Nghiên cứu xử lý sinh khối bacillus clausii để thu bào tử

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI





VŨ THỊ NGỌC BÍCH



NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI
Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ









HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



VŨ THỊ NGỌC BÍCH



NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI
Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:

D



HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc
tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược –
Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã luôn động viên, tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh, cùng toàn thể các thầy
cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và rèn
luyện tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Vũ Thị Ngọc Bích


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Đặt vấn đề ………………… ………………………………….…… …… 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về probiotics
1.1.1. Định nghĩa .…………… ……… ………………………… ………2
1.1.2. Lịch sử phát triển của probiotics …… ………………… ………… 2

1.1.3. Vai trò của probiotics … ……………………………… ………… 2
1.1.4. Các chế phẩm probiotics trên thị trường ……… …… ….………… 4
1.2. Bacillus clausii
1.2.1. Bacillus clausii ……….………………… ………… ……………….5
1.2.2. Bào tử Bacillus clausii …………………………… ………………….7
1.3. Sự hình thành bào tử và các phƣơng pháp thu bào tử
1.3.1. Sự hình thành bào tử ……………… ……………………………… 10
1.3.2. Sức đề kháng của bào tử ……………… ……………………………11
1.3.3. Các phương pháp giải phóng nội bào tử ……………… ……………11
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất … … …………………… ………… …….14
2.1.2. Máy móc, thiết bị ……… ……….…………… ………………… 15
2.1.3. Môi trường sử dụng …………………………… …… ………….16
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn các phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo
nguyên liệu chứa bào tử ………………………………………… ……… 16
quá trình bảo quản …………… ………………………… ……… ……17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina … ……… ………… 17
2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng …………… ………… …………….17
2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống ……………………………… ……… …17
2.3.4. Phương pháp thu bào tử ………………………………… …….……18
2.3.5. Phương pháp đếm số lượng bào tử còn sống trong một lượng sản phẩm
thu được theo nguyên tắc pha loãng liên tục .……… ……… ………… 20
2.3.6. Kiểm tra khả năng bào tử bị nảy mầm trở lại trong điều kiện bảo quản
21
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Lựa chọn các phƣơng pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo

nguyên liệu chứa bào tử
3.1.1. Xử lý nhiệt sinh khối tế bào tạo nguyên liệu thô……… ……………22
3.1.2. Giải phóng nội bào tử từ nguyên liệu thô bằng phương pháp vật lý
(phương pháp siêu âm) …………………………………………… ……….23
3.1.3. Giải phóng nội bào tử từ nguyên liệu thô bằng phương pháp hóa học
…………………………………………………….…………………………24
3.1.4. Sử dụng tác nhân sinh học (enzyme lysozyme) …………… …… 29
trong quá trình bảo quản
2
SO
4
10% (80˚C).………….32
3.2.2. Khảo sát khả năng bào tử bị nảy mầm trở lại trong quá trình bảo quản
34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………… …….…………….……… 36
Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT



AAD
Antibiotic Associated Diarrhea
Bệnh tiêu chảy liên quan
đến kháng sinh
ADN
Acid Deoxyribo Nucleic


