Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư của lá cây mãng cầu xiêm ( annona muricata l ) họ annomaceae

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THU TRANG


NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
TẾ BÀO UNG THƢ CỦA LÁ CÂY
MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L.),
HỌ ANNONACEAE

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ









Hà Nội, năm 2014
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG


NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
TẾ BÀO UNG THƢ CỦA LÁ CÂY
MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L.),
HỌ ANNONACEAE

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Đỗ Quyên
2. ThS, NCS Hồ Đắc Hùng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng ĐH Dƣợc,
Hà Nội
2. Viện Hóa học, Viện hàn lâm khoa học
và công nghệ Việt Nam



Hà Nội, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Quyên, ngƣời
thầy đã ủng hộ, giúp đỡ, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình làm khoá luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS., TS. Phạm Gia Điền, TS. Bùi Kim
Anh, Th.S, NCS. Hồ Đắc Hùng đã giúp đỡ, góp ý cho tôi trong quá trình
làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Phòng Công nghệ các hoạt
chất sinh học, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và cảm ơn tới Ban giám
hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã luôn
đồng hành, tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập, tiếp thu những kiến thức và
kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi để tôi có thêm nghị
lực và say mê nghiên cứu khoa học.

Hà nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014
Nguyễn Thu Trang





MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
i
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH

iii
MỤC LỤC
iv
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƢƠNG I- TỔNG QUAN
2
1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật
2
1.1.1. Vị trí phân loại của loài Mãng cầu xiêm
2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Annona
2
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Annona muricata L.
3
1.2. Thành phần hóa học
3
1.2.1. Các hợp chất acetogenin
3
1.2.2. Các hợp chất alcaloit
6
1.2.3. Tinh dầu
7
1.2.4. Sterol
8
1.2.5. Carotenoit
8
1.2.6. Các nhóm chất khác
9
1.3. Tác dụng sinh học

9
1.4. Công dụng
12
CHƢƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
14
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
14
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
14
2.1.2. Dung môi, hóa chất
14
2.1.3. Thiết bị
14
2.1.3.1. Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập
14
2.1.3.2. Dùng cho xác định thông số vật lý và hóa học của các chất
15

2.1.3.3. Dùng cho thử hoạt tính gây độc tế bào
15
2.2. Nội dung nghiên cứu
16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
16
2.3.1. Nghiên cứu về hoá học
16
2.3.1.1. Chiết xuất
16
2.3.1.2. Phân lập

17
2.3.1.3. Nhận dạng
17
2.3.2. Thử tác dụng gây độc tế bào
17
2.3.2.1. Các dòng tế bào
17
2.3.2.2. Phƣơng pháp thử tác dụng gây độc tế bào
17
CHƢƠNG 3- THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
19
3.1. Thực nghiệm và kết quả
19
3.1.1. Chiết xuất
19
3.1.2. Tác dụng gây độc tế bào ung thƣ
21
3.1.3. Phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan
22
3.1.3.1. Khảo sát sơ bộ cặn dịch chiết n-hexan bằng SKLM
22
3.1.3.2. Phân lập cặn dịch chiết n-hexan lá Mãng cầu xiêm bằng sắc
ký cột
24
3.1.3.3. Phân lập chất từ phân đoạn P27
27
3.1.3.4. Phân lập chất từ phân đoạn P71
28
3.1.3.5. Phân lập chất từ phân đoạn P55
29

3.1.4. Nhận dạng cấu trúc
30
3.1.4.1. Nhận dạng cấu trúc chất P27
30
3.1.4.2. Nhận dạng cấu trúc Chất P71
31
3.1.4.3. Nhận dạng cấu trúc Chất P55.7
33
3.2. Bàn luận
36
3.2.1. Tác dụng gây độc tế bào của dịch chiết n-hexan từ lá cây
Mãng cầu xiêm
36

3.2.2. Về thành phần hoá học
37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
40
PHỤ LỤC
46

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
1
H-NMR
Proton Nuclear magnetic resonance
13
C-NMR

