Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của bacillus clausii

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



MAM CHANDARA

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU
KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU
SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA
Bacillus clausii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



MAM CHANDARA


KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU
KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU
SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA
Bacillus clausii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
DS. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy
giáo DS. Lê Ngọc Khánh, người đã luôn động viên, hướng dẫn tôi trong thời
gian làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể các
thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, dìu dắt tôi trong suốt
quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
luôn động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2013
Sinh viên

MAM CHANDARA

2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 7
1.1.Vi khuẩn Bacillus…………………………………………………………… 7
1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus ……………………………………………7
1.1.2. Vị trí phân loại………………………………………………………….7
1.1.3. Đặc điểm vi khuản Bacillus…………………………………………………7
1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử……………………………… 8
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus…………………………………… 10
1.2. Giới thiệu về Bacillus clausii………………………………………….11
1.2.1. Đặc điểm sinh thái sinh lý của Bacillus clausii………………………11
1.2.2. Ứng dụng của Bacillus clausii………………………………………14
1.3. Các phương pháp nuôi cấy……………………………………………16
CHƯƠNG 2: : NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị………………………….…… ………17
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất……………………………………………… 17
2.1.2. Máy móc, thiết bị………….………….………………….… ……… 17
2.1.3. Môi trường sử dụng………………………………………………… 17
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………… …….18
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii……………18
3

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18

2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 18
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina……………………18
2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng…………………………………… 18
2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống………………………………………….19
2.3.4. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh
khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác nhau
………………………………………………………………………19
2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng
tăng sinh khối ………………………………………………………19
2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng
tăng sinh khối ……………………………………………………….20
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21
3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii……………21
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối
dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus
subtilis…………………………………………………………………….23
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối
Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……………… 23
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của
Bacillus clausii …………………………………………………………….28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………… ……………………….32
TÀI LIỆU THAM KHẢO


4

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 2.2. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.

Bảng 3.1. Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời
điểm khác nhau.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của
Bacillus clausii ở nhiệt độ 37
0
C.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của
Bacillus subtilis ở nhiệt độ 37
0
C.
Bảng 3.4. So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis
ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37
0
C.
Bảng 3.5. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C của
Bacillus clausii.
Bảng 3.6. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C của
Bacillus subtilis.

Bảng 3.7. So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 30
0
C và 37

0
C
của Bacillus clausii và Bacillus subtilis.

Trang
17
17
21

24

25

27

29

30

31

5

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Bào tử Bacillus subtilis.
Hình 1.2. Bào tử Bacillus anthracis.
Hình 1.3. Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii.
Hình 1.4. Cấu tạo bào tử.
Hình 1.5. Bacillus clausii trên môi trường đặc.

Hình 1.6. Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử.
Hình 1.7. Chế phẩm Enterogermina.
Hình 1.8. Chế phẩm Erceflora.
Hình 1.9. Chế phẩm Bazivic.
Hình 3.1. Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus
clausii.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus
clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37
0
C.
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus
subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37
0
C.
Hình 3.4. Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus
subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37
0
C.
Hình 3.5. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii ở
nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C.
Hình 3.6. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis ở
nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C.

Trang
8
8
9
9
13
13
15
15
15
22

24

26

27

29

30

6

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong đường ruột của con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh
vật với khoảng hơn 100 tỷ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi và vi sinh
vật có hại. Các vi sinh vật có lợi sẽ có tác động tốt cho sức khỏe như tổng hợp
vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giúp
hấp thu tốt hơn và cải thiện sự rối loạn của đường ruột, cũng như tăng cường

sức khỏe, giúp phòng bệnh. Ngược lại, các vi sinh vật gây hại sẽ gây ra những
tác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử ruột, các chất gây
ung thư, tiêu chảy… Trong cuộc sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột dễ
bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn
không vệ sinh… làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và vi
khuẩn có hại, gây nên các bệnh đường ruột trong đó tiêu chảy là một điển
hình. Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ
các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở đường ruột là rất quan trọng.
Sử dụng chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm mục đích
bổ sung, cân bằng lại vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp
phòng và chữa bệnh tiêu chảy. Trong các Probiotic thì chế phẩm
Enterogermina thực sự nổi bật, là chế phẩm duy nhất chứa bào tử Bacillus
clausii kháng đa kháng sinh, và do sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua
dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả. Tuy
nhiên việc nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii còn ít được quan
tâm. Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh
khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii” được thực hiện nhằm
giải quyết mục tiêu:
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối
dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus
 Từ Bacillus theo tiếng Latinh có nghĩa là hình que, do đó Bacillus còn
được gọi là trực khuẩn. Chi Bacillus gồm rất nhiều loài đã được biết đến như:
Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii,
Bacillus natto, Bacillus clausii [15].

