công nghệ sản xuất acid citric bằng phương pháp lên men sử dụng Aspergillus niger

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
VI SINH VẬT

Giảng viên: TS. Nguyễn Thị Bạch Huệ

Đề tài: Công nghệ sinh học của acid citric sản xuất
2015
1
Mục lục
2
I. Axit citric

1) Giới thiệu
• Axít citric là một axít hữu cơ thuộc loại yếu và nó thường được tìm thấy trong các loại
trái cây thuộc họ cam quít. Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thường được thêm
vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua. Ở lĩnh vực hóa sinh thì axít citric đóng một vai
trò trung gian vô cùng quan trọng trong quá trình trao đổi chất xảy ra trong các vật thể
sống.
• Ngoài ra axít citric còn đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi
trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa. Axít citric có mặt trong nhiều loại trái cây
và rau quả nhưng trong trái chanh thì hàm lượng của nó được tìm thấy nhiều nhất, theo
ước tính axít citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô của trái chanh.
2) Thông tin tổng quát
- Tên theo IUPAC: 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid
- Tên thông thường: axit chanh
- Công thức phân tử: C
6
H
8

O
7
- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 192.13 g/mol
- Có dạng: tinh thể màu trắng
3) Tính chất
• Tính axít của axit citric là do ảnh hưởng của nhóm carboxyl -COOH, mỗi nhóm carboxyl
có thể cho đi một proton để tạo thành ion citrat. Các muối citrat dùng làm dung dịch đệm
rất tốt để hạn chế sự thay đổi pH của các dung dịch axít.
• Các ion citrat kết hợp với các ion kim loại để tạo thành muối, phổ biến nhất là muối canxi
citrat dùng làm chất bảo quản và giữ vị cho thực phẩm. Bên cạnh đó ion citrat có thể kết
hợp với các ion kim loại tạo thành các phức dùng làm chất bảo quản và làm mềm nước.
• Ở nhiệt độ phòng thì axít citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc ở dạng
khan hay là dạng monohydrat có chứa một phân tử nước trong mỗi phân tử của axít citric.
Dạng khan thu được khi axít citric kết tinh trong nước nóng, trái lại dạng monohydrat lại
kết tinh trong nước lạnh. Ở nhiệt độ trên 74
o
C dạng monohydrat sẽ chuyển sang dạng
khan.
3
• Về mặt hóa học thì axít citric cũng có tính chất tương tự như các axít carboxylic khác.
Khi nhiệt độ trên 175
o
C thì nó phân hủy tạo thành CO
2
và nước.
4) Lịch sử tìm ra
• Vào thế kỷ thứ 8 nhà giả kim thuật Jabir Ibn Hayyan người Iran đã phát hiện ra axít citric.
Các học giả châu Âu thời trung cổ cũng đã biết về axít tự nhiên trong chanh, những kiến

thức sơ bộ về axít này cũng đã được ghi nhận vào thế kỷ XIII. Axít Citric được nhà hóa
học người Thụy Sĩ tách được vào năm 1784, ông đã kết tinh được axít citric từ nước
chanh ép. Năm 1860 ngành công nghiệp nước ép trái cây của Ý đã đưa công trình sản
xuất axít citric vào hoạt động.
• Năm 1893 C. Wehmer đã phát hiện ra rằng nấm mốc (Penicillium) cũng có thể tạo nên
axít citric từ đường. Sản xuất axít citric theo kiểu vi sinh này đã không được đưa vào sản
xuất công nghiệp cho đến thế chiến thứ I, do cục xuất khẩu nước hoa quả của Ý bác bỏ.
Vào năm 1917 nhà hóa học thực phẩm James Currie người Mỹ đã phát hiện ra rằng nấm
mốc hình sợi (Aspergillus niger) có thể dùng để sản xuất axít citric rất hiệu quả. Hai năm
sau tập đoàn dược phẩm Pfizer đã ứng dụng kỹ thuật này vào sản xuất axít citric theo qui
mô công nghiệp.
5) Sản xuất
• Kỹ thuật mà ngày nay người ta vẫn dùng trong công nghiệp sản xuất axít citric là nuôi
nấm sợi trên đường ăn, sau đó lọc nấm mốc ra khỏi dung dịch và axít citric được tách
bằng cách cho kết tủa với nước vôi tạo thành canxi citrat, sau đó kết tủa được xử lý bằng
axít sulfuric.
• Ngoài ra axít citric còn được tách từ sản phẩm lên men của nước lèo bằng cách dùng một
dung dịch hydrocacbon của một bazơ hữu cơ Trilaurylamin để chiết. Sau đó tách dung
dịch hữu cơ bằng nước.
6) Ứng dụng
• Với vai trò là một chất phụ gia thực phẩm, axít citric được dùng làm gia vị, chất bảo quản
thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước giải khát, nó mang mã số E330. Muối citrat của
nhiều kim loại được dùng để vận chuyển các khoáng chất trong các thành phần của chất
ăn kiêng vào cơ thể. Tính chất đệm của các phức citrat được dùng để hiệu chỉnh độ pH
của chất tẩy rửa và dược phẩm.
• Citric axít có khả năng tạo phức với nhiều kim loại có tác dụng tích cực trong xà phòng
và chất tẩy rửa. Bằng cách phức hóa các kim loại trong nước cứng, các phức này cho
phép các chất tẩy rửa tạo nhiều bọt hơn và tẩy sạch hơn mà không cần làm mềm nước
trước. Bên cạnh đó axít citric còn dùng để sản xuất các chất trao đổi ion dùng để làm
mềm nước bằng cách tách ion kim loại ra khỏi phức citrat.