Cacbon (13) Nuclear magnetic resonance
AST
Ánh sáng thƣờng
ATCC
American type culture collection
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
DMEM
Eagle's minimal essential medium
DMSO

Dimethyl sulfoxide
EC
50

The term half maximal effective concentration
EI-MS
Electron ionization – Mass sprectromery
IC
50
The half maximal inhibitory concentration
J (Hz)
Hằng số tƣơng tác tính bằng Hertz
KB
Human epidermic carcinoma
LU
Human lung carcinoma
MCF7
Human breast adenocarcinoma
RPMI
Roswell Park Memorial Institute medium
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự

TMS
Tetramethylsilane
UV
Ultra violet
d

Duplet
dd
Duplet của duplet
m
Multiplet
t
Triplet
δ (ppm)
Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm
ppm
Phần triệu













DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH
Danh mục các hình
Hình 1.1: Khung cấu trúc chung của acetogenin
4
Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của acetogenin mạch thẳng
4

Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy
5
Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran
6
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran
6
Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit
7
Hình 1.7: Khung cấu trúc cơ bản của sterol
8
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất bột lá cây Mãng cầu xiêm
20
Hình 3.2: Sắc kí đồ của cặn dịch chiết n-hexan của lá mãng cầu xiêm
trong các hệ dung môi khác nhau quan sát ở AST
22
Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi
Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]
23
Hình 3.4: Sắc kí đồ của chất P27 trong hệ dung môi CH
2
Cl
2
: MeOH
[98:2], hiện màu bằng ceri sulfat
27
Hình 3.5: Sắc ký đồ của chất P71 trong hệ dung môi CH
2
Cl
2
: MeOH

[9:1]
,
hiện màu bằng ceri sulfat
29
Hình 3.6: Sắc ký đồ của chất P55.7 trong hệ dung môi CH
2
Cl
2
: EtOAc
[8:2], quan sát ở AST
30
Hình 3.7: Công thức cấu tạo β-sitosterol (P27)
31
Hình 3.8: Công thức cấu tạo của β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit
(P71)
33
Hình 3.9: Công thức cấu tạo của lutein (P55.7)
35





Danh mục các bảng

Bảng 3.1: Hàm lƣợng các cặn các dịch chiết của lá cây Mãng cầu xiêm
19
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của cặn dịch chiết n-hexan từ
lá cây Mãng cầu xiêm
21

Bảng 3.3: Kết quả SKLM của cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi
Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]
24
Bảng 3.4.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10]
34
Bảng 3.4.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10] (tiếp)
35
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng
rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống. Nhiều hợp chất thiên
nhiên hoặc các sản phẩm đƣợc tổng hợp, bán tổng hợp từ các hợp chất thiên
nhiên đã đƣợc sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa một
số bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo.
Theo thống kê, mỗi năm tại Việt Nam, số bệnh nhân ung thƣ mắc mới
là 150.000 ngƣời và có 75.000 ngƣời tử vong [39]. Các phƣơng pháp điều trị
ung thƣ thông thƣờng nhƣ hóa trị và xạ trị hay để lại tác dụng phụ, ảnh hƣởng
đến chất lƣợng cuộc sống của bệnh nhân. Vì vậy, tìm ra các liệu pháp mới
trong điều trị ung thƣ là một nhu cầu cấp thiết.
Hiện nay, cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) đang thu hút sự
quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Với kết quả thu đƣợc từ các
nghiên cứu tập trung theo hƣớng nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào, Mãng
cầu xiêm đƣợc coi nhƣ một dƣợc liệu đầy tiềm năng trong điều trị ung thƣ [7].
Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào về Mãng cầu xiêm trong khi loài thực
vật này đƣợc trồng phổ biến để khai thác quả và đem lại hiệu quả kinh tế rất
lớn. Các bộ phận khác của cây hầu nhƣ không đƣợc tận dụng. Vì vậy, để có
thể đóng góp thêm những hiểu biết giúp làm tăng giá trị của nguồn nguyên
liệu lớn, chúng tôi thực hiện đề tài : ‖Nghiên cứu thành phần hoá học và thử

hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của lá cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata
L.), họ Annonaceae‖ vơi hai mục tiêu chính:
- Nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây Mãng cầu xiêm.
- Thử hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của dịch chiết lá cây Mãng cầu
xiêm.

