngoài ra, lá non và quả mảnh bát cũng có
thể dùng làm rau ăn.
Tuy nhiên ở Việt Nam hầu như chưa có nghiên cứu về thành phần hóa
học cũng như tác dụng sinh học của mảnh bát. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mảnh bát
(Coccinia indica)” với 2 mục tiêu sau:
- Xác định sự có mặt một số nhóm chất chính có trong thân, lá mảnh bát.
- Phân lập và xác định cấu trúc một số chất từ dịch chiết thân, lá mảnh bát.











2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm thực vật chi Coccinia
1.1.1 Vị trí, phân loại chi Coccinia
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Coccinia thuộc:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Mộc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ Bầu bí (Cucurbitates)
Họ Bầu Bí (Cucurbitaceae)
Chi Coccinia [2].
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coccinia.
Chi Coccinia thuộc họ Bầu bí (Curcubitaceae) [Từ chữ Hy Lạp
kokkinos: màu đỏ tươi] – mảnh bát, Hoa bát, bình bát.
Cây thảo, có thân leo hay trườn. Lá có cuống. Phiến có hình dạng thay
đổi. Tua cuốn đơn hay chẻ đôi, có lá bắc mềm ở các mấu, ở chỗ đính của lá và
tua cuốn.
Hoa đực đơn độc hay thành chùm ngắn, cỡ trung bình, màu vàng da
cam, vàng hoặc ít khi trắng, cuống hoa khá ngắn. Có khi có lá bắc. Đế hoa
thường hình chuông. Lá đài 5 nhỏ, dạng răng. Tràng hoa hợp với 5 thùy dính
đến hơn 2/3 chiều cao, thùy rời khá ngắn, nguyên. Nhị 3, có chỉ nhị dính
thành cột trung tâm đính ở đáy đế hoa. Bao phấn hướng ngoài, thường hợp
thành 3 khối. Hoa cái đơn độc rất ít khi thành chùm nhỏ. Bao hoa giống như
ở hoa đực. Bầu hình trứng hay trứng thuôn chứa nhiều noãn ngang, đầu nhụy
chia 3 thùy. Nhị lép nhỏ.
3

Quả nang không mở, nạc, nhỏ, màu lục, viền trắng rồi hồng, hình cầu
hay hình trụ, có vỏ quả mỏng.
Hạt nhiều, nhỏ, dẹp.

Chi Coccinia gồm tới 30 loài ở châu Phi, một số loài phân bố rộng
trong các vùng nhiệt đới.
Ở nước ta có 1 loài Coccinia indica [4].
1.2 Đặc điểm thực vật loài mảnh bát (Coccinia indica Wight and Arn.)
1.2.1 Tên gọi:
Tên khoa học : Coccinia indica Wight and Arn. họ Bầu bí
(Curcubitaceae)
Tên đồng nghĩa : Coccinia cordiflora (L.) Cogn, Coccinia grandis (L.) J.
Voigt
Tên Việt Nam : Rau mảnh bát, dây bình bát, hoa bát [4][5].
Tên nước ngoài :
Anh: Ivy gourd, Baby watermelon.
Ấn độ: Kovai, Bimbi, Kanturi.
Trung quốc: Hong gua.
Tây Ban Nha: Pepino
Cimarron.

Malay alam: Kova,
Koval.

1.2.2. Đặc điểm thực vật
Cây thảo nhẵn và mảnh, mọc leo cao, đôi khi dài tới 5 m hay hơn. Lá có
cuống hình 5 cạnh, có răng, rộng 5 – 8 cm, hình tim ở gốc, rất nhẵn, chia 5
thùy hình tam giác, có mũi nhọn cứng. Tua cuốn đơn.
Hoa đực và hoa cái giống nhau, mọc đơn độc hay xếp lại hai cái một ở
nách lá, có cuống dài 2 cm.
4

Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, dài 5 cm, rộng 2,5 cm, khi chín có
màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt [4][5].

