Nghiên cứu thành phần hóa học của cây lược vàng

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI






PHAN THỊ BÍCH PHƢỢNG




NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY LƢỢC VÀNG





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI










PHAN THỊ BÍCH PHƢỢNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY LƢỢC VÀNG





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Nguyễn Quỳnh Chi
2. TS. Nguyễn Thị Minh Hằng
Nơi thực hiện:
Viện Hóa Sinh Biển

HÀ NỘI - 2013

M ƠN
.
.
- -
.
.
.
ng 5 năm 2013
Sinh viên


MỤC LỤC
Trang


ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN………………………………………………
2
1.1. Thực vật học…………………………………………………………
2
1.1.1 Vị trí phân loại của chi Callisia Loefl………………………………….
2
1.1.2. Đặc điểm chung của chi Callisia Loefl………………………………
2

1.1.3. Đặc điểm chung của loài Callisia fragrans (Lindl.)
Woodson

3
1.2. Công dụng của cây Lược vàng dùng trong dân gian……………………
3
1.2.1.Trên thế giới………………………………………………………
3
1.2.2. Ở Việt Nam………………………………………………………
4
1.2.3. Các chế phẩm của cây Lược vàng…………………………………….
4
1.3. Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và tác dụng dược
lý của cây Lược vàng………………………………………………………

6
1.3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học…………………………………
6
1.3.2. Nghiên cứu về tác dụng dược lý………………………………………
9
Chƣơng II.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và thiết bị………………………………………………….
12
2.1.1. Nguyên liệu……………………………………………………………
12
2.1.2. Hóa chất và thuốc thử…………………………………………………
12
2.1.3. Thiết bị và máy móc sử dụng trong nghiên cứu………………………
12

2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………
13
2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………
13
2.3.1. Phương pháp chiết xuất………………………
13
2.3.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập chất
sạch…………………………………………………………………………

13
2.3.3. Kĩ thuật kết tinh………………………………………………………
15
2.3.4. Các phương pháp xác định cấu trúc………………………………
15
2.3.4.1. Phổ khối lượng (MS)……………………………………………
15
2.3.4.2. phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)……………………………
15
Chƣơng III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.)
Woodson)……………………………………………………………………

16
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cắn chiết etyl axetat………………
17
3.2.1.Khảo sát cắn etyl axetat bằng sắc kí lớp mỏng……………………
18
3.2.2.Phân tách cắn etyl axetat để phân lập các chất sạch………………
18

3.2.2.1. Tiến hành chạy sắc kí cột…………………………………………
19
3.2.2.2. Tinh chế các phân đoạn……………………………………………
19
3.2.3. Xác định cấu trúc của các chất đã phân lập………………………….
25
3.2.3.1. Cấu trúc của VLV3…………………………………………………
25
3.2.3.2. Cấu trúc của VLV2…………………………………………………
29
3.2.3.3. Cấu trúc của VLV4…………………………………………………
32
3.2.3.4.Cấu trúc của VLV5……………………………………………
34
3.3. Bàn luận…………………………………………………………………
37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………………………………………………

39

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NMR: Nucleur Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
1H NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ proton)
13
C
NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13C)
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (phổ DEPT)
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC)
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC)
ESI-MS: Electron Spray Impact Mass Spectrometry, phổ khối phun mù điện tử.
s: singlet b: broad
d: doublet o: overlapping
t: triplet dd: double doublet
q: quartet dq: double quartet
δH, δC: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon.
ppm: parts per million, phần triệu.
TLC: Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng.
CC: Column Chromatography, Sắc kí cột thường.
MeOH: metanol
CH
2
Cl
2
: Diclometan
EtOAc: Etyl axetat
H2O: Nước
MDA: malondialdehhyd
TMS: Tetra metylsilan

EC
50
: Nồng độ có hiệu quả trên 50% tế bào thử nghiệm.
LD
50
: Liều gây chết 50% động vật thử nghiệm.
Kt: kết tinh
Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng
Anh cho tiện tra cứu.