2


CHƢƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật
1.1.1. Vị trí phân loại của loài Mãng cầu xiêm
Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan, loài Annona muricata
L. thuộc chi Na (Annona), Họ Na (Annonaceae), Liên bộ Magnolianae, Phân
lớp Ngọc lan (Magnoliidae), Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), Ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) [32].
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
Liên bộ Magnolianae
Bộ Na (Annonales)
Họ Na (Annonaceae)
Chi Na (Annona)
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Annona
Mô tả: Cây gỗ hay cây bụi. Vỏ thân mỏng, có những vùng lõm rộng và
nông, hoặc những vết nứt nối với nhau, có vảy, từ những vết nứt này các chồi
cây mọc ra. Phiến lá mỏng, mềm dẻo, có lông hoặc không. Cuống hoa mọc từ
nách lá, đoi khi từ nách chồi, ở dạng hoa đơn hay chùm. Ba hay bốn lá đài
rụng sớm thƣờng nhỏ hơn cánh hoa phía ngoài và không bao kín khi còn nụ.
Sáu hay tám cánh hoa nạc mọc thành hai vòng, các cánh hoa mọc ở vòng

ngoài lớn hơn nhƣng không bao kín; các cánh hoa mọc ở vòng trong nhỏ hơn.
Nhị nhiều, cuộn lại, dạng chuỳ, hoặc cong và có dạng túi, hoặc nhọn ở đầu kia
bao phấn. Nhuỵ nhiều, gắn trực tiếp phần đáy, riêng rẽ liên kết với đầu nhuỵ,
với một hoặc hai noãn mỗi nhuỵ; vòi nhuỵ và đầu nhuỵ hình chuỳ hoặc hình
nón hẹp. Quả nạc, hình trứng hoặc hình cầu. Mỗi quả bao gồm có nhiều quả
3


nhỏ riêng biệt hoặc quả tụ, với một quả tụ và hạt mỗi nhuỵ. Hạt hình hạt đậu
với lớp áo cứng; nhân hạt độc [13].
Chi Na (Annona) có khoảng 125 loài phân bố nhiều ở các vùng rừng
mƣa nhiệt đới thuộc châu Mỹ, châu Phi… Ở Việt Nam có một số loài thuộc
chi Annona đƣợc phát hiện là: Annona cherimolia, Annona glabra, Annona
muricata, Annona reticulata, Annona squamosa [1].
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Annona muricata L.
Mô tả: Cây cao 4-6m; nhánh cây có nhiều mấu, nhẵn. Lá hình mũi mác-
trứng ngƣợc, hơi nhọn ở gốc, nhọn hay tù ở ngọn, 2 mặt nhẵn, mặt trên nhạt
màu và láng bóng, dài 12cm, rộng 5 cm; gân lá chia 8-10 cặp, mỏng, có thể
nhìn thấy ở cả 2 mặt lá; gân con tạo thành mạng lƣới; cuống lá chắc, dài
8mm. Cuống hoa có 1 hoa đơn độc, có lông tơ ở 2 mặt. Cánh hoa lớn, hình
ovan, ngắn hơn bao hoa. Lá đài hình tam giác, ngắn, dày, gần giống hình tim
ở gốc, có lông tơ ở 2 mặt. Nhiều nhị, kéo dài đến trung đới hình vuông, cụt,
có gai thịt; các ô song song, liền kề nhau; chỉ nhị dài gần bằng các ô. Lá noãn
có lông màu hung; vòi nhị dài bằng bầu, có gai thịt, hình lăng trụ, cụt. Quả
hình cầu hoặc hình tim, có rốn ở gốc, bao phủ bởi các gai hình nón từ lá noãn
hàn lại tạo thành [38].
Ở nƣớc ta cây Mãng cầu xiêm thƣờng đƣợc trồng để lấy quả. Cây có
nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, đƣợc trồng ở Miền Nam Việt Nam và
các nƣớc nhiệt đới châu Á, ở nƣớc ta thƣờng gặp ở các tỉnh Nam bộ và một
phần Tây nguyên [2],[3].

