Nghiên cứu khả năng tạo bacteiocin của vi khuẩn lactobacillus acidphilus

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI





PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO
BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ









HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG



NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO
BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




Ngƣời hƣớng dẫn:
DS. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược






HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh, người

đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn
thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã đóng góp nhiều ý
kiến quí báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài.
Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh
chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình
nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những
người luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!



Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Phạm Nguyên Phương
MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Khái quát về bacteriocin
3
1.1.1. Vài nét về lịch sử
3
1.1.2. Phân bố

3
1.1.3. Danh pháp và phân loại
3
1.1.4. Tình hình nghiên cứu
4
1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic
6
1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
6
1.2.2. Phân loại
7
1.2.3. Tính chất
8
1.2.4. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng
9
1.2.5. Đánh giá hoạt tính bacteriocin
11
1.2.6. Chiết xuất và tinh chế
11
1.2.7. Ứng dụng
13
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
16
2.1.1. Chủng vi khuẩn
16
2.1.2. Hóa chất
16

2.1.3. Môi trường
16
2.1.4. Máy móc, dụng cụ
17
2.2. Nội dung nghiên cứu
18
2.2.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi
khuẩn L. acidophilus ATCC 4653
18
2.2.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn
L. acidophilus ATCC 4653
18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
18
2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
18
2.3.2. Phương pháp nhân giống L. acidophilus
19
2.3.3. Phương pháp xử lí sinh khối L. acidophilus
20
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch
tán qua giếng thạch
20
2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính
bacteriocin
21
2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính
bacteriocin
22
2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng

(NH
4
)
2
SO
4

22
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
23
3.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi
khuẩn L. acidophilus ATCC 4653
23
3.1.1. Xác định bacteriocin trong dịch lên men
23
3.1.2. Xác định bacteriocin trong sinh khối
26
3.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi
khuẩn L. acidophilus ATCC 4653
28
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L.
acidophilus ATCC 4653
28
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của
31
L. acidophilus ATCC 4653
3.2.3. Nghiên cứu khả năng chiết bacteriocin của L. acidophilus ATCC
4653 bằng phương pháp kết tủa (NH
4
)

2
SO
4

34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC (American Type Culture
Collection)
Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa
Kì
BC (Bacterial Cellulose)
Cellulose vi khuẩn
Dha
Dehydroalanine
Dhb
Dehydrobutyrine
FDA (U.S. Food and Drug
Administration)
Cục quản lí Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kì
GC

Guanine và Cytosine
GRAS (Generally Recognized As
Safe)
Được công nhận chung là an toàn
kDa
kiloDalton
LAB (Lactic Acid Bacteria)
Vi khuẩn lactic
Lan
Lanthionine
MeLan
MethylLanthionine
MRS
de Man, Rogosa, Sharpe
MRSA (Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus)
Tụ cầu vàng kháng methicillin
PMF (Proton Motive Force)
Động lực proton
SDS (Sodium Dodecyl sulfate)
Natri dodecyl sulfat
sp. (species)
Loài
subsp. (subspecies)
Phân loài
VRE (Vancomycin-Resistant
Enterococci)
Cầu khuẩn ruột kháng vancomycin
UV (Ultraviolet)
Tia cực tím

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1.1
Phân loại bacteriocin của LAB
8
2.1
Các hóa chất sử dụng trong đề tài
16
2.2
Các máy móc sử dụng trong đề tài
17
3.1
Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L.
acidophilus ATCC 4653
24
3.2
Kết quả xác định bacteriocin trong sinh khối của L.
acidophilus ATCC 4653
26
3.3
Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 ở các
giá trị pH nghiên cứu trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis
ATCC 6633
30
3.4
Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 sau

khi được xử lí nhiệt trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis
ATCC 6633
32
3.5
Hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch thu được
khi bổ sung (NH
4
)
2
SO
4
vào dịch lên men của L.
acidophilus ATCC 4653 với vi khuẩn kiểm định là B.
subtilis ATCC 6633
35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT
Tên hình
Trang
1.1
Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến
bacteriocin trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010
5
3.1
Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC
4653 trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633
26