 Do sự đa dạng về loài trong chi Bacillus, trực khuẩn có thể sống và
được phân lập trong các môi trường khác nhau, từ đất, nước, không khí, côn
trùng và con người.
1.1.2. Vị trí phân loại
 Theo như Bergey’s manual of Systematic of Bacteriology 2
nd
edition,
2004 thì chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae là một trong 4 họ thuộc bộ
Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn.
 Việc phân loại vi khuẩn theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằng
việc giải trình tự gen 16S r.ARN. Theo phương pháp này người ta thấy
Bacillus có mối quan hệ họ hàng với một số loại vi khuẩn không hình thành
nội bài tử như Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus ở cấp phân loại
bộ và có mối quan hệ với Literia và Staphylococcus ở cấp phân loại họ.
 Chi Bacillus bao gồm trên 400 loài (476 loài).
1.1.3. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus
 Vi khuẩn Bacillus có hình que, thường là Gram dương, có khả năng di
động, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase
dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trong quá trình trao đổi
chất.
8

 Về dinh dưỡng và sinh trưởng, Bacillus có thể sử dụng các hợp chất
hữu cơ đơn giản như các loại đường, acid amin và các acid hữu cơ. Trong một
số trường hợp chúng lên men cacbohydrat qua một loạt các chuỗi phản ứng
phức tạp tạo ra glycerol và các glutadiol.
 Phần lớn Bacillus sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30- 45ºC, pH khác
nhau, dao động từ 2-11.
 Khả năng hình thành bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng
của chi Bacillus.

1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử
 Bào tử (nội bào tử) của chi Bacillus được miêu tả lần đầu năm 1872
bởi Ferdinand Cohn khi nghiên cứu Bacillus subtilis và sau này của Koch khi
nghiên cứu mầm bệnh than do vi khuẩn Bacillus anthracis năm 1976 [12].

Hình 1.1. Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2. Bào tử Bacillus anthracis
Bào tử thường có dạng hình cầu hoặc elip, kích thước 0,8 - 1,4 µm chiều
dài, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng khi điều kiện sống
không thuận lợi. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử lại nảy mầm phát triển
thành tế bào sinh dưỡng.
 Sự hình thành nội bào tử qua các bước:
- Trong tế bào sinh dưỡng ADN được phân chia thành nhiễm sắc thể
(chromosom) riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào.
9

- ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bào tử
(nha bào) được hình thành và một phần vỏ cũng được hoàn thành.
- Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN.
- Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài tế bào [1].


Hình 1.3. Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii
 Quá trình hình thành bào tử rất phức tạp, mất khoảng 6-8 giờ, để có
thể tạo ra bào tử có cấu trúc vững bền chịu được hoàn cảnh khắc nghiệt.
 Đặc điểm bào tử vi khuẩn:

Hình 1.4. Cấu tạo bào tử
- Cấu trúc bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi
chứa ADN, các lớp bao bọc (gồm màng bào tử, thành bào tử, vỏ bào tử, áo
bào tử gồm 2 lớp áo trong và áo ngoài) chiếm tới 50% thể tích bào tử.