1.2. Thành phần hóa học
1.2.1. Các hợp chất acetogenin
Acetogenin là nhóm chất chỉ đƣợc tìm thấy ở họ Annonaceae, do vậy
đây là nhóm chất đặc trƣng của họ thực vật này. Cấu trúc thƣờng gặp của
4


acetogenin là acid béo có chứa 32 đến 34 cacbon, mạch thẳng không phân
nhánh, kết thúc bằng một -lactone, có thể chứa một số nhóm thế có tính oxy
hóa nhƣ hydroxyl, ketone, epoxide, tetrahydrofuran (THF), tetrahydropyran
(THP) cùng các liên kết đôi, liên kết ba [7],[12]. Hình 1.1 trình bày khung cấu
trúc chung của acetogenin.

Hình 1.1: Khung cấu trúc chung của acetogenin
Theo tổng kết về acetogenin của họ Na (2005) [7], tới nay đã có 70
acetogenin đƣợc phân lập từ cây Mãng cầu xiêm. Dựa trên cấu trúc hoá học
có thể phân loại acetogenin có mặt trong cây Mãng cầu xiêm làm 4 nhóm:
acetogenin mạch thẳng, acetogenin có nhóm epoxy, acetogenin có 1 nhóm
tetrahydrofuran, acetogenin có 2 nhóm tetrahydrofuran.
- Acetogenin mạch thẳng (đã phân lập đƣợc 12 chất) bao gồm các loại:
giganin; muridienin-1 (hình 1.2).

Acetogenin loại giganin

Acetogenin loại muridienin-1
Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của acetogenin mạch thẳng


O O
OH

OH
O O
OH
n m
O O
RR OH
OH
O O
L A
2
/
4
32
/
34
35
/
37
5


- Acetogenin có nhóm epoxy (đã phân lập đƣợc 8 chất) bao gồm các
loại: epoxymurin-A; diepomuricanin-A (hình 1.3).

Acetogenin loại epoxymurin-A

Acetogenin loại diepomuricanin-A
Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy
- Acetogenin có 1 nhóm tetrahydrofuran (đã phân lập đƣợc 47 chất) bao
gồm: mono-tetrahydrofuran ,  ’- dihydroxy acetogenin (gồm các loại:

uvariamicin-I, murisolin, annonacin, annomonicin); mono-tetrahydrofuran
/ monohydroxy acetogenin (gồm các loại: gigantetrocin-A, gigantriocin);
isoannonacin. (hình 1.4)
- Acetogenin có 2 nhóm tetrahydrofuran (đã phân lập đƣợc 3 chất) bao
gồm loại: goniodenin. (hình 1.5)








O O
O
E
-
A
cis
m
32
/
84
n
L
-
A
35
/
37

O O
R
O O
n
L
-
A
35
/
37
m
E
-
B
p
R = H or = O
6




Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran , ’- dihydroxy acetogenin

Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran / monohydroxy acetogenin

Acetogenin loại isoannonacin
Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran

Acetogenin loại goniodenin
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran

1.2.2. Các hợp chất alkaloid
Đến nay đã có 14 alcaloit đƣợc phân lập từ cây Mãng cầu xiêm bao
gồm: reticuline, coclaurine, coreximine, atherosperminine, anomurine,
anomuricine, stepharine [22]; annonaine, asimilobine, atherospermine,
muricine, muricinine [33]; annonamine [23]; nornuciferine [17]. Các alcaloit
này thuộc 4 nhóm: apomorphin, aporphin, benzyltetrahydroisoquinolin và
O O
O
R
OH
33
/
35
/
37
L
-
A
R
n
T
-
B
R
m
30
/
32
/
34

R = H or OH
O
O
O
R
OH
30
/
32
/
34
33
/
35
/
37
L
-
A
R = H or OH
R
n
T
-
B
R
m
O
O
H

O
O
OH OH
35
/
37
L
-
B
1
R
n
T
-
A
m
32
/
34
O O
O O
R
OH
L
-
A
35
/
37
R

n
T
-
E
R = H or = OH
R
m
32
/
34
7


tetrahydroprotoberberin. Hình 1.6 trình bày khung cấu trúc cơ bản của 4
nhóm alcaloit.