3.2
Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC
4653 trên vi khuẩn kiểm định E. coli ATCC 25922
26
3.3
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L.
acidophilus ATCC 4653
31
3.4
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của L.
acidophilus ATCC 4653
33
3.5
Sự thay đổi hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch
theo nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
sử dụng
36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát hiện ra các chất kháng sinh đánh dấu một bước tiến cách mạng
của loài người trong cuộc chiến chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, công nghệ

kháng sinh được đánh giá là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của
thế kỉ XX [52]. Tuy nhiên, bước vào thế kỉ XXI, con người đang phải đối mặt
với kỉ nguyên hậu kháng sinh với sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới trong
khi các chủng vi khuẩn kháng thuốc không ngừng gia tăng [13]. Trước tình
hình đó, việc nghiên cứu và phát triển những hợp chất mới có tác dụng kháng
khuẩn để giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh là hết sức cần thiết. Bacteriocin
chính là một trong số đó [52].
Bacteriocin là những peptid hay protein có tác dụng diệt khuẩn do vi
khuẩn sinh ra [34]. Chúng đã được phát hiện từ đầu thế kỉ XX nhưng mới
được nghiên cứu rộng rãi trong một vài thập niên trở lại đây khi nhu cầu về
những hợp chất kháng khuẩn nhằm thay thế kháng sinh và các chất bảo quản
hóa học trở nên cấp thiết [26]. Với đặc tính an toàn đã được FDA xác nhận, vi
khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút sự quan
tâm đặc biệt của các nhà khoa học [52]. Nhiều công trình nghiên cứu đã
chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi
LAB [20]. Nisin – một bacteriocin của Lactococcus lactis spp. đã được sử
dụng rộng rãi trên thế giới như một chất bảo quản nguồn gốc sinh học an toàn
và hiệu quả [23]. Thành công của nisin đã bước đầu cho thấy tiềm năng ứng
dụng to lớn của bacteriocin từ LAB [22].
Tại Việt Nam, bacteriocin của LAB đã bắt đầu được nghiên cứu trong
những năm gần đây, tuy nhiên số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung
chủ yếu trong nhóm ngành thực phẩm và thú y. Với mong muốn góp phần
nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của LAB ở Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu
2

khả năng tạo bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus” được
thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L.
acidophilus ATCC 4653.
2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi L. acidophilus

ATCC 4653.

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về bacteriocin
1.1.1. Vài nét về lịch sử
Những báo cáo đầu tiên liên quan tới bacteriocin được cho là có từ cuối
thế kỉ XIX khi các nhà khoa học nghiên cứu về tính đối kháng giữa các vi
khuẩn (bacterial antagonism) [26]. Năm 1925, bacteriocin chính thức được
Gratia tìm ra trên một chủng Escherichia coli [74], về sau chất này được biết
đến với tên gọi colicin V [73] và nay là microcin V [28]. Năm 1953, thuật
ngữ “bacteriocin” lần đầu được đề xuất và định nghĩa bởi Jacob và cộng sự,
chủ yếu dựa trên các đặc tính của colicin [34]. Năm 1976, Tagg và cộng sự
chỉ ra sự khác biệt giữa colicin và các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn Gram
(+) [66], từ đó định nghĩa về bacteriocin được mở rộng và đến ngày nay, các
peptid và protein do vi khuẩn sinh ra có tác dụng diệt khuẩn đều được gọi là
bacteriocin [34].
1.1.2. Phân bố
Bacteriocin là sản phẩm phổ biến của giới vi khuẩn [34]. Chúng đã được
tìm thấy ở nhiều nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) và cả trên vi khuẩn cổ
(Archaebacteria) [59]. Đến nay, có khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả
[26]. Tuy nhiên số lượng bacteriocin trong thực tế được ước tính lớn hơn thế
rất nhiều. Theo Klaenhammer, 99% các loài vi khuẩn có thể sinh ra ít nhất
một bacteriocin [41].
1.1.3. Danh pháp và phân loại
a. Danh pháp
Hiện nay chưa có hệ thống danh pháp quốc tế cho bacteriocin. Tên của
bacteriocin thường xuất phát từ tên chi hay tên loài vi sinh vật đầu tiên được

