Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI










TRỊNH VĂN LƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG PROMETHAZIN
BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




TRỊNH VĂN LƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG PROMETHAZIN
BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS: Lê Đình Chi
2. ThS: Nguyễn Thị Thùy Linh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất.


HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích – Độc
chất, Trường Đại Học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tâm của thầy
TS. Lê Đình Chi và cô ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh, cùng với sự giúp đỡ của
các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích – Độ chất.
Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cùng toàn thể cán bộ nhân viên
trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá
trình hoàn thành nghiên cứu.
Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên
tôi, động viên và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa luận này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên
Trịnh Văn Lương

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………….… 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu…………………………………………… 3
1.1.1. Tính chất………………………………………………………………………….3
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng…………………………………………………… 3
1.1.3. Chỉ định………………………………………………………………………….4
1.1.4. Một số quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin………………….5
1.2. Tổng quan về điện di mao quản 7
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản (CE) 7
1.2.2. Phân loại các kiểu điện di mao quản………………………………………… 12
1.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản …………………………………………… 15
1.3. Tổng quan về cyclodextrin …………………………………………………….16
1.3.1. Đôi nét về cyclodextrin …………………………………………………… 16
1.3.2. Cấu trúc phân tử và phân loại CD………………………………………… …16
1.3.3. Ứng dụng……………………………………………………………………… 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………….….19
2.1. Nguyên liệu và thiết bị………………………………………………………… 19
2.1.1. Chất chuẩn làm việc…………………………………………………………….19
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………….19
2.1.3. Hóa chất…………………………………………………………………….….19
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị…………………………………………………………… 19
2.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………….…20
2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu…………………………… 20
2.2.2. Xây dựng phương pháp…………………………………………………….… 21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… ……… …23

3.1. Khảo sát các điều kiện của quá trình điện di……………………………… 23
3.1.1. Lựa chọn các điều kiện dung dịch điện di………………………………….… 23
3.1.1.1.Lựa chọn bước sóng………………… …………………………………… 23
3.1.1.2. Bản chất dung dịch điện ly nền…………………………………………… 23
3.1.1.3. Nồng độ, pH dung dịch điện ly nền…………………………………….….…24
3.1.1.4. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc đối quang β-CD……………………….… 26
3.1.1.5. Khảo sát điều kiện điện thế…………………………………………….….….28
3.1.1.6. Kết quả…………………………………………………………………… …29
3.2. Thẩm định phương pháp…………………………………….……………… 31
3.2.1.Độ đặc hiệu… …………………………………………………………… ….31
3.2.2.Độ tương thích hệ thống………………………………… ……………… ….32
3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính……………………………………………… … 33
3.2.4. Độ lặp lại – độ chính xác trung gian……………………………………….… 34
3.2.5. Độ đúng của phương pháp………………………………………………… 38
3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……………………… ….41
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………………………………….…… 43
4.1. Kết luận…………………………………….…………………………………… 43
4.2. Đềxuất………………………………………….………………………… ……43
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CD Cyclodextrin.
CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis).
CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary electrochromatography).
CGE Điện di mao quản gel (Capillary gel electrophoresis).
CZE Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis).
DAD Detector mảng Diod (Diod array detector).
EOF Dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow).
GC Sắc ký khí (Gas chromatography).
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography).

MEKC Sắc ký điện động micel (Micellar electrokinetic chromatography).
MS Khối phổ (Mass spectrometry).
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation).
SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation).
STT Số thứ tự.
TB Trung bình.
TKTƯ Thần kinh trung ương.
t
M
Thời gian lưu.
UV-VIS Bước sóng tử ngoại-khả kiến (Ultra violet-Visible).
DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên nội dung các bảng Trang

1.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến dòng điện thẩm EOF 11
3.1 Tính tương thích hệ thống của phương pháp 32
3.2
Quan hệ giữa nồng độ promethazin và diện tích pic đồng phân đối
quang 1
33
3.3
Quan hệ giữa nồng độ promethazin và diện tíchpic đồng phân đối
quang 2
34
3.4
Kết quả đánh giá độ lặp lại – độ chính xác trung gian, theo đáp ứng pic
của đồng phân đối quang 1
36
3.5

Kết quả đánh giá độ lặp lại – độ chính xác trung gian theo đápứng pic
của đồng phân đối quang 2
37
3.6
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp, tính toán theo đápứng pic
của đồng phân đối quang 1
40
3.7
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp, tính toán theo đápứng pic
của đồng phân đối quang 2
41




DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên nội dung các hình Trang

1.1 Công thức cấu tạo của promethazin 3
1.2 Sơ đồ hệ thống điện di mao quản 7
1.3 Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO-) 9
1.4 Các cationhydrat hóa tập trung gần bề mặt mao quản 9
1.5
Khối dung dịch trong mao quản di chuyển về catoddưới tác dụng
của dòng EOF
10
1.6
Hình ảnh mô tả tính chất của dòng, hình dạng pic của điện di mao
quản (a) và sắc ký lỏng (b)

11
1.7 Cơ chế tách ở CZE 12
1.8 Cơ chế tách trong MEKC 14
1.9 Cơ chế tách của CGE 14
1.10 Cơ chế tách của CEC 15
1.11 Cấu trúc hóa học của các cyclodextrin 16
1.12 Cơ chế tạo phức của cyclodextrin 17
3.1
Phổ hấp thụ UV-VIS trên chuẩn của promethazin racemic với dung
dịch điện ly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5; [-CD] = 1,0
mM
23
3.2
Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch
điện ly nền natri tetraborat 40 mM pH = 9,5
24
3.3
Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch
điệnly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5
24
3.4
Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch
điện ly nền acid phosphoric 50 ở các pH khác nhau
26
3.5
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền
acidphosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 0,5 mM
27

3.6
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid
phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 1,0 mM
28
3.7
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid
phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 2,0 mM
28
3.8
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid
phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 5,0 mM
28
3.9
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid
phosphoric 50 mM pH = 2,5, [β-CD] = 2,0 mM, điện thế 10kV
29
3.10
Kết quảphân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid
phosphoric 50 mM pH = 2,5, [β-CD] = 2,0 mM, điện thế 15kV
29
3.11
Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên khi các điều
kiện phân tích đã được khảo sát hoàn thành
30
3.12 Điện di đồ của mẫu promethazin chuẩn 31
3.13 Điện di đồ của mẫu thử chế phẩm promethazine 31
3.14 Điện di đồ của mẫu trắng 32
3.15

Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa nồng độ promethazin và
diện tích đồng phân đối quang 1
33
3.16
Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa nồng độ promethazin và
diện tích đồng phân đối quang 2
34

1




ĐẶT VẤN ĐỀ
Promethazin là dẫn xuất của phenothiazin có cấu trúc khác các phenothiazin
chống loạn thần ở mạch nhánh phụ và không có thay thế ở vòng. Là một thuốc
kháng histamin thế hệ I [2]. Do trong cấu trúc phân tử của promethazin có một
nguyên tử carbon bất đối nên hoạt chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của
hai đồng phân đối quang, dạng racemic cũng đang là dạng nguyên liệu dược dụng
được sử dụng. Hiện nay chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về sự khác biệt trong
tác dụng dược lý giữa hai đồng phân đối quang của promethazin.Tuy nhiên, với các
dược chất hoạt quang, chuyển từ dạng racemic sang một đồng phân đối quang tinh
khiết đang là một xu hướng phổ biến, như đã được chứng minh qua trường hợp của
nhiều được chất phổ biến như: từ omeprazol sang esomeprazol, hay clorpheniramin
sang dexclorpheniramin, ofloxacin sang levofloxacin… Cho dù về lâm sàng, trong
nhiều trường hợp lợi ích của việc chuyển đổi này còn đang được bàn luận, xu thế đó
đã đặt ra một bài toán thực tế với những người làm phân tích dược. Vì bất cứ nghiên
cứu nào về hai đồng phân đối quang của một dược chất dưới dạng racemic cũng sẽ
cần tới một quy trình đáng tin cậy cho phép tách riêng, phân biệt đặc hiệu hai đồng
phân đối quang, xu thế chuyển từ hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân càng nâng

cao thêm tầm quan trọng của các nghiên cứu tách các hỗn hợp đồng phân đối
quang, làm các quy trình này có ý nghĩa thực tiễn lớn hơn. Cũng chính xu thế này là
lý do chúng tôi lựa chọn hướng nghiên cứu là phân tích đồng phân đối quang của
promethazin, với kỳ vọng đưa ra sản phẩm là một quy trình phân tích đáng tin cậy,
sẵn có cho bất cứ ứng dụng nghiên cứu nào trong tương lai về hoạt chất
promethazin.
Có rất nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau dùng để phân tích các đồng phân đối
quang, trong đó hiện tại phổ biến nhất là sắc k ý lỏng hiệu năng cao (High
performance liquid chromatography – HPLC). HPLC là một kỹ thuật phân tích hiện
đại có thể phân tích các mẫu đa thành phần có nhiều ưu điểm:hiệu lực tách cao, có
nhiều loại pha tĩnh hoạt quang thương mại hóa sẵn có phù hợp cho đa số các đối
tượng cần tách, kết quả phân tích ổn định. Nhưng phương pháp HPLCcũng có
2