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Giá trị Rf của VLV5 trong các hệ dung môi khác nhau
Bảng 3.2. Giá trị Rf của VLV4 trong các hệ dung môi khác nhau
Bảng 3.3. Giá trị Rf của VLV2 trong các hệ dung môi khác nhau
Bảng 3.4. Giá trị Rf của VLV3 trong các hệ dung môi khác nhau
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ
1
H NMR (500 MHz) và
13
C NMR (125 MHz) của VLV2 và
VLV3
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ
1
H NMR (500 MHz) và
13
C NMR (125 MHz) của VLV4 và
VLV5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cây Lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woodson
Hình 1.2. Một số chế phẩm từ cây Lược vàng được bán ở Nga
HÌnh 1.3. Một số chế phẩm từ cây Lược vàng ở Việt Nam
Hình 1.4. Các hợp chất phenolic từ cây Lược vàng
Hình 1.5. Cấu trúc của 1 số hợp chất sterol và cerebosit chiết từ cây Lược vàng
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Isoorientin, L-Tryptophan và Ginsenoid Rg 1
Hình 3.1. Quy trình điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng
Hình 3.2. Sắc kí đồ phân đoạn etyl axetat dưới ánh sáng tử ngoại ở λ= 254 nm và
sau khi phun thuốc thử ceri sulfat
Hình 3.3. Sắc kí đồ và tinh thể của VLV5

Hình 3.4. Sắc kí đồ và tinh thể của VLV4
Hình 3.5. Sắc kí đồ và tinh thể của VLV2
Hình 3.6. Sắc kí đồ và tinh thể của VLV3
Hình 3.7. Quy trình phân tách cắn etyl axetat và phân lập các chất sạch















1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xưa, các dân tộc Châu Á đã biết sử dụng các loại cỏ, cây, hoa, lá trong tự
nhiên để chữa trị bệnh tật. Tuy nhiên, sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cỏ
chủ yếu dựa trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loại thảo dược.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết của con nguời về
các loại thảo dược cũng ngày càng đòi hỏi sâu sắc hơn. Việc đi sâu nghiên cứu
thành phần hóa học để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của các cây thuốc chữa bệnh đã
trở thành một lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú ý của giới khoa học.
Ở nước ta, việc sử dụng cây cỏ để chữa bệnh rất phổ biến trong dân gian. Thời
gian gần đây có nhiều thông tin về tác dụng chữa bệnh có hiệu quả của cây Lược

vàng còn gọi là Lan vòi. Đây là một loài cây thuộc họ Thài Lài (Commelinaceae)
vốn có nguồn gốc từ Trung Mỹ với tên khoa học là Callisia fragrans (Lindl.)
Woodson . Trong dân gian, Lược vàng đã được sử dụng rất rộng rãi trong việc hỗ
trợ và chữa trị các bệnh như: ung thư, bỏng, viêm, nhiễm, lao phổi, bệnh tim
mạch…
Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của cây Lược vàng là
thông tin truyền miệng còn chưa được chứng minh rõ ràng bằng các nghiên cứu
khoa học. Chính vì vậy, Hội người cao tuổi Việt Nam đã đề nghị Viện Hàn lâm
Khoa Học và Công nghệ Việt Nam xúc tiến nghiên cứu về cây Lược vàng để tìm ra
những hoạt chất có tác dụng chữa bệnh nhằm chứng minh và làm sáng tỏ các tác
dụng chữa bệnh của cây Lược vàng.
Theo hướng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây
thuốc có công dụng quý báu và kết hợp với đề tài nghiên cứu khoa học của Viện
Hóa sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chúng tôi đã lự
ng nghiên cứu của khóa luận này với tiêu đề
“Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Lược vàng” theo các mục tiêu sau:
- Phân lập các chất có trong cắn etyl axetat;
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được.
2
Chƣơng I: TỔNG QUAN
1.1. Thực vật học
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Callisia Loefl.
Cây Lược vàng thuộc chi Callisia Loefl., một chi thuộc họ Thài lài
(Commelinaceae). Vị trí của chi Callisia Loefl. trong hệ thống phân loại thực vật được
tóm tắt như sau [1]:
Giới: Plantae
Ngành: Angiospermae (Ngọc lan)
Lớp: Monocotyledones (Hành)
Phân lớp: Commelinidae
Bộ: Commelinales