ATTC

American Type Culture
Bảo tàng giống vi sinh vật
Mỹ
B. clausii

Bacillus clausii


B. subtilis

Bacillus subtilis


B. coagulans

Bacillus coagulans

CFU

Colony Forming Units

Số đơn vị khuẩn lạc

E. coli
Escherichia coli


EDTA

Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

IBD

Inflammatory Bowel Diseases
Bệnh viêm ruột cấp
LAB

Lactic Acid Bacteria
Nhóm vi khuẩn lactic
SDS
Sodium Dodecin Sulfate


DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 2.2: Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.
3.3:
2
SO
4
.
Bảng 3.2: Kết quả đếm số lượng bào tử sống sót sau quá trình xử lý bằng 2
tác nhân là H
2
SO
4
10% (80°C) và lysozyme.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: VSL#3 là hỗn hợp gồm 1 loài Streptococcus, 3 loài
Bifidobacterium và 4 loài Lactobacillus.
Hình 1.2: Sản phẩm Yakult nổi tiếng của Yakult Nhật Bản được công bố
có chứa L. casei Shirota.
Hình 1.3: Sản phẩm Biosubtyl-II của công ty vacxin và sinh phẩm số 2,
Nha Trang, Việt Nam được đóng gói dưới dạng gói bột uống chứa bào tử B.
subtilis.
Hình 1.4: Bào tử B. clausii.
Hình 1.5: Bào tử B. coagulans.
Hình 1.6: Mặt cắt ngang của 1 bào tử Bacillus subtili.
Hình 1.7: Chế phẩm Erceflora của công ty Sanofi – Aventis được đóng gói
2 tỷ bào tử trong 5ml. Sản phẩm được lưu hành ở Philippines.
Hình 1.8: Chế phẩm Probacin của công ty INPHARM, s.r.o., ČR chứa 5 tỷ
bào tử B. clausii / 10ml. Sản phẩm được lưu hành tại cộng hòa Sec.
Hình 1.9: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi – Aventis.
Hình 1.10: Sự hình thành bào tử.
Hình 3.1: Hình ảnh tiêu bản của nguyên liệu thô.
Hình 3.2: Hình ảnh sau xử lý bằng NaOH 20% ở 80°C trong 80 phút.
Hình 3.3: Hình ảnh tiêu bản sau xử lý sinh khối với H
2
SO
4
10% ở 80°C
trong 80 phút.
Hình 3.4: Hình ảnh tiêu bản của sản phẩm xử lý bằng lysozyme tỷ lệ 40ml
lysozyme (1mg/ml)/1g nguyên liệu thô trong 120 phút.
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự tương quan về % sinh khối sau xử lý so với
nguyên liệu ban đầu của 3 phương pháp NaOH, H

2
SO
4
10% (80°C) và
lysozyme.
1




Bacillus
. Trong nhóm
các Bacillus được sử dụng làm probiotics, chi B. clausii
.
B. clausii
.
, v
.
“
B. clausii :
1. Lựa chọn các phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo
nguyên liệu chứa bào tử.
2. Khảo sát ủa bào tử sau xử lý ảy mầm trong
quá trình bảo quản.
2



CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về probiotics:

1.1.1. Định nghĩa:
Thuật ngữ probiotics là một thuật ngữ được dùng để chỉ các vi khuẩn
có lợi cho con người và động vật [32].
1.1.2. Lịch sử phát triển của probiotics:
Các vi khuẩn có lợi cho cơ thể con người lần lượt được phát hiện ra từ
hơn một thế kỷ trước. Nhóm các vi khuẩn lactic (LAB) được Elie
Metchnikoff (1845 – 1916) phát hiện ra khi ông nghiên cứu mối liên quan
giữa chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với đời sống khỏe mạnh của người
nông dân Bulgari. Cùng thời gian đó, lần đầu tiên Bifidobacterium được bác
sĩ nhi khoa người Pháp Henry Tissier - phân lập từ phân của những đứa trẻ sơ
sinh được bú mẹ.
Chi Bacillus đã được sử dụng trong các chế phẩm sinh học trong 1 thời
gian dài với chế phẩm được biết đến nhiều nhất là Enterogermina (được đăng
ký tại Italy năm 1958) [30].
Hiện nay, probiotics được đưa vào các chế phẩm dưới nhiều dạng:
thuốc, thực phẩm, thực phẩm chức năng. Ngoài chi Lactobacillus và
Bifidobacterium là các probiotics đã được sử dụng phổ biến và lâu đời thì
Enterococcus, Bacillus, Streptococcus và Pediococcus cũng đang được ứng
dụng rộng rãi [11].
1.1.3. Vai trò của probiotics:
 Điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân:
- Do sử dụng kháng sinh (AAD): Một nghiên cứu tại Mỹ năm 2006 đã
chỉ ra rằng: Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, và hỗn
3


hợp của 2 loài trên làm giảm đáng kể sự phát triển của bệnh tiêu chảy liên
quan đến kháng sinh.
- Do tác nhân gây nhiễm trùng: Phần lớn các trường hợp tiêu chảy cấp
ở trẻ em do rotavirus gây ra, và một nghiên cứu năm 2000 đã cho thấy rằng