4

phát hiện sinh ra bacteriocin đó. Ví dụ như colicin từ E. coli, pyocin từ
Pseudomonas pyocynea, megacin từ Bacillus megaterium … [25]
b. Phân loại
Hệ thống phân loại quốc tế dành cho bacteriocin chưa được chính thức
xây dựng và hiện vẫn đang là chủ đề tranh luận trong giới khoa học [26].
Riley và Wertz nghiên cứu bacteriocin theo 3 nhóm: bacteriocin của vi khuẩn
Gram (-), bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) và bacteriocin của vi khuẩn cổ
[59]. Chi tiết hơn, theo Desriac và cộng sự, bacteriocin được phân loại căn cứ
nhiều tiêu chí, trong đó các tiêu chí cơ bản bao gồm: họ vi khuẩn sinh
bacteriocin, trọng lượng phân tử, trình tự chuỗi acid amin và cấu trúc của
đoạn gen (gene cluster). Các tác giả chia bacteriocin làm 2 nhóm lớn: nhóm
thứ nhất là các bacteriocin bản chất protein (protein-bacteriocin), thường được
sinh ra bởi vi khuẩn Gram (-), tiêu biểu là các vi khuẩn đường ruột
(Enterobacteriae); nhóm thứ 2 là các bacteriocin bản chất peptid (peptid-
bacteriocin), thường được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+), tiêu biểu là các vi
khuẩn lactic (LAB). Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều lớp và phân lớp [26]
(Phụ lục 1).
1.1.4. Tình hình nghiên cứu
a. Thế giới
Dù được tìm ra từ khá sớm (1925) nhưng thời gian đầu số lượng các
nghiên cứu về bacteriocin không nhiều và hầu hết tập trung vào các
bacteriocin của vi khuẩn Gram (-). Cho đến những năm 60 của thế kỉ XX, mới
chỉ có 3 chi vi khuẩn Gram (+) được đi sâu nghiên cứu về khả năng sinh
bacteriocin là Bacillus, Listeria và Staphylococcus [26]. Tuy nhiên, cũng
trong giai đoạn này, nisin và subtilin – 2 bacteriocin quan trọng từ vi khuẩn
Gram (+) đã được phát hiện. Roger và cộng sự công bố nghiên cứu đầu tiên
về nisin vào năm 1928 [60], trong khi subtilin được Jansen và Hirschmann
5

phát hiện vào năm 1944 từ vi khuẩn Bacillus subtilis [37]. Đến đầu những
năm 70, trình tự chuỗi acid amin của 2 bacteriocin này mới được xác định rõ
[29] [75].
Kể từ những năm 80, số lượng các nghiên cứu về bacteriocin có sự gia
tăng đáng kể, bao gồm cả các nghiên cứu trên colicin và trên các bacteriocin
khác [26]. Tiếp đó, việc nisin được FDA công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS vào
năm 1988 [58] đã thúc đẩy sự quan tâm của các nhà khoa học đối với các
bacteriocin của LAB bởi tiềm năng ứng dụng to lớn trong công nghệ thực
phẩm, y tế, thú y Kết quả tất yếu là sự bùng nổ các nghiên cứu về
bacteriocin của LAB vào những thập niên cuối thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI
[26] (Hình 1.1).

Hình 1.1: Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến bacteriocin
trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010 [26]

Trong 20 năm gần đây, trên toàn thế giới có 706 bằng sáng chế liên quan
tới bacteriocin của LAB đã được cấp, trong số đó có 421 bằng trong lĩnh vực
công nghệ bảo quản thực phẩm và 124 bằng về chất trợ sinh (probiotic) cho
động vật [26]. Các khả năng ứng dụng khác của bacteriocin như ngăn ngừa
6

nhiễm trùng khu trú [64], làm chất bảo vệ thực vật [33], làm chất thay thế
kháng sinh [38]… cũng đã được đề xuất và nghiên cứu bước đầu.
Microcin và bacteriocin từ vi khuẩn biển (marine bacteria) là 2 nhóm
bacteriocin mới được đưa ra gần đây [26]. Microcin có nguồn gốc từ vi khuẩn
đường ruột như colicin [28] nhưng khối lượng phân tử nhỏ hơn và phần lớn
được biến đổi sau dịch mã, tương tự nhóm lantibiotic ở vi khuẩn Gram (+)
[35]. Các bacteriocin từ vi khuẩn biển đến nay vẫn chưa được nghiên cứu
nhiều tuy nhiên được dự báo là sẽ phát triển mạnh trong tương lai gần [26].