1 2

3 4

Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit
Trong đó: 1-apomorphin, 2-aporphin, 3-benzyltetrahydroisoquinolin,
4-tetrahydroprotoberberin
1.2.3. Tinh dầu
Tinh dầu làm lá cây có mùi thơm dịu.
Trong một nghiên cứu về thành phần tinh dầu chiết từ lá cây Mãng cầu
xiêm thu hái ở Benin, 82 hợp chất đƣợc xác định bằng GC/MS, chủ yếu là các
dẫn xuất của sesquiterpenes: -elemen, isocaryophyllene, -caryophyllene,
-humulene, -muurolene, -selinene, -muurolene, germacrene-A, -

cadiene; và alcol: elemol, (E)-nerolidol, spathulenol, globulol, epi-globulol, 1-
N
H
OH
OH
N
CH
3
NH
N
8


epi-cubenol, -epi-cadinol, -epi-muurolol, -cadinol. 4 hợp chất có hàm
lƣợng cao nhất là: -caryophyllene (13,6%), -cadiene (9,1%), -epi-cadinol
(8,4%) và -cadinol (8,3%) [8].
Năm 2012, Moses S. Owolabi và cộng sự đã nghiên cứu thành phần
tinh dầu lá cây Mãng cầu xiêm trồng ở Nigeria và xác định đƣợc 18 thành
phần, các thành phần có hàm lƣợng lớn nhất là (E)-caryophyllene (38,9%),
eugenol (30,2%), δ-cadinene (6,0%), caryophyllene oxide (5,0%) và α-
humulene (4,3%) [27].
1.2.4. Sterol
Đây là nhóm chất không đƣợc nghiên cứu nhiều trong cây Mãng cầu
xiêm. Theo tài liệu tổng quan về họ Na [21], trong lá cây mãng cầu xiêm có
chứa sitosterol; trong hạt có chứa sitosterol, stigmasterol, campesterol,
cholesterol đã đƣợc xác định hàm lƣợng. Khung cấu trúc của sterol đƣợc trình
bày ở hình 1.7.


Hình 1.7: Khung cấu trúc cơ bản của sterol

1.2.5. Carotenoit
Là nhóm chất đóng vai trò nhƣ một chất dinh dƣỡng có trong quả Mãng
cầu xiêm, Berlowski A. và cộng sự đã xác định hàm lƣợng carotenoit toàn
phần trong cây mãng cầu xiêm trồng ở Peru là 0.310 μg/1 g [6]; ngoài ra đã
OH
9


xác định đƣợc retinol (tiền chất của vitamin A) có trong vỏ cũng nhƣ thịt quả
Mãng cầu xiêm thu hái ở đông nam Nigeria [26].
1.2.6. Các nhóm chất khác
Một số hợp chất thuộc các nhóm chất khác trong cây Mãng cầu xiêm là:
cacbohydrat (glucose trong lá; sucrose, glucose, fructose trong quả;
galactomannan trong hạt), lipid (dầu nửa khô với các acid béo trong hạt và
lá), acid amin (prolin, -amino-butyric acid trong quả), polyphenol (acid
caffeic, acid para-coumaric, procyanidin, tanins), vitamin (vitamin C trong
quả), glycosid cyano [21].
1.3. Tác dụng sinh học
- Tác dụng gây độc tế bào là tác dụng sinh học nổi bật của cây Mãng
cầu xiêm, hiện đang đƣợc tập trung nghiên cứu và khai thác. Các thử nghiệm
về hoạt tính của dịch chiết hay các chất phân lập đƣợc từ cây Mãng cầu xiêm
đã đƣợc tiến hành trên nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau và đều cho hiệu
quả rõ rệt.
Tác dụng này chủ yếu do acetogenin gây ra. Một số cơ chế tác dụng
[33] là:
- Ức chế phức hợp I ( NADH : ubiquinone oxidoreductase ) trong hệ
thống ti thể vận chuyển điện tử, ức chế phosphoryl hóa oxy hóa, kết quả làm
giảm lƣợng ATP, do đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ.
- Ức chế NADH oxidase trong màng plasma của tế bào ung thƣ.
Enzyme này chỉ biểu hiện rất yếu trong các tế bào bình thƣờng khỏe mạnh.