việc sử dụng Lactobacillus và / hoặc Bifidobacterium làm giảm thời gian tiêu
chảy ở trẻ em dưới 36 tháng tuổi từ 30 - 40% [28].
- Do xạ trị ung thư: Tình trạng tiêu chảy do xạ trị ở bệnh nhân ung thư
được giảm đáng kể sau khi sử dụng một chế phẩm đông khô gồm 1 loài
Streptococcus, 3 loài Bifidobacterium và 4 loài Lactobacillus. [15].
- Do không dung nạp lactose: Những người không dung nạp lactose
(do thiếu enzym lactase), sau khi tiêu thụ một lượng lactose đủ lớn (khoảng
18g) sẽ gặp tình trạng tiêu chảy, đầy hơi, buồn nôn. Tuy nhiên, tình trạng này
sẽ giảm đáng kể nếu những người này sử dụng chế phẩm sữa lên men, vì
trong sữa lên men, nồng độ lactose giảm đi rất nhiều (trung bình là 30%), và
trong sữa lên men còn chứa một enzym lactase có nguồn gốc từ các vi sinh
vật lên men giúp tiêu hóa lactose [16].
 Điều trị bệnh viêm ruột (IBD):
IBD thường được biết đến là bệnh nhiễm trùng đường ruột mãn tính, có
các đợt tái phát cấp tính. Các nghiên cứu lâm sàng chứng minh hiệu quả của
probiotics trong việc duy trì sự thuyên giảm của IBD đã được công bố [12].
 Điều trị các bệnh ngoài đường ruột:
- Phòng ngừa và trong 1 số trường hợp có thể điều trị các nhiễm khuẩn
đường niệu và nhiễm khuẩn âm đạo [18].
- Can thiệp tích cực vào các bệnh dị ứng, ví dụ như bệnh chàm dị ứng ở
phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh [19].
4


- Làm giảm mức cholesterol trong máu ở những người mắc chứng béo
phì, tiểu đường, tim mạch, tuy nhiên mức giảm này không nhiều như các chế
phẩm statin [21].
- Giảm nguy cơ sỏi thận do ảnh hưởng đến sự bài tiết oxalate trong nước
tiểu, do đó là giảm sự hình thành sỏi [17].
1.1.4. Các chế phẩm probiotics trên thị trường:

Có khoảng hơn 30 loài vi sinh vật thuộc 6 chi (Lactobacillus,
Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Bacillus) đang
được sử dụng làm chế phẩm probiotics ở dạng đơn lẻ hoặc phối hợp
Hình 1.1: VSL#3 là hỗn hợp gồm 1 loài Streptococcus, 3 loài
Bifidobacterium và 4 loài Lactobacillus.
Các chế phẩm probiotics cũng có nhiều dạng bào chế khác nhau. Hình
thức phổ biến nhất là các sản phẩm từ sữa và các loại thực phẩm có bổ sung
các vi sinh vật có lợi. Bên cạnh đó là các chế phẩm bào chế dưới dạng viên
nang, gói bột uống, cốm, hỗn dịch uống Trong các dạng bào chế này vi sinh
vật có thể được bao dưới các dạng khác nhau (bao tan trong ruột, vi nang hóa,
bao kép) để tránh được tác động bất lợi của acid dịch vị và muối mật. Tuy
nhiên nếu sử dụng vi sinh vật dưới dạng bào tử thì không cần bao vì bản thân
dạng bào tử đã có khả năng đề kháng với acid dịch vị và muối mật để đến ruột
non và nảy mầm gần như nguyên vẹn tại đó [4].
5





Hình 1.2: Sản phẩm Yakult nổi
tiếng của Yakult Nhật Bản được
công bố có chứa L. casei Shirota.