b. Việt Nam
Ở Việt Nam, bacteriocin bắt đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu trong những năm gần đây, đặc biệt là bacteriocin của LAB [8]. Bên cạnh
các nghiên cứu lí thuyết [1] [2] [8], một số công trình đã bước đầu đưa
bacteriocin vào ứng dụng trong thực tiễn. Năm 2008, các tác giả Nguyễn
Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An đã sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch
bacteriocin của Lactococcus lactis để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu, giúp
tăng thời gian bảo quản từ 1 lên 3 ngày [3]. Việc ứng dụng các kĩ thuật tiên
tiến như cố định tế bào [3], tái tổ hợp gen [6] [7] nhằm mục tiêu sản xuất
bacteriocin đạt hiệu quả cao cũng đang được nghiên cứu.
1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic
1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Vi khuẩn lactic (LAB) được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+),
gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-
aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính
khi lên men carbohydrat. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các
chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [43].
Các LAB đều không di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dưới 50%
[61]. LAB ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài, dao
7

động từ 28 đến 45
o
C. LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần
các vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbohydrat có thể là glucose,
fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh
bột như Lactobacillus amylophilus và L. amylovorus [5].
LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy
trong một số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt và rau quả lên men,
bột nhào chua…), trên thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của

người và động vật [61].
LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men vì các tác
động có lợi về mặt dinh dưỡng, cảm quan và tuổi thọ sản phẩm, nhất là với
các sản phẩm dễ hỏng như sữa, thịt, cá, một số loại rau quả [43] [69]. Trong y
dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao
sức khỏe với nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như ngăn ngừa nhiễm khuẩn
đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm
cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [61]
Tác dụng kháng khuẩn là một đặc điểm rất đáng chú ý của LAB. LAB
sinh ra nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid acetic,
ethanol, acid béo, H
2
O
2
, diacetyl… và đặc biệt là bacteriocin. Mặc dù
bacteriocin có thể được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn khác, bacteriocin sinh
ra bởi LAB vẫn thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà khoa học bởi tính
an toàn và tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… [20] Trong số khoảng 200
bacteriocin đã được mô tả cho đến nay, bacteriocin từ LAB chiếm tới 90%
[26].
1.2.2. Phân loại
Bacteriocin sinh ra bởi LAB rất đa dạng, trong việc phân loại chúng
cũng tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Cách phân loại phổ biến nhất do
8

Klaenhammer và cộng sự đề xuất vào năm 1993 [26], chia bacteriocin của vi
khuẩn Gram (+) nói chung, của LAB nói riêng làm 3 lớp [42]. Đặc điểm của 3
lớp này được tóm tắt trong bảng 1.1. Một số tác giả đã đề xuất lớp thứ 4 gồm
các bacteriocin phức tạp trong cấu trúc có carbohydrat hoặc lipid; tuy nhiên

dữ liệu về các bacteriocin loại này còn rất hạn chế nên cần được nghiên cứu
thêm [34].

Bảng 1.1: Phân loại bacteriocin của LAB [26] [34] [71]
Lớp
Đặc điểm
Ví dụ
I
- Còn gọi là các lantibiotic
- Peptid nhỏ (thường < 5 kDa)
- Bền nhiệt
- Biến đổi mạnh sau dịch mã, dẫn tới sự tạo thành
các acid amin hiếm gặp: Lan, MeLan, Dha, Dhb
- Chia làm 2 typ: typ A và typ B
Nisin, lactocin S,
epidermin…
II
- Peptid nhỏ (thường < 10 kDa)
- Bền nhiệt
- Ít biến đổi sau dịch mã, không chứa Lan
- Chia làm 4 phân lớp: IIa, IIb, IIc, IId
Pediocin PA-1,
lactacin F,
enterocin AS-
48…
III
- Protein kích thước lớn (thường > 30 kDa)
- Kém bền nhiệt
Helveticin J,
millericin,