1.2.3. Sinh thái
Ra hoa quả gần như quanh năm, thường mùa hoa vào tháng 10, mùa
quả vào tháng 12.
Cây ưa ẩm, ưa sáng, thường mọc lẫn trong các lùm bụi quanh làng, ven
rừng, bờ nương rẫy nhất là nhưng nơi gần nguồn nước, từ vùng thấp tới vùng
cao 1500 m [4][5].
1.2.4 Phân bố
Phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, nam Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia,…
gặp nhiều ở châu Phi và Trung Mỹ.
Ở nước ta cây mọc từ Quảng Ninh, Hà Nam, Ninh Bình, Huế, Quảng
Nam, Khánh Hòa, Lâm Đồng [4][5].
1.2.5 Bộ phận dùng
Lá, thân, dây thu hái quanh năm. Hạt lấy ở quả chín, dùng tươi hoặc
phơi sấy khô [4].
1.2.6 Thành phần hoá học:
Rễ: Triterpenoids, Saponin coccinoside, flavonoid glycoside ombuin 3
- o -
arabino
furanoside, acetat lupenol, aceta β - amyrin & β - sitosterol,
Stigmast – 7 – en – 3 - one, 3 – 0 –
β (α – L – arabinopyranosyl – (1 - 2) β – D
glucopyranosyl – (1
→3)
– β hydroxylup 20 (29) – en – 28 oic acid và các chất
aglutinin là một chitooligosaccharid - lectin và nhiều polysaccharid như
arabinogalactan, xyloglucan… và các carotenoid [4][9][13]
Quả: Nước 93,1%, protein 12%, chất béo (chiết ether) 0,1%, chất xơ 1,6%;
carbonhydrat 3,5%, chất vô cơ 0,5 mg%, calcium 0,04 mg%; phosphor 0,03%.
Sắt 1,4 mg%; vitamin A 240IU%; vitamin C 20 mg%, taxaxerone, taxaxerol,
5

β - carotene, lycopene, cryptoxanthin, β –
sitosterol [11].

Quả non chứa lypeol, β - amyrin và cả cucurbitacin β - glucosid [4][5].
- Lá: Alkaloid, carbohydrate, protein và axit amin, tannin, saponin, flavonoid,
phytosterol, triterpenes, cephalandrol, tritriacontane, lupeol, β - sitosterol,
cephalandrine A, cephalandrine B, stigma - 7 - en - 3 - one, taraxerone và
taraxerol, polysaccharides, xyloglucan, carotenoid và cryptoxanthin.
Dịch lá chứa một amylase [13].

Trong rễ, quả và lá mảnh bát, người ta phát hiện được các peptin với hoạt tính
chống lipid cao hạ đường máu [4].
- Phần trên mặt đất: Heptacosane, Cephalandrol, β - sitosterol alkaloids,
Cephalandrine A &
B [10].
1.2.7 Tính vị, tác dụng:
Vỏ và rễ có tác dụng xổ, rễ hạ nhiệt; lá hạ nhiệt, dùng ngoài chống
ngứa, tiêu viêm, quả trị đái đường [5]
1.2.8 Công dụng, chỉ định và phối hợp:
- Lá:
Lá non dùng làm rau ăn.
Chữa các bệnh ngoài da: hắc lào, vảy nến, ngứa loét, thủy đậu…
Điều trị xoang mãn tính.
Làm mát mắt.
Điều trị rối loạn dạ dày, ruột.
Hạ sốt bằng cách đổ mồ hôi.
Dịch chiết cồn được sử dụng chữa lậu.
Chống gây đột biến.
Điều trị đái tháo đường.

6

Làm ra đờm.
Nhiễm trùng đường tiểu và đường hô hấp.
- Thân:
Chống co thắt.
Làm ra đờm, hỗ trợ trong điều trị hen suyễn và viêm phế quản.
Đái tháo đường.
Điều trị rối loạn dạ dày, ruột.
Các bệnh ngoài da.
Nhiễm trùng đường tiểu.
- Quả:
Trị lở loét trên lưỡi.
Quả thô được sử dụng như rau quả.
Chữa bệnh chàm.
- Rễ:
Giảm đau khớp.
Loét.
Thở khò khè, có đờm.
Tiểu đường.
Bệnh ngoài da, tổn thương da.
Nhiễm trùng đường tiết niệu [9][15].
Ở Ấn Ðộ dịch lá và rễ dùng trị bệnh đái đường. Dùng cả cây để làm
thuốc trị bệnh lậu. Lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, trị ghẻ lở, mụn
nhọt, các vết thương và các vết cắn của rắn rết.
7