những hạn chế đặc thù riêng: dung môi, hóa chất cần sử dụng loại có độ tinh khiết
cao, với lượng tiêu thụ tương đối lớn, dùng nhiều dung môi hữu cơ ô nhiễm với môi
trường, giá thành cho mỗi lần phân tích cao. Bên cạnh đó khi phân tích các đồng
phân đối quang bắt buộc phải sử dụng các cột hoạt quangcó giá thành cao, hiệu lực
tách mỗi loại pha tĩnh chỉ hiệu quả cho một số đối tượng nhất định dẫn đến chi phí
toàn bộ quá trình phân tích đồng phân đối quang cao. Chính vì vậy, ngoài HPLC, để
phân tích đồng phân đối quang còn có các kỹ thuật tách khác ngày càng được áp
dụng phổ biến hơn, trong đó có điện di mao quản (Capillary electrophoresis -
CE)[4].
Điện di mao quản CE với các ưu điểm nổi trội như sau: lượng dung môi hóa chất
dùng cho mỗi lần phân tích rất nhỏ, hiệu lực tách cao, thời gian phân tích tương đối
ngắn, là một kỹ thuật thân thiện với người làm nhất trong kỹ thuật phân tích. Đặc
biệt trong phân tích các đồng phân đối quang thì chất chọn lọc đối quang được cho

vào trong dung dịch điện ly nền, nên không cần phải đầu tư cột mao quản đắt tiền,
tiết kiệm được chi phí [8].
Tại Việt Nam kỹ thuật điện di mao quản là một phương pháp đã được biết đến từ
lâu, nhưng những ứng dụng trong phân tích dược nói chung và phân tích đồng phân
đối quang của thuốc nói riêng cho đến nay vẫn chưa khai thác hết tiềm năng của kỹ
thuật này.
Từ những thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành khóa luận với đề tài “Xây dựng quy
trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản”
vớimục tiêu chính:
Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di
mao quản.
3




CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.2. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Công thức cấu tạo:[1],[6].
Công thức phân tử: C
17
H
20
N
2
S.HCl
Khối lượng phân tử: 320,9
Tên khoa học:
(2RS)-N,N-dimethyl-l-10H-phenothiazin-10-yl)propan-2-amin hydroclorid.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của promethazin

1.1.1. Tính chất [1],[3],[15],[17].
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi và vị tê lưỡi.
Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và dicloromethan, cloroform;
không tan trong ethe, aceton, ethylacetat.
Dung dịch Promethazin 10% trong nước có pH 4-5. Rất nhạy với tác dụng của ánh
sáng, bị ẩm hoặc để lâu sẽ đổi thành màu xanh lơ. Bảo quản kín và tránh ánh sáng.
Nóng chảy ở 215-225
0
C.
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng [2].
Promethazin là dẫn xuất của phenothiazin có cấu trúc khác các phenothiazin
chống loạn thần ở mạch nhánh phụ và không có thay thế ở vòng.
Promethazin có tác dụng kháng histamin và an thần mạnh. Promethazin cũng có
tác dụng chống nôn, kháng cholinergic. Ngoài ra thuốc có tác dụng chống ho nhẹ
phản ánh tiền năng ức chế hô hấp.
vàenantiomer