enterolysin…

1.2.3. Tính chất
Trừ một số ít các bacteriocin thuộc lớp III là các protein, bacteriocin của
LAB đa phần là các peptid [26]. Chúng thường mang điện (+), có tính sơ
nước (hydrophobic) hoặc lưỡng thân (amphiphilic) nhưng đa phần là lưỡng
thân, gồm từ 20 đến 60 acid amin [50] [71]. Giống như nhiều bacteriocin của
vi khuẩn Gram (+), chúng có thể tồn tại dưới dạng các kết tập có khối lượng
lớn (30 – 300 kDa) [54] [66]. Dạng kết tập làm giảm hoạt tính của
9

bacteriocin, đồng thời dễ gây nhầm lẫn trong việc xác định khối lượng phân
tử của bacteriocin tinh khiết. Để phá vỡ các kết tập này, có thể sử dụng các
tác nhân phân tách như urê, SDS, các biện pháp như siêu lọc, chiết loại lipid
bằng dung môi hữu cơ [54].
Độ ổn định là một tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về bacteriocin, nó
liên quan tới khả năng sản xuất và đưa bacteriocin vào ứng dụng trong thực
tế. 3 yếu tố ảnh hưởng thường được đánh giá là nhiệt độ, pH và enzym [54];
ảnh hưởng của các yếu tố này với mỗi bacteriocin có thể rất khác nhau [66].
Đa số bacteriocin của LAB khá bền nhiệt (trừ lớp III), chịu pH acid tốt hơn
pH kiềm [66], dễ bị bất hoạt bởi các enzym phân giải protein như proteinase
K, pronase, pepsin, trypsin [54].
Ngoài một số nét chung, các bacteriocin của LAB có những đặc điểm
riêng rất đa dạng. Một số tính chất cơ bản của các bacteriocin tiêu biểu từ
LAB được giới thiệu trong Phụ lục 2.
1.2.4. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng
a. Sinh tổng hợp
Bacteriocin được tổng hợp tại ribosom dưới dạng tiền chất không hoạt
động, chúng chỉ trở nên có hoạt tính sau khi được biến đổi nhờ các phản ứng
enzym đặc hiệu [51]. Theo Tagg và cộng sự, các bacteriocin của vi khuẩn

Gram (+) có thể tồn tại dưới dạng ngoại bào (extracellular form) hoặc gắn với
tế bào (cell-associated form), tỉ lệ mỗi dạng phụ thuộc vào đặc điểm môi
trường [66].
Môi trường sống của vi khuẩn còn có ảnh hưởng lớn tới lượng
bacteriocin sinh ra, trong đó các yếu tố chủ yếu là thành phần môi trường,
nhiệt độ và pH. Các yếu tố này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản sinh
bacteriocin hoặc gián tiếp thông qua sự sản xuất sinh khối do bacteriocin
được coi là sản phẩm trao đổi chất bậc 1 của vi khuẩn [20].
10

b. Phổ tác dụng
Phổ tác dụng của các bacteriocin nhìn chung rất khác nhau (Phụ lục 2).
Căn cứ phổ tác dụng, có thể chia bacteriocin của LAB làm 2 nhóm. Nhóm thứ
nhất là các bacteriocin chỉ có tác dụng trên các loài gần gũi với loài sinh ra
nó, ví dụ như lactobin A sinh ra bởi Lactobacillus amylovorus chỉ ức chế một
số Lactobacillus sp. gần gũi. Nhóm thứ 2, ít gặp hơn, có phổ tác dụng rộng, ví
dụ như nisin sinh ra bởi một số dòng Lactococcus lactis subsp. lactis có khả
năng ức chế nhiều vi khuẩn Gram (+). Nói chung, các bacteriocin của LAB
thường ít thể hiện hoạt tính trên vi khuẩn Gram (-) [54].
Bacteriocin có thể có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn trên các chủng
vi khuẩn nhạy cảm, mức độ tác dụng khác nhau do ảnh hưởng bởi nhiều yếu
tố như nồng độ, mức độ tinh sạch bacteriocin, các điều kiện thực nghiệm…
[17]
c. Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng của bacteriocin rất đa dạng, một bacteriocin có thể có
nhiều hơn một cơ chế tấn công tế bào đích [52]. Một số cơ chế đã được đề
xuất: thay đổi hoạt tính enzym nội bào, ức chế bào tử nảy mầm, tạo lỗ trên
màng tế bào… Nhìn chung, lớp vỏ tế bào được coi là đích tác dụng chính của
các bacteriocin từ LAB. Bacteriocin phá vỡ tính toàn vẹn của lớp vỏ tế bào vi
khuẩn nhạy cảm, gây mất các chất nội bào, tiêu hao PMF, cuối cùng gây chết