Hình 1.3: Sản phẩm Biosubtyl-II
của công ty vacxin và sinh phẩm số
2, Nha Trang, Việt Nam được đóng
gói dưới dạng gói bột uống chứa
bào tử B. subtilis.
Liều lượng của các chế phẩm probiotics cũng rất khác nhau tùy thuộc

vào từng chủng vi sinh vật và từng chế phẩm, nhưng hầu hết các chế phẩm
đều cung cấp một liều lượng vi sinh vật trong phạm vi 1- 10 tỷ CFU/liều,
nhưng một số sản phẩm đã chứng minh được hiệu quả ở liều thấp hơn, ví dụ
như Bifidobacterium infantis 35624 đạt hiệu quả điều trị với liều 100 triệu
CFU/ngày, trong khi sản phẩm VSL#3 chứa đến 450 tỷ CFU/liều [30].
Hiện nay, trên thị trường có dạng chế phẩm synbiotics là sự kết hợp của
probiotics và prebiotics. Prebiotics là những chất hầu như không bị tiêu hóa
bởi hệ tiêu hóa của vật chủ, có tác dụng hỗ trợ sự phát triển của probiotics. Sự
phối hợp này sẽ tạo nên một hiệu ứng tổng hợp trong việc điều trị [30].
1.2. Bacillus clausii:
1.2.1. Bacillus clausii:
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergey (1994) B. clausii thuộc:
6


Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus clausii
 Đặc điểm phân bố:
Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất, có thể là
đất vườn (B. clausii KSM- K16, B. clausii DSM 8716, ATCC 31084 ), hoặc
đất sét (B. clausii DSM 9784…). Ngoài ra có thể tìm thấy B.clausii trong
nước (B. clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông
Ấn Độ), trong bùn [24].
 Đặc điểm hình thái
Bacillus clausii có hình que đứng đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi khuẩn
Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục.
B. clausii có kích thước chiều rộng 1-2µm, chiều dài 5µm [34].

 Điều kiện nuôi cấy
- Nhu cầu oxy: B. clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình nuôi
cấy cần có sự cấp khí.
- Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15 – 50
0
C. Mỗi chủng có
nhiệt độ tối ưu riêng như: chủng B. clausii DSM 8716 có nhiệt độ tối ưu là
30
0
C, chủng B. clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40
0
C, B. clausii ATCC
31084 có nhiệt độ tối ưu là 37
0
C…[36].
- Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7 – 10,5. Chủng B. clausii
KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [36].
- Về dinh dưỡng, B. clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbohydrat
khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2- ketogluconat ;
nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng.
7


 Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn B. clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột,
nhưng không thủy phân được Tween 20, 40 hoặc 60. Cho phản ứng oxidase,
catalase dương tính, khử nitrate thành nitrit [25].
1.2.2. Bào tử Bacillus clausii:
 Đặc điểm bào tử:

Hình 1.4: Bào tử B. clausii [32]. Hình 1.5: Bào tử B. coagulans.
Bào tử Bacillus clausii cũng mang những đặc điểm chung của bào tử:
- Bào tử là dạng sống tiềm sinh của vi khuẩn. Nó có những đặc điểm đặc
biệt để giúp vi khuẩn tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt và nảy mầm
trở lại khi gặp điều kiện thuận lợi. Mỗi vi khuẩn chỉ có thể hình thành một
bào tử [2].
- Cấu tạo:[22]
o ADN nằm trong lõi bào tử.
o Vỏ bảo vệ bao quanh lõi bào tử.
o Áo bào tử trong mỏng.
o Áo bào tử ngoài dày.

8



Hình 1.6: Mặt cắt ngang của 1 bào tử Bacillus subtilis [22].
 Ưu điểm của bào tử khi sử dụng làm probiotics:
Bào tử có khả năng đề kháng cao với điều kiện khắc nghiệt của môi
trường và sẽ nảy mầm trở thành dạng hoạt động khi điều kiên môi trường
thuận lợi nên sẽ có một số ưu điểm nổi trội so với dạng không simh bào tử
như Lactobacillus spp.:
- Trong quá trình sản xuất, các điều kiện như sấy, đông khô… không làm
ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng của bào tử.
- Trong quá trình bảo quản, lưu hành, chế phẩm probiotic từ bào tử ít chịu
ảnh hưởng của điều kiện môi trường nên có độ ổn định cao.
-
để đến ruột non và nảy mầm tại đó