4




Promethazin, thuốc chẹn thụ thể H

1
do tranh chấp với histamin ở các thụ thể H
1

trên các receptor, nhưng không ngăn cản giải phóng histamin. Do đó thuốc được
dùng trong tiền mê trước các thủ thuật có thể gây giải phóng histamin. Ngoài ra tác
dụng kháng cholinergic promathezin còn gây khô mũi và niêm mạc miệng.
Promethazin có tính kháng cholinergic, ngăn chặn đáp ứng với acetylcholin
thông qua thụ thể muscarinic. Nên gây ra tác dụng chống nôn, chống say tàu xe và
chống chóng mặt. Tác dụng chống ho nhẹ có thể do tính chất kháng cholinergic và
ức chế TKTƯ của thuốc.
Dược động học[2],[15]:
Promethazin được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa và ở vị trí tiêm. Nồng độ thuốc
đạt đỉnh trong huyết tương sau từ 2-3 giờ qua đường uống. Dùng theo đường tiêm
bắp, thuốc đều bắt đầu có tác dụng kháng histamin và an thần trong vòng 20 phút,
còn theo đường tiêm tĩnh mạch chỉ trong 3 đến 5 phút.Nồng độ thuốc trong huyết
tương cần để có tác dụng kháng histamin và tác dụng an thần còn chưa được biết rõ.
Tác dụng kháng histamin có thể kéo dài tới 12 giờ hoặc lâu hơn, còn tác dụng an
thần có thể duy trì từ 2 đến 8 giờ tùy theo liều và đường dùng.
Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương từ 76 đến 93%. Thuốc được phân bố rộng
rãi tới các mô của cơ thể. Mặc dù nồng độ trong não có thấp hơn so với các bộ phận
khác, nhưng vẫn cao hơn nồng độ trong huyết tương. Thuốc dễ dàng qua nhau thai
và được phân bố vào sữa mẹ.
Promethazin chuyển hóa mạnh ở gan cho sản phẩm chủ yếu là promethazin
sulphoxid và N - demethyl promethazin. Thuốc thải trừ qua nước tiểu và phân, phần
lớn ở dạng promethazin sulphoxid và dạng glucuronid.
1.1.3. Chỉ định [2],[3].
Promethazin được dùng để chữa triệu chứng hoặc đề phòng các phản ứng quá
mẫn như: mày đay, phù mạch, viêm mũi, viêm kết mạc và ngứa.
Promethazin còn được dùng làm thuốc an thần và chống nôn trong ngoại khoa

và sản khoa.
Promethazin hydroclorid dùng như một thuốc tiền mê.
5




1.1.4. Một số quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin.
1.1.4.1 Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao-HPLC.
- Thẩm định phương pháp tách và xác định đồng phân của promethazin bằng phương
pháp HPLC trong công thức bào chế [14].
Cột dùng phân tích đồng phân đối quang: Vancomycin Chirobiotic V (cột
vancomycin được liên kết với silica gel), kích thước hạt 5µm,(250 x 4.6 mm). Hệ
dung môi pha động: methanol, acid acetic và triethylamin tỷ lệ 100:0.1:0.1%(v/v) với
tốc độ dòng 1ml/phút ở nhiệt độ 20
o
C. Bước sóng phát hiện ở 254nm. Chất chuẩn
nội:Aspirin. Thời gian lưu không quá 15 phút. Hệ số tương quan:r >0,999. Độ lệch
chuẩn tương đối RSD lần lượt 0,29 và 0,36. Giới hạn phát hiện LOD lần lượt 0,04 và
0,07 µg/ml. Hàm lượng thu hồi lần lượt đạt 100,06 và 100,08%.
- Nghiên cứu bền vững của các đồng phân đối quang promethazin bằng sắc ký lỏng
sử dụng vancomycin làm chất chọn lọc đối quang [19].
Hệ dung môi pha động: hỗn hợp 80:20 (v/v) methanol với dung dịch acid acetic
chứa 1% triethylamine ở pH= 4,1.Tốc độ dòng 0,7ml/phút. Sử dụng cột chọn lọc đối
quang có gắn (teicoplanin, vancomycin và ristocetin A). Sau khi tiến hành khảo sát
thì cột có gắn chất chọn lọc đối quang vancomycin thì cho hiệu lực tách tốt nhất.Cột
Vancomycin Chirobiotic V (cột vancomycin được liên kết với silica gel), kích thước
hạt 5µm.(250 x 4.6 mm). Bước sóng phát hiện 254nm. Hệ số tương quan lần lượt của
hai đồng phân đối quang promethazin r = 0,9996 và r = 0,9997. Thời gian lưu không
quá 15 phút. LOD lần lượt 27,5 và 31,0 ng/ml.