Bằng cách ức chế enzyme này, ATP của tế bào ung thƣ sẽ bị cạn kiệt.
- Ức chế tế bào ung thƣ đa kháng. Tăng hoạt động của bơm ở tế bào, P-
glycoprotein, là yếu tố đóng góp vào sự đa kháng. Bơm này loại bỏ các hợp
chất chống ung thƣ trƣớc khi nó có hiệu lực trên các tế bào ung thƣ. Hai vị trí
10


gắn ATP nội bào đƣợc tìm thấy trên P-glycoprotein , và các bơm cần ATP để
hoạt động. Acetogenin , thông qua sự suy giảm của ATP , có thể làm giảm
hoặc dừng hoạt động của các bơm này.
- Tế bào ung thƣ ở giai đoạn S của chu kỳ tế bào dễ bị tổn thƣơng bởi
annonacin acetogenin . Annonacin có thể ngăn chặn chu kỳ tế bào trong giai
đoạn G1 và ức chế sự phát triển đến pha S. Ngoài ra annonacin còn tăng
cƣờng p53 và p21, các protein kiểm soát chu kỳ tế bào.
- Các annonacin acetogenin có thể khiến tế bào chết do tự huỷ. Nó tăng
cƣờng các biểu hiện của Bax và Bad , trừ BCL- 2 hoặc Bcl- xL.
Nghiên cứu của trƣờng Đại học De Purdue đã đƣa ra kết luận về một số
acetogenin của cây Mãng cầu xiêm có khả năng tiêu diệt đƣợc những tế bào
ung thƣ, ngay cả những tế bào ung thƣ kháng thuốc điều trị ung thƣ trƣớc đó
[5]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng trong 14 hợp chất acetogenin của Mãng cầu
xiêm có 13 chất có tác dụng mạnh đối với các dòng tế bào ung thƣ kháng ba
loại thuốc chống ung thƣ là: adriamycine, vicristine và vinblastine [5],[12].
Cis-annonacin có IC
50
trên dòng tế bào HT-29 là 1,0x10
-8
μg/ml, mạnh gấp
10000 lần so với adriamycin [28]. Muricoreacin có tác dụng trên dòng tế bào
PC-3 với ED
50

= 0,025 μg/ml trong khi adriamycin cho ED
50
= 0,11 μg/ml
[18]. Dẫn xuất acetonit của annomuricin C và muricatocin C có ED
50
trên
dòng tế bào MCF7 là 4,48x10
-3
và 3,98x10
-3
μg/ml; mạnh hơn adriamycin với
ED
50
= 1,06x10
-1
μg/ml [36].
Từ quả khô, dịch chiết nƣớc : aceton (1:1) ức chế chọn lọc sự phát triển
của tế bào ung thƣ vú MDA-MB-468 với giá trị IC
50
= 4,8 μg/ml [9].
Từ lá, dịch chiết ethanol có khả năng gây độc trên dòng tế bào bạch cầu
nguyên tuỷ hồng cầu K562 với nồng độ gây độc mạnh nhất là 2,5mg/ml [11];
dịch chiết DMSO kháng tế bào ung thƣ tụy với giá trị IC
50
trên tế bào
FG/COLO357 và CD18/HPAF lần lƣợt là 200 và 73 μg/ml [34]; tinh dầu có
11


tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào MCF7 với tỷ lệ tế bào chết ở nồng