đảm bảo hiệu quả điều trị.
- Tóm lại, về nguyên tắc, một liều lượng xác định của bào tử có thể được
bảo quản vô thời hạn mà không cần làm lạnh, và toàn bộ liều vi khuẩn đã vào
đường tiêu hóa sẽ đạt mức nguyên vẹn ở ruột non [13].
 Chế phẩm trên thị trường:
Trên thế giới, bào tử Bacillus clausii được chú ý bởi nhưng ưu điểm của
nó và được ứng dụng chủ yếu trong điều trị tiêu chảy ở trẻ em:

Lớp áo ngoài
Lớp áo trong
Vỏ bào tử
Lõi bào tử
ADN

9



Hình 1.7: Chế phẩm Erceflora của công ty Sanofi – Aventis được đóng gói
2tỷ bào tử trong 5ml. Sản phẩm được lưu hành ở Philippines [37].


Hình 1.8: Chế phẩm Probacin của công ty INPHARM, s.r.o., ČR chứa 5 tỷ
bào tử B. clausii / 10ml. Sản phẩm được lưu hành tại cộng hòa Sec [35].
Ở thị trường Việt Nam, chế phẩm chứa Bacillus clausii được nhắc đến
khá nhiều là Enterogermina. Enterogermina là một chế phẩm probiotics có tác
dụng hữu hiệu trong điều trị tiêu chảy ở trẻ em. Enterogermina chứa bào tử vi
khuẩn B. clausii dưới 2 dạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tỷ bào tử
trong 5ml) và dạng viên nang (2 tỷ bào tử trong 1 viên nang). Enterogermina
được chỉ định trong các trường hợp:

- Ðiều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kém
hấp thu vitamin nội sinh.
- Ðiều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi
dùng thuốc kháng sinh hoặc hóa trị liệu.
10


- Rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn
khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin.
B. clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng sinh
nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinh để ngăn
ngừa các tác dụng không mong muốn của kháng sinh (gây loạn khuẩn ruột).
Chế phẩm Enterogermina chứa 4 loài B. clausii, mỗi loài kháng một số
loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R kháng
novobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng streptomycin và
neomycin [38].

Hình 1.9: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi – Aventis.
1.3. Sự hình thành bào tử và các phƣơng pháp thu bào tử:
1.3.1. Sự hình thành bào tử
Hình 1.10: Sự hình thành bào tử [2].
1
n
2
0
n 7
n 5
n
6
n

4
n 3
11


Pha 1: Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome
riêng biệt.
Pha 2: Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần
không đều nhau.
Pha 3: Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất.
Pha 4: Vỏ bào tử được hình thành.
Pha 5: Áo bào tử được hình thành.
Pha 6: Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử.
Quá trình hình thành bào tử mất khoảng 6 - 8h, là quá trình tương đối
phức tạp và không thể đảo ngược để tạo ra được cấu trúc bền vững chịu được
điều kiện khắc nghiệt .
Khi gặp điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, độ ẩm, dinh dưỡng, cấp khí…
bào tử sẽ nảy mầm trở thành tế bào sinh dưỡng [2].
1.3.2. Sức đề kháng của bào tử:
Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng cao đối với các điều kiện bất lợi:
- Đề kháng với nhiệt độ cao: vì nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái
liên kết, nên không có khả năng gây biến tính protein. Hơn nữa, trong bào tử,
protein tồn tại dưới dạng liên kết với canxi dipicolinat thành một phức chất có
tính ổn định cao với nhiệt độ.
- Đề kháng với các chất hóa học (acid, kiềm…), các chất sát khuẩn: vì
cấu trúc vỏ bào tử gồm nhiều lớp, ít tính thẩm thấu nên các chất hóa học khó
có thể tác động đến tế bào [2].
1.3.3. Các phương pháp giải phóng nội bào tử:
12