1.1.4.2. Bằng phương pháp điện di mao quản – CE.
- Phân tích các đồng phân đối quang của promethazin bằng phương pháp điện di
mao quản sử dụng chất chọn lọc đối quang2-O-(2-hydroxybutyl)-beta-cyclodextrin
[18].
Phương pháp phân tích: Điện di mao quản vùng CZE có bổ sung chất chọn lọc đối
quang2-O-(2-hydroxybutyl)-beta-cyclodextrin. Chiều dài cột 45 cm (chiều dài hiệu
dụng 36cm), đường kính trong 75µm. Dung dịch điện ly nền tris-phosphat 50mM ở
pH 2,5; 2-O-(2-hydroxybutyl)-beta-CD 5,00mM.Bước sóng phát hiện 214nm. Thế
6




áp vào hai đầu mao quản 15kV. Tiêm mẫu 10kV/10s. Nhiệt độ được kiểm soát ở
25
0
C. Thời gian lưu không quá 14 phút.Hệ số phân giải giữa đồng phân R và đồng
phân S của promethazin: R
s
= 3,63.
- Sử dụng chất chọn lọc đối quang sulfobutyl ether-β-cyclodextrin cho việc tách các
đồng phân đối quang promethazin bằng phương pháp điện di mao quản [7].
Dung dịch điện ly nền acid photphoric 50mM ở pH 6,0 với nồng độ sulfobutyl
ether-β-cyclodextrin 20 mg/ml.Chiều dài mao quản 50cm (chiều dài hiệu dụng
45,5cm), đường kính trong 50µm.Bước sóng phát hiện 206nm.Thế áp vào hai đầu
mao quản 15kV. Tiêm mẫu áp suất: 5 psi/s với nồng độ racemic 10
-4
M.Độ phân giải
R
s

= 2,00. Thời gian lưu không quá 11 phút.
7




1.2. TỔNG QUAN VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản (CE) [4], [8].
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách
các chất trong mao quản silica dài 25-100
cm, đường kính trong thường từ 25-
75µm có khi lên tới 100µm, đường kính
ngoài từ 300-400µm. Điện thế áp vào hai
đầu mao quản có thể lên tới 30 kV tạo ra
quá trình tách và các chất phân tích được
phát hiện khi di chuyển về một đầu mao
quản nhờ một detector thích hợp.
1.2 .1.1. Điện di[4], [8], [11].
Trong ống mao quản các ion dưới tác động của lực điện trường. Các cation sẽ
chuyển về phía catod, các anion sẽ chuyển về phía anod. Với một tốc độ xác định
bằng công thức sau:
E
ep
i
v


(1)
Trong đó:


ep
: Linh độ điện di của ion chất tan (cm
2
/V.s).
E: Cường độ điện trường (V/cm).
Linh độ

ep
là cơ sở để tách điện di, phụ thuộc và nhiều yếu tố của môi trường
điện di, thể hiện ở:
Lực điện
F
e
(C.V/cm) gây ra sự chuyển động của các ion:
F
e
= q.E (2)
Trong đó:
q: Điện tích của ion (C).
Lực ma sát của môi trường điện di coi như ion là hình cầu thì:
vrF
iif


6

(3)
Hình 1.2. Sơ đồ hệ thống điện di
mao quản.

8




Trong đó:

: Độ nhớt của dung dịch trong mao quản
r
i
: Bán kính ion (cm)
v
i
: Tốc độ di chuyển của ion (cm/s)
Quá trình điện di đạt tới trạng thái ổn định khi hai lực
F
e
và
F
f
bằng nhau:
q.E
vr
ii


6
 (4)
Thay hệ số
v

i
ở phương trình (1) vào phương trình (4) ta có:
r
q
ep


6

(5)
Từ phương trình (1) đến phương trình (5) nếu: Tỷ số điện tích trên bán kính càng
cao (q/r) thì linh độ

ep
càng lớn và tốc độ di chuyển của
v
i
càng lớn nên ion có
kích thước nhỏ nhất và điện tích lớn nhất sẽ qua detector nhanh nhất. Phân tử trung
hòa điện (q = 0) sẽ không di chuyển. Độ nhớt của dung dịch tăng sẽ làm giảm linh
độ của tất cả các ion.
Linh độ điện di phụ thuộc vào bản chất của các ion và được ghi trong sổ tay như
một hằng số vật lý. Hằng số được xác định bằng cách ngoại suy đến độ pha loãng
vô tận.
1.2.1.2.Dòng điện thẩm.
1.2.1.2.1. Nguồn gốc của dòng điện thẩm (EOF) [4], 8], [9].
Trong kỹ thuật điện di mao quản dùng các mao quản có bản chất silica, các
nhóm silanol (SiOH) trên thành mao quản sẽ giải phóng ra ion H
+
vào dung dịch và

bề mặt mao quản tích điện âm.
9





Hình 1.3. Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO
-
).
Quá trình giải phóng H
+
phụ thuộc vào hằng số cân bằng pK. Dòng điện
thẩm EOF thực sự có ý nghĩa khi pH dung dịch trên 4. Các vật liệu không ion hóa
như Teflon cũng xuất hiện dòng điện thẩm do bề mặt thành mao quản hấp phụ các
anion.
Do bề mặt thành trong mao quản bị ion hóa nên tích điện âm, nên đối ion do
lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng điện tích, tạo ra một
hiệu điện thế sát thành mao quản gọi là thế Zeta.