độ 100 μg/ml là 99,2±0.1% [27].
- Tác dụng chống tăng glucose huyết: Nghiên cứu của nhóm nhà khoa
học ở Nigeria đã chứng minh tác dụng hạ đƣờng huyết của chiết xuất
methanol từ cây Mãng cầu xiêm trên chuột mắc tiểu đƣờng gây ra bởi
streptozotocin [4].
- Tác dụng lên tim và huyết áp: Dịch chiết nƣớc của lá tiêm tĩnh mạch
giảm huyết áp trên chuột. Dịch chiết nƣớc của vỏ cây cho tác dụng ức chế tim
trên thỏ [33].
- Tác dụng chống loét: Dịch chiết ethanol từ lá có khả năng làm giảm
viêm loét trên chuột bị gây loét dạ dày bởi 1ml ethanol 99,5% [15].
- Tác dụng chống co thắt và giãn cơ: Dịch chiết ethanol và nƣớc từ lá
và thân cây dùng đƣờng uống với nồng độ 0,033 ml/l trên lợn guinea cho tác
dụng chống co thắt. Ở thỏ dịch chiết ethanol 3,3 ml/l làm giãn cơ [33].
- Tác động thần kinh
+ Dịch chiết ethanol của cây Mãng cầu xiêm, với liều dùng 100 mg/kg
và 300 mg/kg, làm giảm cơn co giật PZT-tonic và giảm tỉ lệ chết trên chuột
đƣợc tiêm PZT (Lead zirconate titanate) [24].
+ Alcaloit từ cây Mãng cầu xiêm gồm asimilobine, nornuciferine,
annonaine ức chế sự liên kết của chất chủ vận từng phần [3H] rauwolscine với
thụ thể 5-HT1A, giá trị IC
50
( tƣơng ứng là 3, 9, 5 [17].
- Tác dụng kháng vi sinh vật và kháng loài nguyên sinh:
+ Kháng sốt rét: Cặn dịch chiết tổng ethanol và các cặn dịch phân đoạn
cloroform, methylene cloride, methanol của cây Mãng cầu xiêm, với hàm
lƣợng 10 μg/ml, cho kết quả phần trăm ức chế sự phát triển của chủng
Plasmodium falciparum FcB1 tƣơng ứng là 28%, 64%, 25%, 38 %. Cặn dịch
chiết phân đoạn cloroform cho hoạt tính chống sốt rét mạnh nhất [25].
12

+ Kháng khuẩn: Chiết xuất từ lá, thân và vỏ cây còn có tác dụng kháng
khuẩn in vitro trên các loài E. coli, P. aeruginosa, S. flexneri, S. spp, S.
marcescens, S. aureus, S. albus, S. Newport, B. Subtilis [33].
+ Kháng virus: Một phân đoạn chất tan trong nƣớc thu đƣợc từ thân cây
có tác dụng chống lại sự tăng sinh của tế bào nhiễm HIV trong ống nghiệm tại
IC
50
 2 g/ml. Chiết xuất ethanol của thân và vỏ cây ở nồng độ 1 mg/ml có
hoạt tính kháng vi rút Herpes simplex type 1 [33].
1.4. Công dụng
Từ lâu Mãng cầu xiêm đã đƣợc sử dụng trong y học truyền thống với
nhiều trƣờng hợp bệnh lý khác nhau nhƣ viêm phế quản, ho, suyễn, bệnh gan,
bệnh túi mật, khó tiêu, lỵ, co thắt, tiêu chảy, đái tháo đƣờng, cao huyết áp,
nhiễm kí sinh trùng, cúm, sốt cao, sốt rét… Mãng cầu xiêm còn đƣợc sử dụng
nhƣ thuốc an thần, giảm đau. Lá còn đƣợc sử dụng với một số công dụng nhƣ
làm thuốc lợi tiểu mạnh khi bị phù chân (Amazonia), trị bệnh khớp (thấp
khớp, viêm khớp), đau dây thần kinh (Brazil), bệnh da liễu (ban da, nhiễm
trùng da) (Đảo Cook), nhịp tim nhanh (Madagascar), làm thuốc trợ tim
(Guyana), giúp se da và cầm máu (Malaysia) [33].
Ở Việt Nam, lá cây Mãng cầu xiêm đã đƣợc dùng để chữa bệnh ngoài
da, giun, thấp khớp [1], sốt rét [2]. Tuy nhiên chƣa có công trình nào trong
nƣớc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Mãng
cầu xiêm. Vì thế cần thiết nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của Mãng cầu xiêm để phục vụ việc khai thác, sử dụng hiệu
quả loài cây này ở Việt Nam.
Từ tổng quan đã trình bày, định hƣớng nghiên cứu đƣợc đƣa ra:
- Về nghiên cứu hoá học, các nhóm chất có mặt trong Mãng cầu xiêm
rất đa dạng, có các lớp chất từ kém phân cực đến phân cực. Vì vậy, lựa chọn
13