Trong khi quy trình giải phóng enzym nội bào hay vật chất di truyền đã
được nghiên cứu khá nhiều ở trong và ngoài nước thì quy trình giải phóng và
thu nội bào tử vẫn còn ít được biết đến.
Tuy nhiên, vẫn có một nguyên tắc chung cho cả ba vấn đề này là: muốn
thu được các phần tử nội bào, việc đầu tiên là phải phá vỡ vỏ tế bào.
Có ba phương pháp chính để giải phóng phần tử nội bào khỏi vi sinh
vật đó là phương pháp vật lý, hóa học và enzym. Tuy nhiên, không phải tất cả
các kỹ thuật đều thích hợp trên quy mô lớn. Ở quy mô sản xuất công nghiệp,
người ta thường gặp khó khăn trong việc thiết kế công suất cần thiết cho thể
tích lớn và loại bỏ nhiệt được sinh ra trong quá trình phá vỡ tế bào.
 :
- Phá vỡ tế bào bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm: Phương
pháp này chỉ thích hợp ở quy mô phòng thi nghiệm
- Phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp:
Loại máy được sử dụng phổ biến để phá vỡ tế bào là Manton - Gaulin
APV. Dịch huyền phù tế bào được đẩy với áp suất và vận tốc cao qua 1 van
xả có miệng hẹp. Các tế bào sẽ bị vỡ và giải phóng các chất bên trong khi làm
giảm áp suất sau van. Phương pháp này thích hợp để phá vỡ các vi khuẩn đơn
bào, không thích hợp với các loại sống thành tập đoàn dạng sợi.
- Phá vỡ tế bào bằng cách nghiền hoặc khuấy với các bột, hạt thủy
tinh hoặc thép:
Dịch huyền phù tế bào được lắc cùng với hạt thủy tinh hoặc thép nhỏ (d
= 0,2- 1,0 mm) thì tế bào sẽ bị phá vỡ bằng lực cắt do sự va chạm với các hạt
này.
- Phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông:
13


Huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão rồi đem làm lạnh ở -20°C, sau đó

đem nén dưới áp suất cao qua các lỗ hẹp của máy nén Hughes. Tế bào sẽ bị
phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như lực cắt của các tinh
thể đá.
 Phương pháp hóa học:
- Xử lý kiềm:
Môi trường kiềm (pH = 11,6- 12,5) sẽ làm thủy phân màng tế bào. Xử
lý bằng kiềm đã được sử dụng thành công trong tách chiết ở quy mô nhỏ và
lớn các protein vi khuẩn. Ví dụ, enzym trị liệu, L-asparaginase, có thể được
giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào ở pH =11,0-12,5
trong 20 phút.
- Sử dụng chất tẩy rửa:
Trong điều kiện pH, lực ion và nhiệt độ nhất định, các chất tẩy rửa như
natrilaurylsulfat, tween 20, triton sẽ tổ hợp với lipoprotein màng tạo ra các
mixen làm suy yếu màng tế bào.
 Phương pháp enzym:
Lysozyme thủy phân peptidoglucan có trên thành tế bào vi khuẩn, làm
suy yếu thành tế bào, từ đó phá vỡ tế bào. Mặc dù quá trình thao tác đơn giản
và nhẹ nhàng, nhưng kỹ thuật này ít được sử dụng cho quy mô công nghiệp,
có lẽ do giá thành tương đối cao của lysozyme và khả năng đưa vào các tác
nhân gây nhiễm bẩn [9], [10].
14

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI
DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất
 Các hóa chất sử dụng:
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất
Xuất xứ

Hóa chất sử dụng pha môi trƣờng
Natri clorid
Trung Quốc
Pepton
Trung Quốc
Cao thịt
Trung Quốc
Thạch bột
Việt Nam
Hóa chất sử dụng thu bào tử
Lysozyme
Viện kiểm nghiệm
Na
2
EDTA
Trung Quốc
H
2
SO
4
98%
Trung Quốc
NaOH
Trung Quốc
KH
2
PO
4
Trung Quốc
KCl

Trung Quốc
Natrilaurylsulphat (SDS)
Trung Quốc

 Các dung dịch sử dụng trong đề tài:
- Dung dịch đệm phosphate pH 7,6:
Pha dung dịch KH
2
PO
4
0,2M (500ml): 0,2×0,5×136=13,6 g
Pha dung dịch NaOH 0,2M (500ml): 0,2×0,5×40=4,0 g
15