tế bào [54].
Cơ chế tác dụng cụ thể của bacteriocin ở từng lớp là khác nhau. Các
bacteriocin lớp I (lantibiotic) ức chế tổng hợp vách tế bào và / hoặc tạo lỗ trên
màng tế bào bằng cách gắn vào lipid II [52]. Các bacteriocin lớp II có cấu trúc
xoắn ốc và lưỡng thân nên có thể xen vào màng tế bào đích, từ đó tạo lỗ, khử
cực và làm chết tế bào [18]. Cơ chế tác dụng của các bacteriocin lớp III nói
chung chưa rõ [54]; một số tác giả cho rằng đó là các lysin tiêu khuẩn hay tiêu
11

khuẩn tố (bacteriolysin), tác động trực tiếp lên vách tế bào đích gây phá hủy
tế bào [18].
1.2.5. Đánh giá hoạt tính bacteriocin
Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin, về cơ bản chúng
đều dựa trên việc đánh giá tác dụng đối kháng của mẫu thử đối với các chủng
vi sinh vật chỉ thị [66]. Một số ví dụ: phương pháp “spot-on-lawn”, phương
pháp khuếch tán qua giếng thạch [56], phương pháp đo độ đục [40]… (Phụ
lục 3). Ảnh hưởng của các tác nhân ức chế khác không phải là bacteriocin như
pH, H
2
O
2
… cần được loại trừ bằng phương pháp thích hợp [66].
Gần đây một số phương pháp mới để đánh giá hoạt tính bacteriocin đã
được đề xuất. Năm 2001, Mugochi và cộng sự đưa ra phương pháp đánh giá
hoạt tính bacteriocin bằng cách đo nồng độ ion K
+
giải phóng từ vi khuẩn chỉ
thị [48]. Phương pháp này được cho là có hiệu quả sánh ngang với phương
pháp khuếch tán qua giếng thạch [34].
1.2.6. Chiết xuất và tinh chế

Do tính chất của các bacteriocin rất đa dạng nên không có phương pháp
hay qui trình chiết tách chung [32]. Vấn đề thường gặp trong quá trình chiết
xuất và tinh chế bacteriocin là sự hao hụt bacteriocin và sự giảm hoạt tính ức
chế vi sinh vật [66]. Một qui trình sản xuất bacteriocin chỉ được coi là lí tưởng
khi có thể áp dụng với qui mô lớn, cho hiệu suất thu nhận bacteriocin trên
50% và độ tinh sạch khoảng 90% [54].
a. Chiết xuất
Bacteriocin có thể được chiết xuất bằng nhiều cách, tiêu biểu trong số đó
là các phương pháp: kết tủa bằng amoni sulfat, hấp phụ - giải hấp phụ và chiết
bằng dung môi hữu cơ [56].
- Kết tủa bằng amoni sulfat
12

Do có bản chất protein, bacteriocin có thể được kết tủa bằng muối do
hiện tượng salting out (tính tan của protein giảm mạnh ở nồng độ muối cao)
[56]. Amoni sulfat thường được sử dụng nhất [56], ngoài ra cũng có tác giả sử
dụng diatomite calcium silicate [19]. Muối được thêm từ từ vào mẫu (dịch nổi
đã loại sinh khối tế bào) cho đến khi đạt nồng độ mong muốn. Nồng độ muối
cần thiết để kết tủa các bacteriocin khác nhau có thể khác nhau, cần khảo sát
để tìm ra nồng độ muối thích hợp với từng trường hợp cụ thể. Tủa bacteriocin
được tách riêng bằng cách li tâm, sau đó hoà trong lượng nhỏ (vừa đủ) đệm
phosphat pH 7 (giá trị pH của dung dịch đệm có thể khác nhau giữa các
nghiên cứu) hoặc nước cất vô trùng. Thường loại muối bằng bằng phương
pháp thẩm tích [56].
- Hấp phụ - giải hấp phụ
Phương pháp này được phát triển bởi Yang và cộng sự dựa trên đặc tính
của một số bacteriocin: bacteriocin được hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn
sinh bacteriocin đó ở pH gần trung tính và được giải phóng trở lại môi trường
sau khi xử lí ở pH thấp (pH khoảng 1,5 – 2,0) [70]. Ưu điểm của phương pháp
này là ít kéo theo các protein tạp so với phương pháp kết tủa bằng amoni