Hình 1.4. Các cationhydrat hóa tập trung gần bề mặt mao quản.
Khi áp một hiệu điện thế vào hai đầu mao quản. Các cation trong lớp điện
kép khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod. Những cation này sẽ bị solvat hóa nên
kéo cả khối dung dịch sẽ di chuyển về phía catod. Sự di chuyển của khối dung
dịch trong mao quản dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện thẩm
EOF.
10

Hình 1.5. Khối dung dịch trong mao quản di chuyển về catod dưới tác dụng của
dòng EOF.

Tốc độ và linh độ của dòng EOF được biểu thị qua hai công thức sau:
E
v
eo
)/(

 =














L
V
x



(6)


/
eo
(7)
Trong đó:

eo
: Linh độ dòng EOF (cm
2
/Vs)

: Thế Zeta (V)

: Hằng số điện môi của dung dịch điện li.
V: Hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản (V).
L: Tổng chiều dài của mao quản(cm).
Thế Zeta được xác định chủ yếu bằng điện tích bề mặt trong của thành mao quản
. Điện tích phụ thuộc vào pH, vì vậy trị số EOF thay đổi theo sự thay đổi của pH.Ở
pH càng cao thì nhóm silanol mất càng nhiều proton H
+
càng nhiều nên trị số dòng
EOF càng lớn
1.2.1.2.2. Đặc điểm của dòng EOF [4]:
EOF tạo nên một dòng chuyển khối phẳng trong mao quản.Phân bố đồng đều
trong mao quản, cho nên không có sự tụt áp trong mao quản: dòng đồng nhất từ đầu
đến cuối. Không như sắc ký lỏng thì dòng chảy có dạng parabol.
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch chỉ xuất hiện khi

đường kính trong của mao quản d
i
≤ 200µm. Còn d
i
>200µm thì không xảy ra.
11




EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện di, bất kể là ion
hay phân tử trung hòa về điện luôn di
chuyển theo cùng một hướng. Với điều
kiện thông thường dòng này di chuyển
về phía catod. Các cation với điện tích
lớn kích thước nhỏ sẽ ra trước, tiếp theo
là các phân tử trung hòa về điện, cuối cùng là
các phân tử anion có điện tích lớn và
kích thước nhỏ sẽ ra sau cùng.
1.2.1.2.3. Kiểm soát dòng EOF [4], [8], [10].
EOF là một trong các thông số cơ bản quyết định quá trình điện di mao quản, vì
vậy cần phải được kiểm soát. Nếu ở pH cao, EOF có thể làm các ion và phân tử
trung hòa di chuyển quá nhanh làm cho các chất trong mao quản chưa kịp tách khỏi
nhau. Ngược lại ở pH thấp thành mao quản mang điện tích âm có thể hấp phụ các
cation nhờ lực hút tĩnh điện. Làm kéo dài thời gian tách hoặc khó khăn trong quá
trình tách các protein base.
Nên trong kỹ thuật điện di người ta đã tìm ra các yếu tố để kiểm soát dòng
EOF như sau:
Bảng 1.1. Những yếu tố ảnh hưởng đến dòng điện thẩm EOF.

Thông số thay đổi Kết quả
Điện trường
EOF tỷ lệ thuận với điện trường, khi điện trường
tăng thì dòng EOF tăng và ngược lại
pH đệm
EOF giảm khi pH thấp, tăng khi pH cao
Độ mạnh ion hoặc
nồng độ đệm
Sẽ làm tăng dòng EOF. Các ion có độ mạnh lớn và
nồng độ đệm cao có sinh ra cường độ dòng điện
mạnh, có thể sinh ra hiệu ứng nhiệt Joule
Các chất hữu cơ
Thay đổi thế Zeta và độ nhớt của dung
Hình 1.6. Hình ảnh mô tả tính chất
của dòng, hình dạng pic của điện di
mao quản (a) và sắc ký lỏng (b).
12




dịch,thường làm giảm EOF.
Chất hoạt động bề
mặt
Bám lên thành mao quản làm kỵ nước, có thể
tương tác với ion.Các anionic làm tăng dòng EOF
Các polymer tự nhiên
thân nước
Bám lên thành mao quản làm cho thành kỵ nước.
Làm giảm dòng EOF và làm tăng độ nhớt.