Họ: Commelinaceae
Chi: Callisia Loefl.
Cây Lược vàng còn có tên gọi là Lan vòi, Địa lan vòi, Lan rủ, Bạch tuộc giả khóm…
1.1.2. Đặc điểm chung của chi Callisia Loefl.
Callisia Loefl. là một chi nhỏ thuộc họ Thài lài (Commelinaceae). Chi này
có khoảng 20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bố ở Mexico. Những loài
thuộc chi có dạng thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi là cây một năm. Rễ mảnh,
vài loài có dạng củ. Thân trườn hoặc bò sát. Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn,
không cuống. Cụm hoa dạng xim như tán, xếp xít, không cuống, được bao bọc bởi
lá bắc, hoa mọc ở nách lá hoặc ở ngọn, thường gồm nhiều chùy hoặc gié, đơn vị
được tạo bởi các cặp xim. Lá bắc khó nhận, nhỏ hơn 1 cm; không có lá mo; có các
lá dạng lá bắc tồn tại. Hoa lưỡng tính, đối xứng tỏa tròn; đài rời, gần bằng nhau;
cánh hoa rời, màu trắng hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dài bằng nhau [13].
Đa số các loài thuộc chi Callisia Loefl. được trồng làm cảnh như: Callisia
repens (Jacquin) Linnaeus, Callisia elegans Alexander ex H. E. Moore… Ở Trung
Quốc chỉ có một loài được nhập trồng làm cảnh là Callisia repens (Jacquin)
Linnaeus [12]. Ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy các loài thuộc chi này phân bố
3
trong tự nhiên. Trong vài năm trở lại đây, loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson
được nhập trồng vào nước ta với tên gọi là Lược vàng hay Lan vòi.
1.1.3. Đặc điểm của loài Callisia fragrans (Lindl.) Woodson


Cây Lược vàng


Vòi Lược vàng
Hình 1.1. Cây Lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woodson
Cây thảo nhiều năm, thân mọng nước có thể dài tới 100 cm hoặc hơn, phân
nhánh với thân bò ở gốc. Lá mọc tập trung ở ngọn thân, rải rác ở phía dưới, dạng mác

thuôn, dài 18-25 cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn và
thường có sọc tía. Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chùy dài
tới 60 cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dài 10-15mm;
lá đài trong suốt, màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-6mm; cánh hoa bóng, trong
suốt, màu trắng, mỏng, có dạng trứng hẹp; nhị 6. Cây ra hoa vào mùa xuân [13].
Cây ưa những nơi đất màu mỡ, ẩm, thoát nước tốt và che bóng một phần.
Nếu trồng ở nơi nhiều ánh sáng, lá thường chuyển sang màu tía và thân mọc thấp.
Cây được nhân trồng bằng hạt và cành giâm.
Lược vàng được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá đẹp và dễ
trồng. Người ta thường trồng Lược vàng trong các chậu treo để thân buông rủ tạo
dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà. Do khả năng phát triển
nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực vật nhập
trồng xâm lấn”.
1.2. Công dụng của Lƣợc vàng dùng trong dân gian
1.2.1. Trên thế giới
4
Lược vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) được sử dụng nhiều ở Nga.
Nó được dùng như một cây thuốc dân gian để chữa các bệnh dạ dày-ruột, bệnh túi
mật, lá lách; các bệnh đường đường hô hấp như: ho, viêm họng, viêm phế quản, hen
phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, dị
ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung thư
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây Lược vàng được người dân sử dụng theo kinh nghiệm hoặc
truyền miệng để chữa khỏi (hoặc giảm nhẹ) các bệnh như: viêm răng lợi, sâu răng,
viêm họng, viêm mũi dị ứng, viêm xoang, ho, cảm cúm, viêm phế quản, hen, viêm
tai giữa, thối tai, băng huyết, cầm máu vết thương, bỏng, đau đầu mất ngủ, viêm bờ
mi mắt, đau mắt đỏ,mẩn ngứa, trĩ, đi ngoài, đau dạ dày, táo bón, gút, ung thư vú,
ung thư dạ dày Ngoài ra, Lược vàng còn có hoạt tính chống oxy hóa, chống tiểu
đường, hạ mỡ máu [9]. Người dân sử dụng cây Lược vàng bằng các phương pháp
hết sức đơn giản như:

- Nhai lá, nuốt cả nước lẫn bã;
- Giã nát để đắp vết thương, xoa bóp, dịt băng cầm máu, làm tan máu tụ,
bầm tím;
- Dùng lá, thân cây, vòi và rễ ngâm rượu trắng;
- Phơi khô lá pha nước sôi, nấu nước uống như uống nước chè;
- Nấu thành canh rau trong bữa ăn;
- Nấu cao, sau đó pha loãng uống, bôi da;
- Xay thành nước sinh tố (pha thêm đường, sữa, mật ong ).
1.2.3. Các chế phẩm từ cây Lƣợc vàng
Tại Nga, hiện có rất nhiều dược phẩm-mỹ phẩm bào chế từ cây Lược vàng
đã được bán trên thị trường. Ví dụ:
- Loại kem trị mụn "Basket Plant" (Hình 1.2a);
- Thuốc Callisia Fragrans Drops (Gold Mustach) dùng để chữa đau lưng, viêm
khớp (Hình 1.2b);
- Kem phòng và trị đau gót chân “Foot creme” (Hình 1.2c);
5
- Sản phẩm “Basket Plant with Potentill tube 125 ml” hỗ trợ chữa viêm khớp,
chống oxi hoá, bồi bổ cơ thể (Hình 1.2d);
- Thực phẩm chức năng “BasketPlant Callisia fragrans” hỗ trợ hệ tuần hoàn và
hô hấp (Hình 1.2e);
- Kem bôi “Basket Plant with Sophora 75 ml” dùng chống viêm, giảm sưng
(Hình 1.2f).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)
Hình 1.2. Một số sản phẩm từ cây Lược vàng được bán ở Nga.
Ở Việt Nam cũng đã có một số sản phẩm có chứa cây Lược vàng như:
- Trà túi lọc Thiên Phúc có tác dụng thanh nhiệt, giải độc toàn bộ cơ thể, hỗ
trợ và ngăn ngừa bệnh tật, hỗ trợ rối loạn tiêu hóa, hỗ trợ gan, huyết áp, tiểu
đường, bào mòn sỏi thận, khôi phục viêm đường tiết niệu, tăng cường sinh
lực, làm đẹp da…(Hình 1.3a);
- Trà túi lọc Tâm Lan có tác dụng giải độc cơ thể, thanh nhiệt, điều hòa huyết
áp-tim mạch, suy nhược thần kinh, mất ngủ, thoái hóa đốt sống, ung thư, rối
loạn tiêu hóa, loét hoành tá tràng, trĩ nội, lở loét da, viêm gan, xơ gan, trị các
bệnh về thận, tiểu đường (Hình 1.3b).
6

(a)

(b)
Hình 1.3. Một số chế phẩm từ Lược vàng ở Việt Nam
1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây Lƣợc
vàng
1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học:
 Trên thế giới:
Cho đến nay có một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lược vàng
trong đó phần lớn là công trình của các nhà khoa học Nga. Hầu hết các công bố đều
được thực hiện trong khoảng 5 năm trở lại đây, điều đó chứng tỏ cây Lược vàng
mới được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Đầu tiên phải kể đến nghiên cứu của TS. Olennikov, Viện Sinh họcThực
nghiệm-Viện Hàn lâm Khoa học Nga về thành phần các chất phenolic trong cây

Lược vàng. Nhóm nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc của các axit gallic,
axit caffeic, axit chicoric, axit ferulic, các flavonoids (quercetin, kaempferol),
coumarins (umbelliferon, scopoletin) và antraquinons (aloe-emodine). Những hợp
chất này được biết có nhiều hoạt tính sinh học hấp dẫn như chống oxi hoá, kháng
viêm, chống ung thư,chữa tiểu đường, điều hoà miễn dịch…[19].

Axit galic


Axit caffeic


Axit chicoric
7

Aloe-emodin Umbelliferon Scopoletin

Quercetin Kaempferol

Hình 1.4. Các hợp chất phenolic từ cây Lược vàng
Khi nghiên cứu về thành phần axit amin bằng cách phân tích, so sánh thời
gian lưu với 24 amino axit chuẩn, nhóm nghiên cứu của TS. Nikolaeva đã phát hiện
thấy trong dịch ép thân và lá tươi cây Lược vàng có chứa 15 axit amin tự do (6 axit
amin cần thiết) và 14 axit amin liên kết (7 axit amin cần thiết) bao gồm: Asparagin,
Axit aspartic, Threonin, Serin, Glutamin, Axit glutamic, Glycin, Anilin, Methionin,
Leucin, Isoleucin, Tyrain, Phenylalanin, Arginin, và Axit γ-aminobutyric. Ngoài ra
thành phần vô cơ cũng được khảo sát và kết quả phù hợp với công bố của TS.
Olennikov trước đó [18].
Một nghiên cứu của Viện Hoá thực vật, Viện Khoa học Uzebekistan cho thấy
lá và thân Lược vàng chứa nhiều dầu béo gồm các axit béo trung tính như