dãy dung môi có độ phân cực tăng dần để chiết xuất mẫu lá, tạo thuận lợi cho
việc phân lập và tinh chế sau này.
- Về nghiên cứu tác dụng sinh học, tác dụng gây độc tế bào là tác dụng
sinh học đƣợc quan tâm nhiều nhất. Vì vậy, lựa chọn khảo sát tác dụng ức chế
tế bào ung thƣ của dịch chiết lá cây Mãng cầu xiêm sẽ làm tăng ý nghĩa của
nghiên cứu.


















14


CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Lá cây Mãng cầu xiêm đƣợc chúng tôi thu hái vào tháng 5/2013 tại xã
Hoà Mỹ, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang, Việt nam. Tên cây đƣợc nhà
thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật) thẩm
định có tên khoa học là Annona muricata L., họ Annonaceae. Tiêu bản đƣợc
lƣu giữ tại phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu lá cây Mãng cầu xiêm sau khi thu hái về đƣợc rửa sạch hong khô
ở nơi thoáng mát, rồi sấy ở 45
ο
C đến khi đạt hàm ẩm 10%, tiếp đó mẫu đƣợc
xay thành bột mịn rồi chiết xuất ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Dung môi, hóa chất:
- Dùng cho chiết xuất và phân lập: n-hexan, diclometan, etylaxetat,
methanol, toluen, acid acetic. Thuốc hiện dùng trong sắc ký lớp mỏng là dung
dịch Ceri sulfat, dung dịch Vanillin sulfuric/H
2
SO
4
.
- Dùng cho thử độc tính tế bào ung thƣ: huyết thanh phôi bò, môi
trƣờng RPMI, môi trƣờng DMEM, MTT, DMSO.
2.1.3. Thiết bị
2.1.3.1 Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập
- Phễu chiết xuất mẫu thực vật
- Phễu chiết phân lớp dung tích 1 lít
- Bộ máy quay cất cô chân không thu hồi dung môi (BUCHI waterbath
B480-Đức)

15


- Bộ khảo sát sắc ký lớp mỏng
- Máy sấy
- Cân phân tích
- Đèn tử ngoại bƣớc sóng 254 và 360 nm
- Phễu lọc và các bình chứa dung môi
- Cột sắc ký cao 80 cm đƣờng kính 2,5 cm (Chạy phân đoạn)
- Cột sắc ký cao 50 cm đƣờng kính 2,0 cm (Chạy phân đoạn)
- Cột sắc ký cao 30 cm đƣờng kính 1cm (Tinh chế)
- Phễu chứa dung môi chạy sắc ký cột
2.1.3.2. Dùng cho xác định thông số vật lý và hóa học của các chất
- Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Buchi melting poit B-545
- Phổ FT-IR đƣợc ghi trên máy FT-IR Impact-410 của hãng Carl Zeiss
Jena tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam
- Phổ EI-MS đƣợc đo trên máy HP 5989BMS
- Phổ NMR đƣợc ghi trên máy Bruker Avance 500MHz với TMS là
chất nội chuẩn
2.1.3.3. Dùng cho thử hoạt tính gây độc tế bào
- Thiết bị nghiên cứu: tủ ấm CO
2
(INNOVA CO-170)
- Tủ cấy sinh học an toàn cấp II
- Máy ly tâm (Universal 320R)
- Kính hiển vi ngƣợc (Zeizz)
- Tủ lạnh sâu -25
0
C, -80
o

C
- Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ)
- Máy quang phổ (Genios Tecan)
- Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thƣờng khác