nghiên cứu sử dụng ALGINAT làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







HÀ THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT
LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ
Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



HÀ THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT
LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ
Lactobacillus acidophilus


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp Dược





HÀ NỘI- 2014
LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Trước tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm
ơn chân thành tới TS Đàm Thanh Xuân, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh, người đã giúp đỡ và cho
tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công

nghiệp Dược đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn.
Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô trong
trường đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học ở trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người
đã luôn luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Hà Thị Thanh Huyền





MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 2
1.1.1. Khái niệm Probiotic 2
1.1.2. Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic 2
1.1.3. Vai trò 3
1.1.4. Cơ chế tác dụng 5
1.2. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 5
1.2.1. Khái niệm 5

1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô 5
1.2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 6
1.2.4. Ứng dụng của phương pháp đông khô 6
1.2.5. Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 7
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC 10
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15
2.1.3. Thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat
và phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô 16
2.2.2. Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp nhân giống 17
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17
2.3.3. Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa L. acidophilus 17
2.3.4. Phương pháp xác định hàm ẩm 18
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng
liên tục 19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat
và phƣơng pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô 21
3.1.1. Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus
acidophilus tạo thành sau khi đông khô 21
3.1.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ của alginat trong quá trình đông khô
Lactobacillus acidophilus khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau 24
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối ban đầu đến số lượng vi sinh vật

sống sót của nguyên liệu đông khô 28
3.2. Đánh giá chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC
: American Type Culture Collection
(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì)
CFU, cfu
: Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc)
ĐK
: Đông khô
EDTA
: Dinatriethylen diamintetraacetat
FAO
: Food and Agriculture Organization
(Tổ chức Nông lương thế giới)
IDF
: International Dairy Federation
(Liên đoàn bơ sữa thế giới)
MRS
: de Man, Rogosa, Sharpe
MT
: Môi trường
N/D

: Nước trong dầu
NL
: Nguyên liệu
PPI
: Proton-pump inhibitor (Thuốc ức chế bơm proton)
VSV
: Vi sinh vật
WHO
: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)










DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
15
2
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
16
3

Bảng 3.1. Các mẫu nguyên liệu khảo sát thể chất
21
4
Bảng 3.2. Thể chất của một số mẫu nguyên liệu đông khô chứa
Lactobacillus acidophilus
22
5
Bảng 3.3. Các mẫu nguyên liệu khảo sát số lượng vi sinh vật
25
6
Bảng 3.4. Số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu nguyên liệu
sau đông khô
26
7
Bảng 3.5. Số lượng vi sinh vật sống sót và hàm ẩm của các mẫu
hạt đông khô chứa L. acidophilus
29
8
Bảng 3.6. Hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo
quản
34
9
Bảng 3.7. Số lượng VSV của các mẫu nguyên liệu trong thời
gian bảo quản
35

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1. Công thức cấu tạo của acid α – L - guluronic và β – D –
mannuronic
9
2
Hình 2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng sinh khối
ướt thu được vào tổng thể tích dịch nuôi cấy
30
3
Hình 3. Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật trong 1g hạt chưa
đông khô khi thay đổi thể tích dịch nuôi cấy ban đầu
31
4
Hình 4. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và hàm
ẩm của các mẫu nguyên liệu sau đông khô theo thể tích dịch nuôi
cấy
32
5
Hình 5. Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu đông
khô trong thời gian bảo quản
34
6

Hình 6. Đồ thị biểu diễn số lượng L. acidophilus trong các mẫu
nguyên liệu trong thời gian bảo quản
36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ
probiotic đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Probiotic ngày càng được bào chế
dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên
nang hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi
da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotic trong các
chế phẩm này rất nghèo nàn [37], [39]. Nguyên nhân là do các vi sinh vật này rất
nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm,
nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình
bảo quản và sau khi vi khuẩn được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm
đáng kể làm hạn chế tác dụng của chế phẩm [30], [33].
Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống
sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong
sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong
thời gian gần đây là sử dụng alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ
sống sót của các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô.
Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng
alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus”
nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và
phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô.
2. Đánh giá chất lượng của nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản.