hydrocarbon parafin, olefin và hydrocarbon thơm; carotenoid; sterol triterpen
axetate, triacylglycerids, axit béo tự do, triterpenol, triterpenic axit và chlorophyl;
các glycolipid: sulfolipids, digalactosyldiglyceride, sterolglycoside, cerebroside và
monogalactosyldiglyceride; nhóm phospholipid:phosphatidylinosite (PI),
phosphatidylcholine(PC), phosphatidyl ethanolamine (PE),
phosphatidylglycerine(PG), phosphatidic axit (PA). Nhóm nghiên cứu cũng phát
hiện thấy các vitamin C, PP và B2 cũng như các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cr, Ni
và Cu trong nước ép Lược vàng. Bằng phương pháp định tính trên sắc ký lớp mỏng,
8
nhóm nghiên cứu cũng phát hiện ra sự có mặt của các sterol cũng như các
triterpenol, các chất màu như carotenoit, xanthophyl và chlorophyl [11].

Ở Việt Nam:
Ở trong nước, các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của cây Lược vàng cũng chỉ mới được thực hiện trong những năm gần đây. Năm
2008, nhóm nghiên cứu của TS. Trịnh Thị Điệp tại Viện Dược liệu đã định tính sơ
bộ thành phần hoá học của thân, lá Lược vàng và cho biết chúng có chứa flavonoit,
carotenoit, phytosterol, axit hữu cơ, chất béo, đường tự do và polysacharit [9]. Tiếp
đó, nhóm nghiên cứu đã phân lập và xác định được một số hợp chất sterol
(stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside),
một hợp chất cerebosit (2-amino-1,3,4-octadecanetriol-N-(2-hydroxyhexacosanoyl)
(Hình 5) [4]. Các kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của một Luận án
Thạc sĩ tại trường ĐH Đà Nẵng[3].






Hình 1.5. Cấu trúc của một số hợp chất sterol và cerebosit chiết từ cây Lược vàng

Mới đây, nhóm nghiên cứu của GS. Châu Văn Minh - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được hợp chất Isoorientin từ dịch chiết
metanol của cây Lược vàng trồng ở Việt Nam (Hình1.6) [9]. Hợp chất Ginsenoside
Rg1, một trong những chất saponin quan trọng trong các cây thuộc chi Nhân sâm
9
(Panax), cũng đã được phát hiện trong cây Lược vàng [6]. Ngoài ra, trong cây Lược
vàng axit amin L-tryptophan cũng đã được phân lập và xác định cấu trúc [5].




Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Isoorientin, L-Tryptophan và Ginsenoid Rg1.
1.3.2. Các nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý:
Mặc dù cây Lược vàng được sử dụng rất rộng rãi ở Nga và Việt Nam trong
việc hỗ trợ và chữa trị các bệnh như: ung thư, bỏng, viêm nhiễm, lao phổi, bệnh tim
mạch… Tuy nhiên tác dụng dược lý của cây này lại chưa được nghiên cứu nhiều.
TS. Misin đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cây Lược vàng và đã
xác định được rằng thành phần chống oxy hóa chiếm 73,2% và 119,3 mg/l trong
dịch chiết lá và thân tươi tương ứng [17].
Công bố của nhóm nghiên cứu TS. Shantanova, Viện Sinh học Thực nghiệm
Nga cũng chứng tỏ tác dụng hạ nồng độ malondialdehyde (MDA-sản phẩm của quá
trình peroxy-hoá lipid) của nước ép búp non Lược vàng trên động vật thực nghiệm
[23]. Nghiên cứu này cũng cho thấy dịch ép nước có tác dụng tăng hoạt động của
cơ, liều uống 1 lần 10,0 mL/kg sẽ tăng khả năng chạy lên 21% so với nhóm kiểm
soát. Sự gia tăng đáng kể trong độ bền sau khi lặp đi lặp lại việc cho chuột thử
10
nghiệm với liều là 5,0 mL/kg trong 7 ngày. Thời gian chạy tăng lên gần gấp ba lần
so với nhóm kiểm soát.
Một nhóm các nhà khoa học tại trường ĐH Ben-Gurion, Israel đã cho thấy
dịch chiết cồn lá Lược vàng có tác dụng ức chế virus HSV-1 và HSV-2 ở nồng độ