Trong y học dân gian Ấn Độ, ở nông thôn người ta uống dịch ép từ quả
mảnh bát chín với liều 5 ml, cách nhau 6 giờ một lần làm giảm đáng kể lượng
đường trong máu. Có thể dùng dạng bột quả mảnh bát chín phơi khô với liều

10 g, ngày 3 lần. Người ta cho rằng dạng bột có tác dụng tốt hơn dạng dịch ép.
Tác dụng hạ đường máu chính là do các pectin đã được phát hiện có trong quả
mảnh bát [4][5].
Ở Campuchia người ta dùng dịch chiết từ thân để trị bệnh đau giác mạc.
Ở Indonesia, người ta còn dùng cây làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ
dày và ruột.
Dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm.
Lá mảnh bát phối hợp với bùm sụm, cỏ mầm trầu, dền gai, mỗi thứ một nắm
sắc uống để trị cao huyết áp.
Theo sách thuốc cổ Vệ sinh yếu quyết, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng
dây mảnh bát để chữa trúng độc bằng cách lấy rễ củ của cây để tươi, rửa sạch,
giã nát, vắt lấy nước cốt uống hoặc rễ phơi khô 30 – 50 g, thái nhỏ, sắc với
200 ml nước còn 50 ml, uống làm 1 lần trong ngày.
Theo kinh nghiệm dân gian, lá mảnh bát để tươi, giã đắp chữa mụn
nhọt, lở loét, vết cắn do rết hoặc côn trùng; nếu giã nát lá, thêm nước, gạn
uống, rồi lấy bã hơ nóng, xoa miết khắp người chữa cảm sốt, đau đầu. Thân và
lá mảnh bát 50 – 100 g, nấu với 4 - 5 lít nước trong 30 phút đến 1 giờ; đợi khi
nước ấm, đem tắm dùng bã xát mạnh để chữa ghẻ. Ngày làm một lần.
Dây mảng bát 50 g, phối hợp với rễ cây chùm ngây 30 g, cam thảo dây
20 g, thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống làm hai lần
trong ngày, chữa đái rắt hoặc bí đái. Để chữa trĩ, lấy lá mảnh bát tươi 50 g, rau
diếp cá tươi 50 g, hoa mào gà 5 g, xơ mướp đốt tồn tính 5 g, sắc uống trong
ngày.
8

Nước ép từ thân lá dây mảnh bát và rễ thủy xương bồ có tác dụng chữa
sốt cao, đau đầu, chóng mặt.
Hạt mảnh bát nghiền nát, trộn với dầu dừa, bôi hàng ngày có tác dụng
chữa ghẻ.
1.2.9. Tác dụng dược lý

Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu đã được thực hiện về tác
dụng sinh học và tác dụng dược lý của dịch chiết
Coccinia indica
:
Polyprenol (C60 - polyprenol) màu vàng, là thành phần hoạt tính sinh
học chính của
Coccinia indica
đã được chứng minh tác dụng trọng điều trị rối
loạn lipid máu, chống viêm, chống oxy hóa, chống gây đột biến, đái tháo
đường, kháng khuẩn, chống loét, ngăn ngừa tổn thương gan, ra đờm, giảm
đau và kháng viêm [8][9].

-
Điều trị tiểu đường:
Coccinia indica được sử dụng chính trong điều trị tiểu đường. Các dịch
chiết từ các bộ phận khác nhau của cây với các dung môi khác nhau cho thấy
hiệu quả trị đái tháo đường như sau:
Chiết xuất cồn được cho là an toàn cho nghiên cứu tác dụng sinh học như
không có tác dụng gây chết người là ở liều 600 mg/kg đường uống ở chuột.
Chất chiết từ lá của Coccinia indica làm giảm đáng kể glucose - 6 - phosphat
và fructose - 1,6 - bisphosphate trên cả chuột bình thường và chuột bị mắc
bệnh tiểu đường do streptozotocin.
Hỗn hợp dịch chiết methan rễ cây M.paradisiaca và lá của C.indica trên
chuột mắc bệnh tiểu đường không chỉ kiểm soát glucose máu đến mức độ
kiểm soát mà còn khắc phục được những rối loạn chuyển hóa protein.
Chiết xuất của Coccinia indica (300 mg/kg) giảm đáng kể lượng đường
trong máu bằng 47,4% và 37,1% (P <0,01) vào ngày thứ 7 và 59,7% và 48,5%
9