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Khái niệm Probiotic
Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự
sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người
và cho vật chủ [45].
Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên
men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà
khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở
khoa học. Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi
Kollath. Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự
phát triển của các vi khuẩn khác” [19]. Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa
khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác
động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [36].
Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về
Probiotic ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi
đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật
chủ” [44], [45]. Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế
phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa. Do trong
quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của
đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotic phải chứa ít nhất
10

6
– 10
7
cfu/ml tế bào VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác
dụng điều trị (FAO/WHO) [23], [40].
1.1.2. Các vi sinh vật thƣờng dùng trong các chế phẩm probiotic
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là:
Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Trong đó,
Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [40].
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc
nhóm vi khuẩn lactic. Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước
3

từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0µm, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi ngắn không sinh
bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Nhiệt độ
phát triển: tối ưu 37
o
C, không phát triển trong khoảng 20
o
C – 22
o
C, tối đa trong
khoảng 43
o
C – 48
o
C. Tên gọi của loài có nghĩa là “ưa acid” cho thấy loài có thể
phát triển trong môi trường acid, pH khoảng 5 - 6, thời gian 24 – 36h [2].
L. acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở đoạn
trên của ống tiêu hóa [22]. Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật

hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong
quá trình chuyển hóa sữa. Trong quá trình tiêu hóa, L. acidophilus còn tham gia sản
sinh niacin, acid folic, pyridoxin. Một vài nghiên cứu đã chứng minh L. acidophilus
làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch cơ thể, ngăn
chặn bệnh tiêu chảy và làm giảm triệu chứng khó tiêu [22].
Với những đặc điểm trên, L. acidophilus là lựa chọn hàng đầu để sản xuất các
chế phẩm probiotic.
 Đặc điểm hạn chế của L. acidophilus
Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, sự
acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan
(khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ
ổn định của dạng khô hoặc đông khô [38], [39]. Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có
vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau
một thời gian bảo quản, số lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [20].
1.1.3. Vai trò
Probiotic có một số tác dụng chính như sau:
 Ứng dụng trị liệu trong một số bệnh đường tiêu hóa ở người:
- Ngăn chặn bệnh tiêu chảy:
Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên
quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người đi du lịch,
tiêu chảy do không dung nạp lactose. Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng
chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn
4

Lactobacillus rhamnosus GG và nấm men S. boulardii (S. cerevisiae) [42]. Các tác
nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, B. longum, L. acidophilus, L.
bulgaricus, L. plantarum, Enterococcus faecium, Clostridium butyricum [9], [42].
- Tác dụng lên Helicobacter pylori (H. pylori)
Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh loét
dạ dày tá tràng. Các nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và

kháng sinh với chế phẩm probiotic đã làm giảm đáng kể tác dụng không mong
muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa. Do vậy, sử dụng probiotic
để phòng ngừa các bệnh lí liên quan đến viêm loét dạ dày tá tràng là một hướng
điều trị được chú ý trong những năm gần đây [22], [16], [41].
Ngoài ra, probiotic còn có một số tác dụng khác như: “tăng cường khả năng tiêu
hóa lactose và hoạt động của các enzym khác”, “điều trị rối loạn tiêu hóa do dùng
kháng sinh” [9], “viêm ruột mạn tính”, “bội nhiễm ở ruột non”, “điều trị ung thư
ruột kết” [22].
 Tăng cường miễn dịch
Vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng
sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc
hiệu - miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và
tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [6], [30], [35], [40].
 Hạ cholesterol máu
Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không thể tiêu hóa được và tạo
các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol
trong gan hoặc tái phân phối cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm
lượng cholesterol trong máu. Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở
sự hấp thu cholesterol từ đường ruột [19], [27], [28], [41].
 Chống lại tác nhân gây ung thư
Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác
nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như
5

nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải
phóng flavonoids, sản xuất các chất chống oxy hóa [19].
1.1.4. Cơ chế tác dụng
- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám
Probiotic khi phát triển trong đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh chất dinh dưỡng và
năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh, từ đó hạn chế sự sinh trưởng và phát triển