EC
50
là 16,5 và 15 µg/mL. Trong khi đó dịch chiết nước không có tác dụng với
HSV-1 và HSV-2 nhưng có tác dụng với chủng VZV với liều EC
50
là 17 µg/mL
[21].
Ngoài các nghiên cứu về tác dụng dược lý, đáng chú ý là nghiên cứu của một
nhóm nghiên cứu tại trường ĐH Griffith, Úc đăng trên tạp chí Veterinary
Dermatology về khả năng gây viêm da tiếp xúc trên chó thí nghiệm của dịch chiết
nước cây Lược vàng. Nghiên cứu này đã chứng minh dịch chiết nước cây Lược
vàng có khả năng gây viêm da tiếp xúc trên chó thí nghiệm [16].
Ở nước ta, mới đây nhóm nghiên cứu của TS. Trịnh Thị Điệp tại Viện Dược
liệu đã xác định được liều độc cấp LD
50
của cao đông khô dịch ép lá và cao etanol
50% thân Lược vàng là 18,5 g và 21,3 g cao/kg thể trọng tương đương 1075,6 và
1115,2 g nguyên liệu tươi/kg thể trọng chuột nhắt. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cho
thỏ uống liên tục 60 ngày cao đông khô dịch ép lá liều tương đương 6; 18; 60 g lá
tươi và cao etanol 50% thân Lược vàng liều tương đương 1,2; 3,6 và 12,0 g thân
Lược vàng tươi/kg/ngày gây ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê đến các chỉ số
huyết học và chức năng gan, thận và chức năng tạo máu so với đối chứng sinh lý.
Tuy nhiên, với liều sử dụng một số cá thể có hiện tượng gan bị viêm khoang cửa và
xung huyết cầu thận [7]. Nhóm nghiên cứu này cũng chứng minh 2 cao này có tác
dụng chống viêm mạn rõ rệt trên mô hình chuột gây u hạt bằng amian. Các mẫu
nghiên cứu ở liều 0,2; 0,4 g cao đông khô lá và 0,023; 0,046 và 0,092 g cao etanol
50% thân Lược vàng/kg thể trọng cũng có tác dụng giảm đau ngoại biên nhưng lại
không thể hiện rõ ràng tác dụng giảm đau theo chơ chế thần kinh trung ương ở cùng
mức liều sử dụng. Ở các mức liều này Lược vàng cũng có tác dụng chống oxi hoá
trên mô hình chuột nhắt trắng, cụ thể hàm lượng MDA trong gan chuột giảm tới

43,24 và 56,59% so với lô đối chứng bệnh lý [8]. Trước đó, nhóm nghiên cứu này
cũng đã chỉ ra rằng với liều 50 g nguyên liệu tươi/kg thể trọng, cao chiết nước từ lá
11
và cao chiết nước cồn từ thân không có tác dụng giảm phù nề trên chuột thực
nghiệm. Tuy nhiên,
chủng Staphylococcus aureus [2].

12
Chƣơng II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu cây Lược vàng được thu hái ở trung tâm giáo dục - lao động xã hội Hải
Phòng (Xã Gia Minh, huyện Thủy Nguyên) vào tháng 9/2012. Cây được tách riêng
thân, vòi và lá. Sau đó phơi khô, thái thành các đoạn nhỏ dài khoảng 2-3cm rồi đem
nghiền thành bột mịn và được bảo quản trong túi ni lông ở nơi khô ráo. Mẫu dược
liệu được TS. Trần Thế Bách - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định tên khoa
học là Callisia fragrans (Lindl.) Woodson họ Thài lài (Commelinaceae). Mẫu tiêu
bản số LV 01 được lưu tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc - Viện Hóa
sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất và thuốc thử
- Dung môi: axeton, n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol.
- Thuốc thử ceri sulfat.
- Bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F
254
có độ dày 0,2 mm của hãng
Merck.
- Pha tĩnh dùng cho sắc kí cột là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230 -
400 (Mesh) của hãng Merck và Sephadex LH-20 (Sigma).
- Dung môi đo phổ là metanol-d
4
.
2.1.3. Thiết bị và máy móc sử dụng trong nghiên cứu
- Tủ sấy dược liệu SHELLAB.
- Cân phân tích PRESICA.