vào ngày thứ 14. Giảm đáng kể (P <0,01) cholesterol toàn phần trong huyết

thanh là 31,7% và 43,3% và triglycerid huyết thanh là 45,5% và 39,4% đã
được quan sát vào ngày thứ 14 với liều các dịch chiếu của mảnh bát (300
mg/kg) [6][8][11][13].
- Tác dụng hạ mỡ máu:
Chiết xuất ethanol của Coccinia indica làm hạ triglyceride (TG) và làm
giảm cholesterol hiệu ứng trong mô hình chuột rối loạn lipid máu [9].
- Chống phù nề:
Chiết xuất dung dịch nước của lá tươi có hiệu quả chống lại carrageenin
gây ra phù nề chân trong chuột Wistar và chuột Thụy Sĩ. Hiệu quả tương
đương với diclofenac 20 mg/kg thể trọng ở 50 mg/kg nhưng nó được phát huy
là đáng kể ở mức cao hơn liều [8][9].
- Tác dụng hạ sốt:
Quan sát với tất cả các liều từ chiết xuất của mảnh bát so sánh với
paracetamol. Hiệu quả tối đa ở 300 mg/kg [9].
- Tác dụng giảm đau:
Dịch chiết cho tác dụng giảm đau tương đương với morphine điều này
cho thấy sự tham gia của trung tâm hệ thống thần kinh [9].
- Tác dụng chống loét, chống oxy hóa:
Dịch chiết thô ethanol dẫn đến cô lập được chất tinh khiết 4 - hydroxy - 3
- methoxy benzaldehyd có tác dụng chống loét và chống oxy hóa.
Bột lá chiết xuất với nước và methanol đã được thử nghiệm trên chuột bị
loét dạ dày do dùng aspirin. Các dịch chiết bột lá của Coccinia indica làm gia
tăng đáng kể lưu lượng nhầy, giảm trong mức độ lipid peroxy (LPO) và
superoxide dismutase (SOD) hoạt động.
10

Dịch chiết MeOH 50% hoặc EtOH 50% từ toàn bộ cây Coccinia indica
cho thấy tác dụng loại các gốc tự do gần như tương tự như của nhân sâm
[6][9][14].
- Hoạt động chống vi khuẩn:

Hoạt động chống vi khuẩn của dịch chiết quả mảnh bát bằng các dung
môi khác nhau: ether dầu hỏa, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate,
acetone, methanol, ethanol và nước đã được thử nghiệm với sáu vi khuẩn
gram âm và gram dương:
Dịch chiết ether dầu hỏa có hiệu quả tích cực nhất và cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn chống lại tất cả gram thử nghiệm, tạo vùng ức chế tối đa đường
kính 19 mm với Stephylococcus aureus .
Các dịch chiết khác cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi sinh vật
thử nghiệm nhưng ở mức độ thấp hơn và chủ yếu chống lại các vi khuẩn gram
dương S.aureus.
Dịch chiết methanol đã cho thấy khả năng chống lại Bacillus cereus và
Psedomonas putida tạo ra vùng ức chế có đường kính 15 mm và 13 mm.
Dịch chiết nước không chỉ ra tác dụng kháng khuẩn đáng kể.
Chiết xuất chloroform chống lại tất cả các vi khuẩn thử nghiệm với sự ức
chế khu vực khác nhau, 1 mm - 7 mm.
Chiết xuất ethanol cho thấy tác động đáng kể đối với Shigella boydii và
Psedomonas aeruginosa.
Chiết xuất lá của Coccinia indica điều trị sốt rét hiệu quả, chống lại ký
sinh trùng [6][9].
- Tác dụng gây đột biến:
Chiết xuất lá gây đột biến trên Neurospora crassa Fungus.
11