Chiều dài mao quản
Làm giảm dòng EOF khi tăng chiều dài mao quản
do làm giảm cường độ điện trường.

1.2.4. Phân loại các kiểu điện di mao quản.
Điện di mao quản khá đa dạng, có thể thực hiện theo nhiều kiểu khác nhau. Mỗi
kiểu có cơ chế tách riêng và có những ứng dụng đặc trưng.Theo cơ chế tách thì
được chia làm các kiểu điện di mao quản sau:
1.2.2.1. Điện di mao quản vùng CZE (Capillary zone electrophoresis) [4], [8].
Cơ chế tách:
CZElà kiểu điện di đơn giản nhất, với cơ sở chia táchdựa vào linh độ khác nhau
của các ion trong dung dịch tự do.

Hình 1.7. Cơ chế tách ở CZE.
Lựa chọn dung dịch điện ly:
Việc lựa chọn dung dịch điện ly vô cùng quan trọng quyết định sự thành
công của kỹ thuật CZE. Để ổn định dòng EOF cần sử dụng hệ đệm có thể duy trì
pH ổn định. Nên lựa chọn đệm của kỹ thuật CZE cần đáp ứng các yêu cầu sau:
+ Đệm tốt trong khoảng pH đã lựa chọn.
+ Hấp thụ ở bước sóng phát hiện thấp, để giảm thiểu đường nền nhiễu.
+ Di động thấp để giảm thiểu dòng sinh ra là nhỏ nhất.
pH của dung dịch điện ly:
13




Sự thay đổi pH đặc biệt hữu ích khi các chất hòa tan có thể chấp nhận giá trị
pI. pH làm việc trên hoặc dưới điểm pI sẽ làm thay đổi sự hòa tan và thay đổi thời
gian lưu của chất phân tích. Do sự bền vững của lớp silica làm mao quản, nên mao

quản có thể chấp nhận được pH làm việc từ 2-12, nhưng ta thường lựa chọn ở điểm
pH ổn định và có thể tách được chất phân tích.
Ngoài ảnh hưởng để sự hòa tan của các chất tan, cũng có thể làm thay đổi
dòng EOF, thay đổi sự phân giải giữa các pic, nếu pH quá cao có thể làm tăng dòng
EOF khi đó các chất phân tích chưa tách ra khỏi nhau nên sẽ sảy ra hiện tượng dính
pic.
Chọn chiral:
Chiral được sử dụng trong phân tích ngày càng trở nên quan trọng trong phân
tích thuốc và công nghiệp thực phẩm. Hiện nay chiral được chủ yếu thực hiện cho
các kỹ thuật HPLC và GC. Các phân tích có thể là phức tạp hoặc khó khăn trong
công việc tối ưu hóa. Ngoài ra chiral thường là các chất đắt tiền. Chiral thường
được sử dụng như: cyclodextrins, crown ethers, muối mật, copper (II)-aspartate.
Cyclodextrin là một chiral được sử dụng rộng rãi nhất. Thường được sử dụng
để tách các hỗn hợp racemic.
Ứng dụng:
CZE là kỹ tách được dùng để phân tích hỗn hợp các chất thuộc nhiều lĩnh vực:
- Sinh học: như các peptid, protein, đặc biệt glucoprotein.
- Dược phẩm: định lượng thuốc ở dạng hỗn hợp đa thành phần, các chất chuyển hóa
của thuốc trong cơ thể. Đưa các chất chọn lọc chiral như cylodextrin vào dung dịch
điện li để tách và định lượng được đồng phân quang học.
- Môi trường: Dùng phân tích các chất gây ô nhiễm môi trường.
1.2.2.2. Sắc ký điện động MEKC (Micellar electrokinetic chromatography)[4],
[8].
Cơ chế tách: Tương tác sơ nước/ion với hạt micel trong dung dịch.
14

Hình 1.8. Cơ chế tách trong MEKC
Ứng dụng: Ứng dụng rất đa dạng, phong phú do có khả năng tách các hợp chất
trung hòa và mang điện tích có đặc tính sơ nước và thân nước như acid amin,
nucleotid, vitamin, hydrocarbon thơm.
1.2.2.3. Điện di mao quản gel CGE (capillary gel electrophoresis) [4], [8], [9].
Cơ chế tách:Trong mao quản điện di chứa đầy một loại gel tạo thành một
mạng lưới có tác dụng như một rây phân tử. Do đó các chất có cấu trúc phân tử lớn
và cồng kềnh thì quá trình rửa giải càng chậm, còn các chất có cấu trúc phân tử
càng bé và ít cồng kềnh thì tiến nhanh hơn.