Tế bào sinh dưỡng
Sự phát triển
của áo bào

Áo bào tử
Bào tử tự do
Tế bào mẹ
Áo trong bào tử
Vỏ bào tử
Màng tế bào
Thành tế bào
Lõi
Màng ngoài
Áo ngoài bào tử
10

- Vỏ bao chứa thành phần hóa học là protein, hydratcarbon, lipid,
peptidoglycan và calci dipicolinat.
- Lõi bào tử chứa lượng nước rất thấp cùng với calci dipicolinat. Lượng
calci dipicolinat này mất đi khi bào tử nảy mầm. Ngoài ra, bào tử còn chứa
nhiều enzym ở dạng không hoạt động và chỉ bắt đầu hoạt động khi bào tử nảy
mầm [1].
 Tính chất bào tử
Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất
thẩm thấu [6].
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus
Trong số các loài thuộc chi Bacillus, có 2 loài gây bệnh nguy hiểm cho
con người, đó là Bacillus anthracis gây bệnh than và Bacillus cereus gây ngộ
độc thực phẩm. Nhưng mặt khác, vi khuẩn Bacillus có rất nhiều ứng dụng
trong đời sống.

 Trong nông, lâm, ngư nghiệp :
- Chế tạo chế phẩm diệt côn trùng (bọ cánh cứng, bướm, ruồi, muỗi …)
từ các loài như Bacillus thuringiensis, Bacillus popiliae do các loài này có
khả năng xâm chiếm cơ thể côn trùng và sinh ra nội độc tố diệt côn trùng. Chế
phẩm sinh học tạo ra có khả năng diệt trừ sâu hại cao và ít gây ô nhiễm môi
trường.
- Tạo ra các chế phẩm sinh học từ các loài Bacillus subtilis, Bacillus
megatherium, Bacillus lichenliformis (chế phẩm Biochie) ứng dụng trong xử
lý nước nuôi thủy sản, có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, cải thiện môi
trường nước.
11

- Sản phẩm từ Bacillus subtilis có tác dụng hỗ trợ cây trồng, bổ sung
dinh dưỡng cho đất qua chu kỳ cacbon và chu kỳ nitơ của vi sinh vật, đồng
thời chống lại các vi sinh vật khác gây bệnh cho cây.
 Trong công nghiệp:
- Chất tẩy rửa: sử dụng enzym protease pH kiềm.
- Công nghiệp thuộc da.
 Trong dược phẩm, thực phẩm chức năng:
- Tạo ra các chế phẩm probiotic chống loạn khuẩn đường ruột, nhất là
sau khi sử dụng kháng sinh dài ngày.
- Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng một chủng Bacillus đơn độc
(Biosubtyl II chứa Bacillus subtilis của công ty vắc xin và sinh phẩm số 2),
hoặc kết hợp Bacillus với loài vi khuẩn có lợi khác (Bio-acimin).
1.2. Giới thiệu về Bacillus clausii
1.2.1. Đặc điểm sinh thái sinh sinh lý của Bacillus clausii
- Đặc điểm phân loại: Bacillus clausii thuộc
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus

Loài: Bacillus clausii
- Đặc điểm phân bố
Bacillus clausii chủ yếu phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất,
có thể là vườn (Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus clausii DSM8716,
ATCC31084…), hoặc đất sét (Bacillus clausii DSM 9784…). Ngoài ra có thể
tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước (Bacillus clasausii MB được phân lập
từ mẫu nước vùng biển phía đông Ấn Độ), trong bùn… [6].
12

- Đặc điểm hình thái
Bacillus clausii có hình que đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi
khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục.
Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2µm, chiều dài 5µm [9].
- Cấu trúc bộ gen
 Bacillus clausii có cấu trúc bộ gen là một vòng tròn nhiễm sắc thể,
nhiễm sắc thể này gồm 4.303.871 nucleotide, gen này chứa 4.204 gen, trong
đó 4096 là protein mã hóa và mã hóa cho 96 RNA.
 Các nucleotid loại GC trong ADN của Bacillus clausii chiếm tỷ lệ cao
nhất so với các Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM- K16 và chiếm tới
49% với chủng GMBAE 42 [8], [18].
- Điều kiện nuôi cấy
Nhu cầu oxy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình
nuôi cấy cần có sự cấp khí.
Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50
o
C. Mỗi chủng có
nhiệt độ tối ưu riêng như: Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ tối ưu là
30
o
C, chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40

o
C, Bacillus
clausii ATCC 31084 có nhiệt độ tối ưu là 37
o
C…[6], [11].
Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7-10,5. Chủng Bacillus
claussii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [11].
Về dinh dưỡng: Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn carbohydrat
khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2-ketogluconat…;
nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng…
Trong môi trường lỏng (canh thang): Bacillus clausii có thể kết thành
chuỗi hoặc dạng tế bào đơn độc. Trong môi trường đặc (thạch thường): tạo
khuẩn lạc màu trắng, viền hơi nhăn.
13