Chiết xuất nước của lá của Coccinia indica cho thấy ức chế sự tăng
trưởng và đột biến trên nấm N.crassa. Kết quả cho thấy 1 ml dịch chiết lá cho
đáp ứng với vi khuẩn thử nghiệm N.crassa [9].
- Độc tính trên gan:
Thử nghiệm dịch chiết cồn của quả Coccinia indica trên chuột có gan
nhiễm độc do CCl
4

và theo dõi mức độ AST, ALT, ALP, protein toàn phần,
bilirubin toàn phần và bilirubin tự do tại mức liều 250 mg/kg. Dịch chiết cồn
giảm hoạt động của các enzym (AST, ALT và ALP) và giảm lượng bilirubin
so sánh với của silymarin (p<0,05) [9].
















12

CHƯƠNG
2: ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN
C
Ứ
U
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu và hóa
ch
ấ
t
- Nguyên liệu: Mảnh bát được hái ở Ninh Bình vào tháng 4. Mẫu tươi được
giám định tên khoa học ở Viện Dược liệu với mã số tiêu bản HNIP/18065/14,
tiêu bản được lưu tại bộ môn thực vật – Trường đại học dược Hà Nội.

Hình 2.1: Cây mảnh bát Coccinia indica
- Hóa chất: Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất
lại.
Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết
của
Trung
Quốc.
2.1.2
Trang
thiết bị và dụng cụ nghiên
c
ứu
-
Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có
mỏ,
ống
nghiệm, pipet, bình cầu


- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R - 200 của hãng
BUCHI -

Viện Dược liệu.

- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60 - Viện Dược
liệu.
- Cân phân tích PRECISA - Viện Dược
liệu.

- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy STUART – Viện dược liệu.

13

- Bản mỏng silicagel GF
254 (
Merck) tráng sẵn pha thuận - Viện Dược
liệu.
- Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410
NICOLET -

Viện Hóa
học.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H,
13
C đo trên máy BRUKER AVANCE
AM500
FT - NMR
- Viện Hóa
học.

- Phổ khối đo trên máy sắc kí lỏng - khối phổ SHIMADZU LC - MS
2010EV -
Viện
Hóa
học.

2.2 Nội dung nghiên
c
ứu

- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính có trong thân, lá mảnh bát.
- Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl
acetat của thân, lá cây mảnh bát.
+ Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl acetat của thân, lá mảnh
bát bằng sắc ký lớp mỏng.
+ Phân lập bằng sắc ký cột một số chất trong phân đoạn n - hexan và phân
đoạn ethyl acetat.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong cây mảnh bát.
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học
ghi
trong tài liệu [1].
2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết n - hexan
và ethyl acetat của thân, lá cây mảnh bát.
2.3.2.1 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan, ethyl acetat của mảnh bát
bằng sắc ký lớp mỏng.
Chấm và chạy sắc ký lớp mỏng dịch chiết n - hexan của mảnh bát, so
sánh với chất chuẩn đối chiếu β – sitosterol.
14

Chấm và chạy sắc ký lớp mỏng dịch chiết ethyl acetat.
Tiến hành soi dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ =
365 nm và hiện màu với thuốc thử H
2
SO
4.

2.3.2.2. Phân lập bằng sắc ký cột một số chất trong phân đoạn n - hexan và
phân đoạn ethyl acetat.
- Chiết xuất:
+ Xử lý dược liệu:
+ Chiết xuất: Chiết hồi lưu dược liệu đã qua xử lý với EtOH 96°. Sau đó,
gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới
cắn.

+ Chiết các phân đoạn: Phân tán đều cắn EtOH toàn phần vào một lượng tối
thiểu
nước nóng, sau đó chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự tăng dần
độ phân
cực
là n - hexan, ethyl acetat. Thu các phần dịch chiết, rồi đem
cất thu hồi dung
môi
dưới áp suất giảm tới
cắn.
- Phân lập bằng sắc ký cột phân đoạn n - hexan và phân đoạn ethyl acetat:
+ Chất hấp phụ: Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở
110°
C

trong 1 giờ. Để nguội ở bình hút
ẩm.