sulfat [56].
- Chiết bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này cũng xuất phát từ bản chất protein của bacteriocin: khi
thêm dung môi hữu cơ vào mẫu, hằng số điện môi giảm xuống, độ tan của
protein giảm và tạo kết tủa [4]. Ethanol và aceton là hai dung môi khá thông
dụng được sử dụng để chiết bacteriocin. Phương pháp chiết bằng dung môi
hữu cơ đã được ứng dụng thành công với một số bacteriocin như lactococcin
B, pediocin PA-1, lacticin Q… [56]
b. Tinh chế
13

Bacteriocin sau khi được chiết xuất thường còn lẫn nhiều tạp. Để thu
được bacteriocin tinh khiết cần trải qua các bước tinh chế [54]. Các kĩ thuật
tinh chế bacteriocin rất đa dạng (Phụ lục 4), có thể dựa trên kích thước (ví dụ:
sắc kí lọc gel, siêu lọc…) hoặc điện tích riêng của bacteriocin (ví dụ: sắc kí
trao đổi ion, điện di…) [66]. Quá trình tinh chế thường trải qua nhiều bước,
kết hợp nhiều kĩ thuật khác nhau [54]. Tuy nhiên, một số qui trình đơn giản
nhằm tinh chế bacteriocin ở qui mô công nghiệp đã được phát triển thành
công. Năm 1997, Suárez và cộng sự đã đề xuất qui trình tinh chế nisin A bằng
phương pháp sắc kí ái lực miễn dịch nhờ kháng thể đơn dòng kháng nisin A,
cho kết quả tốt [63]. Năm 2004, Cheigh và cộng sự đã tinh chế được nisin Z
từ môi trường nuôi cấy Lactococcus lactis subsp.lactis A164 bằng phương
pháp sắc kí trao đổi ion nền mở rộng, thu được nisin Z có độ tinh khiết gấp 31
lần với hiệu suất 90% [16].
1.2.7. Ứng dụng
Với tác dụng kháng khuẩn, bacteriocin được ứng dụng trong 2 lĩnh vực
lớn: công nghệ dược phẩm và công nghệ thực phẩm [59].
a. Trong công nghệ dược phẩm
Bacteriocin được nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ dược phẩm theo
2 hướng chính: probiotic [27] và chất thay thế kháng sinh [59].

- Probiotic
Probiotic được định nghĩa là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với
lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe của vật chủ [55]. Tác
dụng của các chế phẩm probiotic có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua
sự điều chỉnh khu hệ vi sinh vật đường ruột [9]. Bacteriocin được cho là đóng
vai trò quan trọng trong hoạt động của các probiotic, là một trong các tiêu chí
lựa chọn chủng vi sinh vật làm probiotic [27].
14

Đã có nhiều giả thiết được đưa ra về cơ chế bacteriocin tham gia vào
hoạt động của probiotic. Một là, bacteriocin giúp probiotic xâm nhập và
chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột. Hai là, bacteriocin thể hiện tác
dụng kháng khuẩn, trực tiếp ức chế các vi khuẩn gây bệnh. Ba là, bacteriocin
mang tín hiệu kích thích hệ miễn dịch của vật chủ. Hiện nay, các nhà khoa
học vẫn đang tìm kiếm những bằng chứng để khẳng định chính xác vai trò và
cơ chế tác dụng của bacteriocin trong hoạt động của probiotic, nhất là các
bằng chứng in vivo [27].
- Chất thay thế kháng sinh
Sự xuất hiện và gia tăng các chủng vi khuẩn gây bệnh đa kháng thuốc là
một vấn đề lớn của y học hiện nay. Để giải quyết vấn đề này, bên cạnh việc
sử dụng hợp lí các kháng sinh hiện có, một yêu cầu cấp thiết được đặt ra là
nghiên cứu phát triển các phương pháp điều trị mới thay thế cho sử dụng
kháng sinh. Bacteriocin là một trong những giải pháp đã được đề xuất và
nghiên cứu [59].
Về mặt lí thuyết, bacteriocin được sinh ra trong tự nhiên rất đa dạng nên
khả năng tìm ra những chất có tác dụng kháng lại các vi khuẩn gây bệnh là rất
lớn. Mặt khác, do bacteriocin thường có tác dụng đặc hiệu trên một số loài vi
khuẩn nhất định, chúng có thể được sử dụng như những thuốc thiết kế riêng
cho từng tác nhân gây bệnh, nhờ đó giảm tần suất xuất hiện vi khuẩn kháng
thuốc [59].

Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho những kết quả bước đầu khả quan.
Ở đây chỉ nêu ra một vài ví dụ: Nisin, mersacidin, mutacin 1140, lacticin
3147 đã được báo cáo về tác dụng trên các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc
như MRSA, VRE [52]. Nisin F tiêm vào chuột nhiễm Staphylococcus aureus
cho thấy có tác dụng kiểm soát sự phát triển của S. aureus [14]. Lacticin 3147
thể hiện tác dụng ức chế Clostridium difficile trên mô hình ex vivo của ruột
15

kết [57]. Một liều duy nhất mutacin B-Ny266 tiêm màng bụng vào chuột
nhiễm S. aureus nhạy cảm với methicillin cho tỉ lệ tử vong là 0%, trong khi tỉ
lệ tử vong ở nhóm chuột đối chứng (không dùng mutacin B-Ny266) là từ 70
đến 100% [47].
Mặc dù vẫn cần thêm nhiều nghiên cứu để có thể đưa bacteriocin vào
ứng dụng trên thực tiễn lâm sàng nhưng những kết quả trên đã cho thấy tiềm
năng to lớn của bacteriocin trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [27].
Trong tương lai, sử dụng bacteriocin hứa hẹn sẽ là một liệu pháp an toàn và
hiệu quả thay thế các kháng sinh truyền thống [59].
b. Trong công nghệ thực phẩm
Bacteriocin của LAB được nghiên cứu ứng dụng làm chất bảo quản
trong công nghệ thực phẩm bởi có nhiều ưu điểm: ức chế hiệu quả nhiều vi
khuẩn gây hỏng và gây bệnh trong thực phẩm (điển hình là Listeria
monocytogenes) [34], thân thiện với môi trường và sức khỏe con người [54].
Chúng được sử dụng dưới 2 dạng: trực tiếp hoặc gián tiếp [20]. Dạng trực tiếp
là các bacteriocin đã được tinh chế, hiện nay mới chỉ có nisin và pediocin PA-
1 được dùng rộng rãi làm chất bảo quản thực phẩm với các tên thương mại
như Nisaplin, ALTA 2341… [20] [52] [54] Dạng gián tiếp là các LAB được
dùng làm giống khởi động (starter culture) hoặc bổ sung vào các thực phẩm
lên men, bacteriocin được chúng sinh ra sẽ phát huy tác dụng kháng khuẩn,
giúp tăng tuổi thọ và tính an toàn cho sản phẩm [20]. Để tăng hiệu quả kháng
khuẩn, bacteriocin có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp khác

như tạo môi trường acid, bổ sung NaCl…[34]



16

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Chủng vi khuẩn
a. Vi khuẩn thử nghiệm
Chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4653
b. Vi khuẩn kiểm định (chỉ thị)
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633
- Chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong đề tài
Hóa chất
Xuất xứ
Hóa chất
Xuất xứ
Acid lactic
Trung Quốc
MgSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc

Amoni citrat
Trung Quốc
MnSO
4
.H
2
O
Trung Quốc
Cao nấm men
Đức
NaCl
Trung Quốc
Cao thịt
Đức
NaOH
Trung Quốc
Cát thủy tinh
Trung Quốc
Natri acetat
Trung Quốc
Chỉ thị màu
Trung Quốc
(NH
4
)
2
SO
4

Trung Quốc

Glucose
Trung Quốc
Pepton
Ấn Độ
HCl 1N
Trung Quốc
Thạch
Việt Nam
K
2
HPO
4

Trung Quốc
Xanh methylen
Trung Quốc
KH
2
PO
4

Trung Quốc



2.1.3. Môi trường
a. Công thức môi trường MRS lỏng