Hình 1.5. Bacillus clausii trên môi trường đặc
- Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và
tinh bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Vi
khuẩn Bacillus clausii cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat
thành nitrit.
- Bào tử và khả năng tạo bào tử
Trong điều kiện không thuận lợi, Bacillus clausii hình thành nội bào tử
(endospore) theo cơ chế và cấu trúc bào tử gồm nhiều lớp vỏ bọc bền vững
giống như các Bacillus khác. Bào tử của Bacillus clausii có dạng hình cầu,
kích thước 1,01±0,13 x 0,57± 0,05 μm [12].
Hình 1.6. Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử

14

1.2.2. Ứng dụng của Bacillus clausii
Bacillus clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản
xuất chế phẩm probiotic.
- Sản xuất enzym từ Bacillus clausii
Bacillus clausii có khả năng sản xuất nhiều loại enzym như: xylanase,
cellulase, amylase, và protease… Trong các enzym này quan trọng nhất là
protease. Đây là nhóm enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số các
enzym trên thế giới. Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như
chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, thực phẩm… Protease cũng có thể được
sử dụng với mục đích thủy phân protein dạng sợi như sừng, lông và tóc [7].
- Sản xuất chế phẩm probiotic từ bào tử Bacillus clausii
Bào tử Bacillus clausii được sử dụng trong sản phẩm Enterogermina
(Sanofi - Aventis) – một chế phẩm probiotic có tác dụng hữu hiệu trong điều
trị tiêu chảy ở trẻ em. Enterogermina chứa bào tử vi khuẩn Bacillus clausii
dưới 2 dạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tỷ bào tử trong 5ml) và dạng
viên nang (2 tỷ bào tử trong 1 viên nang). Enterogermina được chỉ định trong
các trường hợp:
• Ðiều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kém
hấp thu vitamin nội sinh.
• Ðiều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi
dùng thuốc kháng sinh hoặc hóa trị liệu.
• Rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn
khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin.
Bacillus clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng
sinh nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinh. Chế
15

phẩm sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm là vi khuẩn qua
dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả.


Hình 1.7. Chế phẩm Enterogermina
Chế phẩm Enterogermina chứa bốn loài Bacillus clausii, mỗi loài kháng
một số loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R kháng
novobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng streptomycin và
neomycin [17].
Ngoài Enterogermina chứa bào tử Bacillus clausii còn một số chế phẩm
khác chứa Bacillus clausii như: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin,
Enterum

Hình 1.8. Chế phẩm Erceflora Hình 1.9. Chế phẩm Bazivic

16

1.3. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
 Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả
năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát
triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển
đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục
đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất
tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt
cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia
là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều,
không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ
các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên

liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ
((NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
CO
3
), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh
trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu [2].
 Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu
trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng
nguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose. Thực tế, trong một số
trường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường
maltose được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt
nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí [2]. Phương pháp nuôi cấy
chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh
trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá
trình nuôi cấy [2]
17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT,
THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất
Xuất xứ
Natri clorid
Trung Quốc
Pepton
Trung Quốc
Cao thịt
Trung Quốc
2.1.2. Máy móc, thiết bị
Bảng 2.2. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị
Xuất xứ
Thiết bị
Xuất xứ
Tủ cấy
Sony clean bench (Nhật)
Tủ lạnh
Toshiba (Nhật)
Máy ly tâm
Rotofix (Đức)
Tủ sấy
Memmert (Đức)
Nồi hấp
ALP (Nhật)
Tủ lắc
Bioshake (Đức)
Đầu côn, cân kỹ thuật, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, que trang,
giấy lọc

2.1.3. Môi trường sử dụng
Môi trường canh thang

Môi trường thạch thường
Hóa chất
Khối lượng (g)