+ Cột sắc ký
: Sử dụng các cột có kích thước 7 x 45 cm; 4 x 45 cm; 2 x 45 cm.

+ Hệ dung môi rửa giải:
Phân đoạn n – hexan: Sử dụng hệ dung môi n - hexan và ethyl
acetat tăng dần độ
phân
cực (gradient lượng ethyl acetat từ 0% đến 20
%).
Phân đoạn ethyl
acetat
:
Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần
độ
phân
cực (gradient lượng EtOAc từ 0% đến 20
%).
- Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, đo
nhiệt độ
chảy.
Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ hồng
ngoại IR, khối phổ
ESI -
MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H/
13

C - NMR),
15

tham khảo cơ sở dữ liệu phổ
của
các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc
chất phân lập
được.

16

CHƯƠNG
3: THỰC
NGHIỆM,
KẾT QUẢ
VÀ
BÀN
LU
ẬN

3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ có trong thân lá
mảnh bát (Coccinia indica) bằng phản ứng hóa
h
ọc
Định tính thân lá mảnh bát (Coccinia indica) để sơ bộ nhận biết các
nhóm chất có trong dược liệu, giúp định hướng cho quá trình phân lập các
chất sau này.
- Chuẩn bị dịch chiết cồn: Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100
ml,
thêm
50 ml EtOH 90°, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc
làm các phản
ứng.

- Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa: Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung
tích
50 ml
, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc. Dịch lọc dùng để làm
các phản

ứng.

3.1.1 Định tính
alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm dung dịch
H
2
SO
4
20% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết
vào bình
gạn,
kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH kiềm.
Chiết alcaloid
bằng
cloroform (CHCl
3
) 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết
CHCl
3
được gộp lại và
lắc
với
H
2
SO
4

2%. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào

3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng
1 ml
rồi thêm vào:
- Ống 1: 2 - 3 giọt TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng
cam.

- Ống 2: 2 - 3 giọt TT Mayer, dung dịch có tủa vàng nhạt, lượng ít
- Ống 3: 2 - 3 giọt TT Bouchardat, dung dịch trong suốt, không có tủa
nâu.

Kết luận: dược liệu có vết alcaloid
3.1.2 Định tính
an
thr
anoid

- Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml,
thêm
10 ml
dung dịch
H
2
SO
4

25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài
17

phút. Lọc
dịch

chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml ether. Lấy 1
ml dịch ether cho
vào
ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, lắc kỹ.
Kết luận: dược liệu không có
an
th
ranoid.

3.1.3 Định tính
flavonoid.

- Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm
một
ít
bột Mg kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách
thủy sau
vài
phút thấy xuất hiện màu xanh nâu
.

- Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống
nghiệm,
thêm 2 - 3 giọt dung dịch FeCl
3
5%, thấy dung dịch chuyển màu
xanh
rêu

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ
khô
rồi
đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc, không thấy màu vàng, khi
soi dưới đèn
tử
ngoại không thấy có màu vàng
sáng.

Kết luận: dược liệu không có chứa
flavonoid
.

3.1.4 Định tính
s
aponin.

- Hiện tượng tạo bọt: Cho bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml
nước. lắc mạnh trong 5 phút. Để yên, thấy bọt bền vững sau 15 phút
.

- Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm
10 ml
H
2
SO
4

loãng. Đun sôi cách thủy vài phút. Để nguội, chiết với

cloroform.
Lấy
khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm.
Thêm từ từ 1 ml
H
2
SO
4
đặc theo thành ống nghiệm, quan sát thấy giữa hai
lớp xuất hiện vòng đỏ nâu.
- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết cloroform ở trên
cho
vào
1 ống nghiệm rồi cô tới cắn. Cho vào cắn 0,5 m l anhydrid
acetic, lắc đều,
đặt
nghiêng ống 45° rồi thêm 0,5 ml acid sulfuric đặc theo
thành ống nghiệm để
dịch
lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát thấy
mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất
lỏng
trong ống nghiệm có màu
đỏ.