của chúng. Một số nghiên cứu in vitro cho thấy cả hai dạng vi khuẩn L. acidophilus
còn sống hoặc đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi
khuẩn gây bệnh [6], [45].
- Kích thích đáp ứng miễn dịch
Bằng việc bám dính vào niêm mạc ruột – nơi có nhiều tế bào lympho, probiotic
kích thích cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch toàn bộ cơ thể. Chúng làm tăng cả
miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào tham gia phản
ứng miễn dịch (macrophase, lymphocytes) và tăng cường sản xuất các chất tham gia
miễn dịch (cytokines, immunoglobulins, interferon) [40].
Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “sản sinh ra các chất kháng
khuẩn”, “tăng cường khả năng chống đỡ của niêm mạc ruột”, “tăng cường chức
năng của hệ tiêu hóa” [6], [30].
1.2. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ
1.2.1. Khái niệm
Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách
thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua
trạng thái lỏng. Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể
rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu. Như vậy, đông khô được thực
hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm). Chế độ
làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước. Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa
của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [34].
1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông
6

Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên
ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn,
đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [34].
 Giai đoạn thăng hoa
Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không.

Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải
thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà
không qua trạng thái lỏng [34].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại
Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng
thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết
bị sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao
hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [34].
1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp đông khô
 Ưu điểm
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng
rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy
khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo
vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ
nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ
nước để trở lại trạng thái ban đầu [34].
 Nhược điểm
- Giá thành thiết bị cao.
- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao.
- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao.
Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản
phẩm phải có chất lượng cao [34].
1.2.4. Ứng dụng của phƣơng pháp đông khô
7

Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng
sinh (penicillin, cephalexin ); làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh
vật. Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong
các ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y để bảo quản một số sản phẩm
khác [34].

1.2.5. Một số tá dƣợc bảo vệ thƣờng dùng trong đông khô vi sinh vật
Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng lớn
vi sinh vật với nồng độ cao [13]. Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp
phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông. Một số nghiên
cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng
là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào. Các tinh thể nước đá lớn hình
thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất
tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình
trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá
hủy các cơ quan trong tế bào. Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên
trong tế bào. Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng,
nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí
trong tế bào và phá vỡ bào quan [14]. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết
tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng vi khuẩn tế bào vi
khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, độ nhạy cao hơn với không khí và
mất khả năng sinh sản [33]. Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này,
nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [13].
Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được
thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá
trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [33].
Một số tá dược được sử dụng trong đông khô:
- Sữa gầy: là sữa béo đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ
yếu), acid amin, các vitamin và khoáng chất.
- Các loại đường: glucose, lactose, dextrin glucose,
8

- Các acid amin: arginin, acid glutamic,
- Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polyme.
 Sữa gầy
Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần

có chứa không quá 0,5% chất béo. Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy:
32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose.
Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt
probiotic trong quá trình đông khô. Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ
trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất.
Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ lớn protein và carbohydrat - những chất
có khả năng bảo vệ tế bào.
Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể
thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường - protein.
Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi. Protein
giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi
trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở
mức thấp nhất [17].
Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo
vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong
nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [33].
Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước
dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh
nếu không được bảo quản tốt.
 Alginat
 Nguồn gốc, cấu trúc của alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic với các ion kim loại như
Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
, Na
+

Alginat có nguồn gốc chủ yếu từ tảo nâu, rong mơ
Sargassum polycystum, S. kjellmanianum,
9

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M) [13], [25].


Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic
Hình 1. Công thức cấu tạo của acid α - L - guluronic và β – D - mannuronic
Hai monome này gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết
này không phải ngẫu nhiên mà thành block: block homopolyguluronic (GGGG),
block homopolymannuronic (MMMM), block liên hợp (MGMG).
Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài
của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này
làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [13], [25].
 Một số tính chất của alginat
Độ hòa tan: Các muối kim loại hóa trị I (Na
+
, K
+
), muối amoni và muối của
các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước tạo dung dịch keo
nhớt. Các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba
2+
) không tan
trong nước (trừ muối Mg
2+