- Cân kĩ thuật.
- Máy cất quay chân không BUCHI ROTAVAPOR .
- Cột sắc ký bằng thủy tinh.
- Đèn soi UV (λ = 254 nm).
- Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz.
- Máy đo phổ khối Agilent 1120.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy BUCHI melt point B-545
13
- Kính hiển vi Scopetek CT-1
- Các dụng cụ: bình nón, lọ thủy tinh, pipet, ống đong, bình cầu…
2.2. Nội dung nghiên cứu
Khóa luận này tập trung nghiên cứu về thành phần hóa học của vòi cây Lược
vàng (Callisia fragrans (Lindl.) Woodson) theo các mục tiêu sau:
- Phân tách các chất trong cắn chiết bằng dung môi etyl axetat;
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất
Mẫu thực vật sau khi đã sấy khô và nghiền nhỏ được chiết bằng phương
pháp ngâm ở nhiệt độ phòng trong metanol 3 lần. Từ dịch chiết metanol này sẽ
điều chế các cắn chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo phương
pháp chiết phân bố.
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập chất sạch
Để phân tích và phân tách các cắn chiết của cây cũng như phân lập các
chất sạch sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký
cột thường (CC) dưới trọng lực dung môi với pha tĩnh là silica gel và Sephadex
LH-20.
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica
gel 60 F
254
. Dung môi triển khai sắc kí là hỗn hợp của một số trong số các dung

môi thường dùng như: n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol.
Sắc kí cột chủ yếu dùng cột thường với pha tĩnh là silica gel, rửa giải với
các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol… với pha tĩnh là
Sephadex LH-20 thì rửa giải bằng dung môi metanol và hỗn hợp
metanol/diclometan.
 Cột silica gel:
- Tiến hành nhồi cột:
14
+ Phương pháp nhồi cột ướt: Silica gel (cỡ hạt 40-60µm) được khuấy, ngâm
trong dung môi phù hợp cho thấm đều (khoảng 1 giờ). Rót từ từ dung dịch silica gel
đã thấm ướt theo thành cột (đã được lót một ít bông ở dưới đáy), vừa rót vừa gõ nhẹ
vào thành cột để silica gel phân bố đều trong cột. Ổn định cột bằng cách dùng bơm
áp lực nén dung môi qua cột cho tới khi thấy cột silica gel trong đồng nhất.
+ Phương pháp nhồi cột khô: Silica gel (cỡ hạt 40-60µm) được cho từ từ lên
cột (đã được lót ở đáy một ít bông), vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột. Sau đó cho
dung môi lên và ổn định cột bằng cách dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho
tới không còn bọt khí ra khỏi cột nữa. Sau khi dung môi chảy gần sát bề mặt silica
gel thì cho chất lên cột.
- Tiến hành cho chất lên cột trước khi chạy sắc ký: tùy vào lượng chất và dạng chất
mà có thể chọn 2 cách:
+ Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: Nếu hỗn hợp chất cần tách tan trong dung
môi đầu tiên triển khai cột thì chất được hòa tan hoàn toàn vào một lượng tối thiểu
dung môi này rồi dùng pipet hút chất và nhẹ nhàng bơm lên đầu cột sao cho không
làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt.
+ Nạp mẫu chất ở dạng bột khô: hòa tan chất vào một lượng tối thiểu dung
môi thích hợp rồi tẩm lên một lượng tối thiểu silica gel,sau đóđể bay hơi hết dung
môi đến khô thu được dạng bột tơi.
- Chạy sắc ký: Tiến hành chạy cột với hệ dung môi được lựa chọn. Hứng dịch
rửa giải vào những bình (lọ) với lượng thích hợp, sau đó chấm sắc ký lớp
mỏng để tiến hành gộp các phân đoạn giống nhau.