Trộn 50ml dung dịch KH
2
PO
4
0,2M với 42,8ml dung dịch NaOH 0,2M rồi
thêm nước vừa đủ 200ml.
- Dung dịch KCl 1M: Hòa tan 7,45g KCl trong vừa đủ 100ml nước.
- Dung dịch NaCl 1M: Hòa tan 5,84g NaCl trong vừa đủ 100ml nước.
- Dung dịch H
2
SO
4
10%: Đổ 6ml H
2
SO
4

đặc vào khoảng 50ml nước đá,
chờ tan hết rồi thêm nước vừa đủ 100ml.
- Dung dịch NaOH các nồng độ:
Dung dịch NaOH 20%: Hòa tan 20g NaOH trong vừa đủ 100ml nước đã
đuổi CO
2
.
Dung dịch NaOH 10%: Thêm nước cất vừa đủ 100ml vào 50ml dung dịch
NaOH 20%.
Dung dịch NaOH 0,4%: Thêm nước vừa đủ 100ml vào 4ml NaOH 10%.
- Dung dịch SDS 3%: Hòa tan 3g SDS trong vừa đủ 100ml nước cất.
- Dung dịch EDTA pH 8: Hòa tan 18,61g Na
2
EDTA trong khoảng 80ml
nước cất, thêm NaOH 10% vào để điều chỉnh pH về 8,0. Thêm nước cất vừa
đủ 100ml.
- Dung dịch lysozym1mg/ml: hòa tan 0,100g lysozymtrong vừa đủ
100ml nước cất tiệt trùng.
2.1.2. Máy móc, thiết bị
Bảng 2.2: Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị
Xuất xứ
Tủ cấy
Bioair (Italy)
Máy ly tâm
Rotofix (Đức)
Nồi hấp
ALP (Nhật)
Tủ lạnh
Toshiba (Nhật)

16

Tủ ấm
Memmert (Đức)
Tủ sấy
Memmert (Đức)
Tủ lắc
Bioshake (Đức)
Máy vortex
IKA (Đức)
Lò vi sóng
Daewoo (Hàn Quốc)
Nồi cách thủy
Trung Quốc

Branson (USA)
Kính hiển vi Labomed
Mỹ
Cân kỹ thuật
Sartorius (Đức)
Cân phân tích
Sartorius (Đức)
Bình hút ẩm
Trung Quốc

Pipet, ống nghiệm, đầu côn, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống ly
tâm, giấy lọc
2.1.3. Môi trường sử dụng
 Môi trường canh thang (MT 1)
Natri clorid 0,5g

Cao thịt 0,5g
Pepton 1g
Nước máy vđ 100ml
 Môi trường thạch thường (MT 2) = MT 1 + 1,8g thạch
 Môi trường thạch không (MT 3)
Thạch bột 2,0g
Nước cất vđ 100ml

17

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn các phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo
nguyên liệu chứa bào tử.
2.2.2. Khảo sát lý ảy mầm
trong quá trình bảo quản.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina:
Pha 100 ml môi trường canh thang (MT1) trong bình nón dung tích 250
ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm
trong 20 phút, để nguội. Tiến hành cấy giống B. clausii từ chế phẩm vào bình
nón trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở 37°C, 110 vòng/phút
trong 24h.
Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường.
2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng:
Pha môi trường canh thang thạch (MT 2), đun sôi cho đồng nhất các
thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6 ml, nút kín,
hấp tiệt trùng ở 1 atm trong 20 phút. Để nguội bớt rồi đặt nghiêng. Dùng que
cấy vô trùng, cấy giống trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng theo
hình ziczac trong tủ cấy vô trùng, để trong tủ ấm 37°C, trong khoảng 24h. Sau
khi khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnh.

Định kỳ 2 tháng cấy truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn.
2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống:
Chuẩn bị 100ml môi trường MT1 trong bình nón dung tích 250ml. Hấp
tiệt trùng ở 1atm trong 20 phút. Để nguội, dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn
lạc trong ống nghiệm chứa giống vào môi trường. Để trong máy lắc 110
vòng/phút ở 37
0
C trong 24h.