Hóa chất
Khối lượng (g)
Natri clorid
0,5

Natri clorid
0,5
Cao thịt
0,5

Cao thịt
0,5
Pepton
1,0

Pepton
1,0
Nước máy
vừa đủ 100 ml

Thạch bột
2,0

Nước máy
vừa đủ 100 ml
18

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh
khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh
khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối
Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina
Pha 50 ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml, đậy
bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 1atm trong vòng 15 phút, để
nguội đến nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy giống Bacillus clausii từ chế phẩm
Enterogermina vào bình nón trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở
37°C, 150 vòng/phút trong 24h. Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi
trường.
Đối với Bacillus subtilis tiến hành cấy giống từ thạch nghiêng và nuôi
cấy tương tự với Bacillus clausii.
2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường thạch thường, đun sôi cho đồng nhất các thành phần
trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín, hấp tiệt trùng
ở 1atm trong 15 phút. Để nguội bớt rồi đặt nghiêng. Dùng que cấy vô trùng,
cấy giống Bacillus clausii trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng
theo hình ziczac trong tủ cấy vô trùng, để trong tủ ấm 37°C, trong khoảng

24h. Sau khi khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnh.
Định kỳ 2 tháng cấy truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn.
19

Đối với Bacillus subtilis tiến hành tương tự với Bacillus clausii.
2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống
Chuẩn bị 50ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml.
Hấp tiệt trùng ở 1atm trong 15 phút. Để nguội, dùng đầu côn đã hấp tiệt
khuẩn hút 5ml trong bình chứa giống Bacillus clausii cấy vào môi trường. Để
trong máy lắc 150 vòng/phút ở 37
0
C trong 24h.
Đối với Bacillus subtilis, tiến hành tương tự với Bacillus clausii.

2.3.4. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng
sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác
nhau
Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang, hấp tiệt trùng ở 1atm
trong 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Cấy 5ml dịch nhân giống
Bacillus clausii vào môi trường đã chuẩn bị, đem lắc ở 37
0
C, 150 vòng/phút
trong máy lắc. Tại các thời điểm khác nhau (16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h,
88h, 96h), lẫy mẫu dịch lên men đem ly tâm, thu cắn ở tốc độ 4000 vòng/phút
trong 15 - 20 phút . Cân khối lượng cắn thu được để xác định lượng sinh khối,
từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii.
2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả
năng tăng sinh khối
Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang, hấp tiệt trùng ở 1atm
trong 20 phút. Cấy 5 ml dịch nhân giống Bacillus clausii vào môi trường đã

chuẩn bị, đem lắc ở 37
0
C với ba tốc độ lắc khác nhau là 100, 150 và 200
vòng/phút trong máy lắc. Sau thời gian 24h đem ly tâm dịch lên men, thu cắn
ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút. Xác định lượng sinh khối ướt
bằng cách cân cắn thu được. Mỗi thí nghiệm làm 3 lần để lấy kết quả trung
bình. Tiến hành so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.
20

2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả
năng tăng sinh khối
Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang, hấp tiệt trùng ở 1atm
trong 20 phút. Cấy 5 ml dịch nhân giống Bacillus clausii vào môi trường đã
chuẩn bị, đem lắc ở hai nhiệt độ khác nhau 30
0
C và 37
0
C với cùng một tốc độ
trong máy lắc. Sau thời gian 24h đem ly tâm dịch lên men, thu cắn ở tốc độ
4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút. Xác định lượng sinh khối bằng cách cân
cắn thu được. Mỗi thí nghiệm làm 3 lần để lấy kết quả trung bình. Tiến hành
so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.
21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Mục đích
Xây dựng đường cong sinh trưởng, xác định thời điểm thu sinh khối của
Bacillus clausii cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Tiến hành

Trong bình nón chứa 50ml môi trường canh thang, hoạt hóa giống từ chế
phẩm Enterogermina theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.1. Nuôi trong máy
lắc 150 vòng/phút ở 37
0
C trong 24h thu được dịch nhân giống. Cấy 5ml dịch
nhân giống vào 50ml môi trường canh thang đã hấp tiệt trùng và để nguội đến
nhiệt độ phòng, nuôi cấy trong máy lắc ở 37
0
C, 150 vòng/phút. Tại các thời
điểm khác nhau (16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h, 88h, 96h), ly tâm dịch lên men
thu sinh khối, cân sinh khối để xây dựng đường cong sinh trưởng
- Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời điểm
khác nhau
Thời điểm (h)
16 24 40 48 64 72 88 96
Lượng sinh khối (g)
0,84 0,98 1,10 1,09 1,02 0,97 0,92 0,92
Chênh lệnh sinh khối
(%) so với thời điểm
24h
16,0 0 12,0 11,2 4,0 1,0 6,5 6,5