 Cột Sephadex LH-20
Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt: chuẩn bị cột thủy tinh
khô, được lót một ít bông ở đáy.Sephadex LH-20 được ngâm trương nở trong
MeOH (3 giờ) rồi rót từ từ vào cột và để ổn định cột trong vòng 24 giờ (cột được tái
sử dụng nhiều lần sau khi nhồi). Hòa tan cắn chất cần tách với hệ dung môi thích
hợp, sau đó đưa lên cột bằng pipet và tiến hành rửa giải các chất. Hứng dịch rửa giải
vào những bình (lọ), sau đó tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng để gộp các phân đoạn
giống nhau.
15
2.3.3. Kỹ thuật kết tinh
Các bước của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hòa tan hoàn toàn
hợp chất rồi để kết tinh ở nhiệt độ thích hợp (thường ở nhiệt độ lạnh), gạn hoặc lọc
tinh thể ra khỏi dịch cái và để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong vòng 1-2 h.
Sau đó,làm khô tinh thể dưới áp suất giảm trong 30 phút trước khi đem đi xác định
điểm chảy hay phân tích quang phổ. Trong đó, lựa chọn dung môi thích hợp có tầm
quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh.
2.3.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp của các dữ kiện thu
được từ các phương pháp phổ như: phương pháp phổ khối (ESI-MS) và các phương
pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân,gồm phổ một chiều (
1
H NMR,
13
C NMR và
DEPT) và phổ 2 chiều (HSQC, HMBC).
2.3.4.1. Phổ khối lượng (MS):
Phổ khối là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định
khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]
+

hay các ion giả phân tử [M+H]
+
và [M-H]
-
…từ đó xây dựng công thức phân tử.
Phổ khối lượng sử dụng phương pháp ion hóa bằng phun mù điện tử (ESI-
MS) trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa Học và Công
nghệ Việt Nam.
2.3.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích các hợp chất hóa
học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được
đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan
đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương
tác spin-spin J.
Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy nhãn hiệu Bruker Avance
500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
16
Chƣơng III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lƣợc vàng (Callisia fragrans (Lindl.)
Woodson)
Mẫu vòi cây Lược vàng tươi được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khô rồi sấy ở
50
o
C trong vòng 3h. Sau khi nghiền mẫu khô thành bột thu được 2,6 kg. Nguyên
liệu dưới dạng bột (2,6 kg) được ngâm chiết với metanol ba lần (24h/lần,10L/lần).
Gộp các dịch chiết lại với nhau và cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm đến khi
thể tích còn lại là 2L thấy có kết tủa. Lọc riêng phần kết tủa thu lấy phần dịch. Pha
loãng dịch metanol đã cô đặc bằng nước cất (500 mL) rồi tiến hành chiết phân bố
lần lượt với các dung môi n-hexan và etyl axetat, mỗi dung môi chiết 3 lần
(500mL/lần). Gộp chung dịch của 3 lần chiết và làm khô bằng Na

2
SO
4
khan rồi cất
loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cắn chiết tương ứng là n-hexan
(16,97 g), etylaxetat (7,8 g).
Hàm lượng cắn etyl axetat được tính theo công thức :

Trong đó :
H % : Hàm lượng cắn thu được.
mc : Khối lượng cắn thu được (g).
mdl : Khối lượng dược liệu khô đem chiết (g)
Như vậy, hàm lượng cắn etyl axetat là :





17
Hình 3.1. Quy trình điều chế các cắn chiết từ vòi cây Lược vàng:

3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cắn chiết etyl axetat
Sau khi chiết xuất vòi cây Lược vàng theo quy trình trên, chúng tôi thấy cắn n-
hexan có dạng keo lỏng màu xanh đen rất nhớt, cắn etyl axetat có dạng keo đặc màu
nâu đen và cắn metanol có dạng keo rắn màu nâu đen. Kết quả khảo sát sơ bộ ban
đầu cho biết các thành phần chính của mẫu tập trung chủ yếu ở cắn etyl axetat và
cắn metanol. Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi tập trung phân lập các chất
có trong cắn etyl axetat.
- Pha loãng bằng nước cất (500 mL)
- Phân bố với n-hexan (3 lần, 500 mL/lần)

Dịch chiết MeOH có kết tủa
Dịch n-hexan
Cắn n-hexan
(16,9 g)
Cắn Etyl axetat
(7,8 g)
Bột khô vòi Lƣợc vàng
(2,6 kg)
Phần kết tủa (77g)
Dịch MeOH đặc

- Lọc riêng phần kết tủa

Dịch MeOH/H
2
O
- Làm khô bằng Na
2
SO
4
khan
- Cất loại n-hexan
- Phân bố với EtOAc
(3 lần, 500 mL/lần)
Dịch Etyl axetat
- Làm khô bằng Na
2
SO
4
khan
- Cất loại EtOAc
Dịch MeOH/H
2
O
- Cất loại dung môi
Cắn MeOH
(16,0 g)
- Ngâm chiết bằng MeOH (3 lần, 10 L/lần)
- Cất loại bớt MeOH xuống còn 2 L