). Các muối alginat hòa tan được trong các dung môi
thân nước như alcol, aceton và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [25].
Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao
động trong khoảng từ 10 – 3500 cps. Độ nhớt của dung dịch alginat ảnh hưởng bởi
khối lượng phân tử trung bình, nồng độ alginat sử dụng, nhiệt độ pH và sự có mặt
của các ion kim loại có trong dung dịch.
Sự gel hóa: Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion
kim loại hóa trị II, III. Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ hơn
100
o
C, không tan chảy khi đun nóng. Sự tạo gel được giải thích bằng mô hình cấu
10

trúc phân tử của alginat - mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic
(MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp
nếp như vỉ trứng. Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel
xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của
đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt quả trứng. Các ion
Ca
2+
khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm chức carboxyl và các
nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song để hình thành gel alginat [11], [25]. Với tính
chất này, alginat được sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ cố định tế bào và vi
nang hóa.
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC
Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô,
tạo cốm Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được
nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy
nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao. Để cải thiện số lượng vi khuẩn
sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi trường

như pH thấp ở dạ dày, các enzym tiêu hóa , trên thị trường đã có các sản phẩm
probiotic được bào chế dạng pellet, vi nang và được bao bảo vệ tới thế hệ 4 [4].
Thế hệ 1
Không bao nhƣ bột, cốm, pellet (Non – Coated)

Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3
Vi nang hóa (Micro – Encapsulated)

Thế hệ 4
Bao 2 lớp ( Dual – Coated)
11

Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị
trường là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong
quá trình bảo quản thời gian dài. Ngoài ra, bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt
nhất để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén, viên
nang.
Nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng VSV sống sót trong các chế phẩm probiotic
rất nghèo nàn. Hơn thế, khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong hệ thống tiêu hóa là
một vấn đề lớn cần giải quyết. Cung cấp cho các tế bào sống một rào cản vật lý để
chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường là một trong những hướng tiếp cận
được quan tâm hiện nay, trong đó phải kể đến công nghệ vi nang hóa [37].
 Kỹ thuật vi nang hóa probiotic
Kỹ thuật vi nang hóa phát triển từ kĩ thuật cố định tế bào trong công nghệ sinh
học. Vi nang hóa là sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự
nhiên hoặc nhân tạo để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống, kết
quả tạo thành các hạt vi nang hình cầu có kích thước từ 0,1µm tới 2mm [37], [39].

Ưu điểm: Vi nang hóa cho phép cố định tế bào với số lượng lớn so với các
phương pháp khác; đồng thời tạo ra lớp màng bảo vệ cách li tế bào vi khuẩn khỏi
môi trường cho đến khi tế bào được giải phóng, bảo vệ vi khuẩn khỏi các tác động
bất lợi của môi trường, từ đó tăng độ ổn định, tăng tuổi thọ của vi khuẩn và kiểm
soát giải phóng. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và dễ triển khai ở quy mô
công nghiệp [39].
Tá dược vi nang hóa
Tá dược phổ biến nhất dùng để vi nang hóa vi sinh vật là alginat.
Ưu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định
cao. Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình bất động nhờ tính
thuận nghịch của gel: hòa tan lại trong môi trường có chứa ion Calci hoặc pH hơi
kiềm sẽ giúp giải phóng các tế bào bên trong. Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao
và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức.
12

Nhược điểm: Khi có mặt acid lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm
giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài.
Các chất tạo gel khác gồm: chitosan, carboxylmethyl cellulose (CMC), gelatin,
pectin, gôm kappa-carrageenan-locust đậu, gellan và agar.
Các kỹ thuật vi nang hóa
 Trong phòng thí nghiệm
Kỹ thuật tách pha đông tụ
Tế bào vi khuẩn và polyme được tạo thành hỗn dịch và được bơm qua một đầu
kim phun, tạo thành các giọt nhỏ hình cầu và hóa rắn lại khi rơi xuống một dung
dịch hóa rắn [37].
Kỹ thuật nhũ hóa
Tạo một hệ nhũ tương N/D gồm pha nội thân nước là hỗn dịch polyme chứa vi
khuẩn và pha ngoại thân dầu. Các giọt nhũ tương polyme chứa vi khuẩn sẽ được
hóa rắn bằng cách làm lạnh nhanh hoặc bằng một tác nhân hóa rắn [37].
 Trong công nghiệp