22


0
0.2
0.4
0.6

0.8
1
1.2
0 16 24 40 48 64 72 80 96
Thời điểm (h)
Lượng sinh khối (g)

Hình 3.1. Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Nhận xét
Dựa vào đường cong sinh trưởng, ta nhận thấy thời điểm từ 16 – 40h
lượng sinh khối của B. clausii tăng dần theo thời gian. Lượng sinh khối thu
được lớn nhất là 1,10g tại thời điểm 40h (lớn hơn 12% so với 24h). Kể từ giờ
thứ 40, lượng sinh khối giảm dần, đạt thấp nhất là 0,92g tại thời điểm 88 –
96h (ít hơn 6,5% so với 24h). Kết quả này tương tự với kết quả của Nguyễn
Thị Bích Ngọc [3] khi cho thấy sinh khối tăng nhanh theo thời gian tại thời
điểm 24 – 36h đầu. Theo một công bố khác của Nguyễn Thị Hiền [4], bào tử
bắt đầu xuất hiện sau 40 – 48h nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tự
nhiên (môi trường không bổ sung Mn
2+
, không xử lý nhiệt để thu bào tử).
Trong nghiên cứu này, hiện tượng lượng sinh khối của Bacillus clausii tại thời
điểm 40h bắt đầu giảm dần so với giá trị lớn nhất cũng có thể được giải thích
dựa vào đặc điểm hình thành bào tử của chúng.
Hơn nữa, cũng theo Nguyễn Thị Hiền [4], nếu có phương pháp xử lý phù
hợp thì hoàn toàn có thể chuyển dạng tế bào sinh dưỡng thành bào tử với hiệu
suất rất cao. Do đó, trong nghiên cứu này, việc khảo sát điều kiện để thu được
lượng bào tử lớn nhất được đưa về khảo sát điều kiện để thu được lượng sinh
88
23

khối lớn nhất. Đối chiếu với kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, lượng sinh khối thu
được tại thời điểm 40h là nhiều nhất, sau 40h một lượng sinh khối đã chuyển
thành dạng bào tử. Khi so sánh với lượng sinh khối thu được tại thời điểm
24h, sự chênh lệch này là không quá lớn (12%). Chính vì vậy, để tiết kiệm
thời gian, môi trường dinh dưỡng và thuận tiện cho việc lấy mẫu nghiên cứu,
thời điểm 24h được lựa chọn để thu sinh khối cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh
khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh
khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, Bacillus clausii thuộc nhóm vi
khuẩn hiếu khí. Đối với các vi sinh vật hiếu khí nói chung cũng như chi
Bacillus nói riêng, lưu lượng khí cung cấp trong quá trình nuôi cấy đóng vai
trò rất quan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Với mục đích
thu được lượng bào tử nhiều nhất được đưa về khảo sát điều kiện tạo sinh
khối lớn nhất nên các thí nghiệm dưới đây nhằm mục tiêu khảo sát ảnh hưởng
của tốc độ cấp khí của máy lắc đến lượng sinh khối thu được trong quá trình
lên men Bacillus clausii ở quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời so sánh với
Bacillus subtilis (là chủng vi khuẩn Bacillus phổ biến) tại cùng điều kiện.
- Tiến hành
Trong bình nón chứa 50ml môi trường canh thang, hoạt hóa giống từ
chế phẩm Enterogermina theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.1. Nuôi trong
máy lắc 150 vòng/phút ở 37
0
C trong 24h thu được dịch nhân giống. Cấy 5ml
dịch nhân giống vào 50ml môi trường canh thang đã hấp tiết trùng và để
nguội đến nhiệt độ phòng. Lựa chọn điều kiện nhiệt độ cho các lô lên men là
37
0
C với tốc độ lắc khác nhau là 100, 150 và 200 vòng/phút trong thời gian

24h.