Hình 1.9. Cơ chế tách của CGE
Ứng dụng: Được dùng để tách các phân tử AND, tách protetin
1.2.2.4. Điện sắc ký mao quản CEC (capillary electrochromatography) [4],
[13].
Cơ chế tách:Là một kỹ thuật mới xuất hiện gần đây, lai tạo của CE và HPLC.
Trong CEC mao quản được nhồi một pha tĩnh thật thường dùng silica C18 như
trong sắc ký lỏng.Nhưng được áp thế vào hai đầu mao quản nên pha động di chuyển
trong mao quản nhờ EOF. Với kiểu điện di mao quản CEC là một ưu thế trong phân
tích các đồng phân quang học mang lại hiệu quả cao. Do các chiral được gắn vào
pha tĩnh.

15






Hình 1.10. Cơ chế tách của CEC
Ứng dụng: Tuy đang trên đường nghiên cứu phát triển nhưng CEC đã được ứng

dụng trong một số lĩnh vực sau.
+ Dược phẩm: Được dùng phân tích dược chất có nhiều nhóm khác nhau.
+ Sinh học: Các phân tử sinh học, các đồng phân quang học.
Thường được kết nối với MS và quang phổ.
1.2.5. Đặc điểm của điện di mao quản [4], [8], [10].
Điện di thực hiện trong một mao quản rất hẹp có đường kính trong từ 25-75µm,
mao quản làm bằng silica nung chảy.
Điện thế áp vào hai đầu mao quản thường rất cao từ 10 đến 30kV.
Điện trở của mao quản giới hạn dòng sinh ra và nhiệt độ bên trong mao quản.
Số đĩa lý thuyết trong cột mao quản rất lớn từ 10
5
-10
6
nên hiệu lực tách rất cao,
thời gian phân tích ngắn, khi được áp một vào hai đầu mao quản với một điện thế
cao cùng với một mao quản ngắn.
Thể tích mẫu của mỗi lần tiêm rất nhỏ (1-50nl) nên tiết kiệm mẫu tiêm.
Có nhiều kiểu điện di với độ nhạy khác nhau và phạm vi ứng dụng lớn.
Sự mở rộng phương pháp đơn giản.
Trang thiết bị được tự động hóa hoàn toàn.
16




1.3. TỔNG QUAN VỀ CYCLODEXTRIN(CD)
1.3.3. Đôi nét về cyclodextrin [16].
Cyclodextrin, sản phẩm của quá trình thủy phân starch bằng enzyme.
Cyclodextrin lần đầu tiên được miêu tả bởi Villiers năm 1891. Schardinger lần đầu
tiên đã xuất bản bài báo nói về α và β-CD vào năm 1903. Trong những năm 1928-

1932 người ta đã phát hiện ra khả năng tạo phức của cyclodexrin với các hợp chất
hữu cơ. Năm 1935 Freudenberg and Jacobi đã phát hiện ra γ-CD. Từ những năm
1938-1952 cấu trúc hóa học của α-,β- và γ-CD đã được làm sáng tỏ bởi
Freudenberg, Cramer, Borchert, French and Rundle. Năm 1954, Carmer đã miêu
tả cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của α-,β- và γ-CD như: cấu trúc hóa học kích
thước lỗ trống, độ hòa tan, khả năng tạo phức, ảnh hưởng đến độ bền hóa học của
dược chất ít tan. Từ khi phát hiện tới hiện nay CD đã được nghiên cứu phát triển
tổng hợp và đã được đưa vào ứng dụng khá phổ biến trong nhiều lĩnh vực.
1.3.4. Cấu trúc phân tử và phân loại CD.
1.3.2.1. Cấu trúc phân tử [5].
CD được sản xuất từ sự thoái hóa một phần tinh bột dưới tác dụng của enzyme.
CD là các oligosaccharid bao gồm các phân tử α-D-glucopyranose liên kiết với
nhau qua liên kết α-1,4-glycosid.Được cấu tạo như một hình nón cụt với bên trong
là phần kỵ nước và bên ngoài là phần ưa nước. Phần bên trong là các phân tử
carbon của phân tử đường kỵ nước, phần bên ngoài là các nhóm hydroxyl linh động
thân nước.

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của các cyclodextrin.
1.3.2.2. Phân loại [5].