Trong công nghiệp, thường tiến hành vi nang hóa vi sinh vật bằng các kĩ thuật
sấy phun (spray drying), kỹ thuật phun sương và kỹ thuật nhũ hóa. Trong đó, kỹ
thuật sấy phun là kỹ thuật phổ biến nhất bởi tính kinh tế, linh hoạt và tạo ra sản
phẩm có chất lượng cao [37].
Một số nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa
Các công trình tiên phong trong lĩnh vực cố định tế bào được thực hiện bởi
Chibata (1979) sử dụng tế bào VSV cố định cho sản xuất liên tục acid L- aspartic
[39]. Năm 1978, Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố định tế bào vi
sinh Arthrobacter simplex bằng gel calci alginat. Từ đó đến nay, đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa tế bào vi khuẩn.
 Trên thế giới
Năm 1989, những nghiên cứu của A. V. Rao và cộng sự đã chứng minh vi nang
hóa làm tăng khả năng sống sót của Bifidobacterium pseudolongum trong môi
trường dạ dày, ruột [12].
13

Từ 1990 - 1998, đã có thêm nhiều nghiên cứu về các lợi ích của quá trình vi
nang hóa tế bào bằng alginat như: bảo vệ các tế bào bên trong các hạt vi nang khỏi
các chủng phages [32]; bảo vệ tế bào vi khuẩn trong quá trình đông khô và bảo quản
lạnh [26], [31], [43]; tăng độ ổn định trong quá trình bảo quản [24], [29].
Những năm gần đây, vi nang hóa trở thành một lĩnh vực đang được quan tâm
nghiên cứu rất nhiều. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm tìm ra những lợi ích của vi
nang hóa tế bào [13], [41]; cải thiện các kĩ thuật vi nang hóa [15], [18], [21], [44]
hay cải thiện đặc tính của vi nang [20], [38], [44].
Năm 2004, V. Chandramouli và cộng sự tiến hành nghiên cứu để tối ưu hóa quá
trình vi nang hóa nhằm tăng hiệu quả của vi nang trong việc bảo vệ các vi khuẩn
trong điều kiện mô phỏng dạ dày [21].
Năm 2008, theo báo cáo của Se-Jin Kima và cộng sự, vi nang hóa làm tăng tỉ lệ
sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình xử lí nhiệt, tăng khả năng tồn
tại trong môi trường pH dạ dày; không ảnh hưởng đến khả năng bám dính vào ruột

và các dòng tế bào biểu mô của con người, không làm giảm tác dụng giảm
cholesterol của chủng này [41].
Năm 2012, T. P. Ivanovska và cộng sự đã tiến hành vi nang hóa vi khuẩn
Lactobacillus casei trong vi hạt chitosan-Ca-alginat bằng phương pháp sấy phun,
kết quả tạo ra các vi hạt có kích thước nhỏ và ổn định hơn trong môi trường dạ dày-
ruột so với khi chỉ sử dụng alginat để vi nang hóa [44].
Năm 2014, Sha Cai đã tiến hành nghiên cứu cải tiến phương pháp vi nang hóa
bằng kĩ thuật nhũ tương hóa bằng cách thay CaCO
3
bằng Ca-EDTA, thu được các vi
nang đồng đều hơn về kích thước và số lượng vi khuẩn trong vi nang tương tự như
khi sử dụng CaCO
3
[18].
 Việt Nam
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa
cũng đang được quan tâm và nghiên cứu. Nhiều nghiên cứu chứng minh vi nang
hóa bằng alginat có tác dụng bảo vệ vi khuẩn probiotic trong môi trường dạ dày –
ruột tốt hơn so với dạng tự do [1], [7]. Theo nghiên cứu của tác giả Quách Thu
14

Trang (2010), sử dụng alginat 2% hóa rắn trong dung dịch CaCl
2
2% cho vi nang
dạng cầu ổn định và sử dụng tá dược độn là sữa gầy 10% có tác dụng nâng cao tỉ lệ
sống sót của vi sinh vật trong quá trình đông khô và trong quá trình bảo quản [8].
Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang trên thị trường
- Lactomin plus
Thành phần: Mỗi gói 3g chứa:
Hỗn hợp vi khuẩn lactic dạng vi nang gồm: Lactobacillus acidophilus,

Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis (10
8
cfu/g): 300mg.
Tá dược: bột Vegetable cream, fructo-oligosaccharid, bột hương yaourt.
Nhà sản xuất: Novarex / Me-Auspharm JV.
- Pro-X10
Thành phần: Vi nang probiotic chứa: 8.10
9
CFU (Bifidobacterium breve,
Bifidobacterium lactis, L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus);
Lactobacillus salivarius 2.10
9
CFU; Bacillus subtilis 4.10
9
CFU;
Saccharomyces boulardii 4.10
9
CFU, Actazin : 250mg.
Nhà sản xuất: Biotrust.
- Probyo
Thành phần: 6.10
9
CFU (L. acidophilus R-52, L. rhamnosus R-11, B. longum
R-175, Saccharomyces boulardii 74012)
Nhà sản xuất: Montreal, Canada.

15

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653
 Nguyên liệu :
Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Trung Quốc
Sữa gầy
Trung Quốc
Pepton
Ấn Độ
Alginat
Ấn Độ
Cao thịt
Merck- Đức
Triamoni citrat
Trung Quốc
Cao nấm men
Merck- Đức

Acetat natri
Trung Quốc
K
2
HPO
4

Trung Quốc
MnSO
4
.4H
2
O
Trung Quốc
MgSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc
Natri citrat
Trung Quốc
Calci clorid
Trung Quốc
Thạch agar
Việt Nam

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
 MRS lỏng (MT1).
Glucose 20g Acetat natri 5g

Pepton 10g K
2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2
O 0,05g
Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1000ml
pH 6,8÷7,0
 Môi trường MRS đặc (MT2).
MT2 = MT1 + thạch agar (22g/1000ml môi trường).
16

2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Tủ cấy vô trùng
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)

Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Thiết bị đông khô
Đức
Máy li tâm
Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP - Nhật
Cân phân tích
Đức (Satorious)
Cân kĩ thuật
Đức (Satorious)
Máy đo hàm ẩm
MB23/25 – Ohaus - Mỹ
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex)
Đức
Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu
côn, pipet, cốc có mỏ, ống ly tâm…


2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và
phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô
 Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa L. acidophilus tạo thành
sau đông khô.
 Khảo sát tác dụng bảo vệ của alginat trong quá trình đông khô Lactobacillus

acidophilus khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau.
 Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối ban đầu đến số lượng vi sinh vật sống
sót của nguyên liệu đông khô.
17

2.2.2. Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản
 Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời
gian bảo quản.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức
nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan hết các thành phần. Phân chia môi trường vào các
ống nghiệm sạch bằng phễu thủy tinh, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng. Đậy kín
bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115
o
C/20
phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Sau khi tiệt khuẩn để nguội xuống khoảng 37 ÷ 40
o
C.
Cấy giống vào ống nghiệm trên. Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống VSV trong
tủ ấm 5% CO
2
trong 24h ở 37±1
o
C.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (theo công
thức đã nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan các thành phần trong công thức trong cốc có
mỏ. Chuyển môi trường MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp. Đậy kín
miệng bình bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 115

o
C/20 phút trong nồi hấp tự động.
Lấy ra, để nguội xuống khoảng 37÷ 40
o
C. Cấy giống vào các bình nón trên trong tủ
cấy vô trùng (tỉ lệ cấy giống: 10% thể tích môi trường). Ủ trong tủ ấm 5% CO
2

trong 24h ở nhiệt độ 37±1
o
C.
2.3.3. Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa L. acidophilus
 Phương pháp thu sinh khối
Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS ở điều kiện 37
o
C trong
24h trong tủ ấm 5% CO
2
(như phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Gạn bớt phần
dịch trong phía trên, phần hỗn dịch sinh khối phía dưới đong vào các ống li tâm. Li
tâm các ống này với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy các ống li tâm khỏi
máy, loại bỏ phần dịch trong, giữ lại phần cắn sinh khối phía dưới, thu được sinh
khối từ các bình nuôi cấy.
 Phương pháp tạo nguyên liệu dạng bột