• Axít citric được dùng trong công nghệ sinh học và công nghiệp dược phẩm để làm sạch
ống dẫn thay vì phải dùng axít nitric.
4
• Citric axít là một trong những hóa chất cần thiết cho quá trình tổng hợp Hexametylen
triperoxit diamin (HMDT) là một chất dễ phát nổ giống Axeton peroxit, nhạy với nhiệt và
ma sát. Ở một số nước nếu bạn mua một số lượng lớn axít citric bạn sẽ bị liệt kê vào sổ
đen của các âm mưu khủng bố.
• Axít citric cũng được cho vào thành phần của kem để giữ các giọt chất béo tách biệt.
Ngoài ra nó cũng được thêm vào nước ép chanh tươi.
• Citric axit được coi là an toàn sử dụng cho thực phẩm ở các quốc gia trên thế giới. Nó là
một thành phần tự nhiên có mặt ở hầu hết các vật thể sống, lượng dư axít citric sẽ bị
chuyển hóa và đào thải khỏi cơ thể.
• Điều thú vị là mặc dù axít citric có mặt khắp nơi trong cơ thể nhưng vẫn có một vài
trường hợp mẫn cảm với axít citric. Tuy nhiên những trường hợp này rất hiếm và người ta
thường gọi đó là phản ứng giả vờ của cơ thể. Axít citric khô có thể làm kích thích da và
mắt do đó nên mặc áo bảo hộ khi tiếp xúc với axít này.
II. Aspergillus niger
1) Giới thiệu A. niger
• Có nhiều loài nấm mốc có khả năng oxy hóa gluxit thành axit citric như Rhizopus,
Aspergillus, Penicillium. Trong đó quan trọng nhất là Aspergillus niger.
• Aspergillus niger là một loại nấm sợi và một trong những loài phổ biến nhất của chi
Aspergillus có nhiều công dụng trong công nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu ở 35 – 37
0
C,
pH từ 1,4 - 9. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số loại trái cây
và rau quả như nho, hành tây, đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực
phẩm. Aspergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phát triển trên các chất hữu cơ, do đó nó
có thể được tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi trong môi trường có chứa đất. Ngoài ra, nó
được tìm thấy trong chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy và phân hữu cơ trong môi
trường ngoài trời. Môi trường trong nhà tạo ra một môi trường sống tốt cho sự phát triển

của nấm mốc. Chẳng hạn như trong các lĩnh vực hộ gia đình thông thường, trên các bức
tường trong phòng tắm hoặc các khu vực khu vực khác có độ ẩm cao.
A.niger được nuôi để sản xuất nhiều chất trong công nghiệp, trong đó có axit citric
2) Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid citric
• Trong quá trình này glucose được chuyển hoá thành axit pyruvic theo con đường EMP
(Embden-Mayerhof-Parnas), sau đó axit pyruvic tiếp tục chuyển hoá thành axit citric.
Phương trình tổng quát của quá trình này như sau:
2C
6
H
12
O
6
+ 3 O
2
→ 6C
6
H
8
O
7
+ 4H
2
O
Cơ chế của sự chuyển hoá này có thể được biểu diễn như sau:
Đường C
6
H
12
O

6
thuỷ phần thành acid pyruvic (CH
3
COCOOH)
CH
3
COCOOH + CO
2
→ HOOCCH
2
COCOOH
(Acid oxaloacetic)
5
HOOCCH
2
COCOOH + CH
3
COOH → CH
2
COOHCOHCOOHCH
2
COOH
(Acid citric)
3) Môi trường
Đa số các quy trình công nghiệp hiên nay sử dụng nguồn cơ chất là rỉ đường. Nhưng dù có sử
dụng nguồn cơ chất như thế nào thì người ta vẫn cần phải chú y đến hai yếu tố quan trọng là giá
thành và các yếu tố cần chuẩn bị để cung cấp điều kiện thuận lợi nhất cho vi sinh vật lên men.
Nguồn cơ chất cơ bản được dùng trong các quy trình lên men nổi là mật rỉ đường mía hoặc mật rỉ
củ cải đường. Còn đối với các quy trình lên men nổi thì nguồn cơ chất có thể được sử dụng
không chỉ là mật rỉ đường mà còn là những cơ chất có độ tinh khiết cao hơn như glucose tinh

khiết, đường thô hoặc đường tinh, nước ép mía và củ cải đường cô đặc. Sử dụng các nguồn cơ
chất tinh khiết như trên có thế giúp làm năng năng suất hoặc giúp giảm thời gian nuôi cấy.
Dưới đây là bản nồng độ các chất trong nuôi cấy Aspergillus niger nhằm lên men acid citric:
Thành phần Khoảng giá trị Giá trị chung
Sucrose/Glucose 125-225 kg/m
3
180 kg/m
3
NH
4
NO
3
(hoặc muối NH
4
+
khác) 0.5-3.5 kg/m
3
1.5 kg/m
3
KH
2
PO
4
0.5-2.0 kg/m
3
0.5 kg/m
3
MgSO
4
.7H

2
O 0.1-2.0 kg/m
3
0.25 kg/m
3
Fe
++
2-1300 mg/m
3
<200 mg/m
3
Zn
++
0-2900 mg/m
3
200-1500 mg/m
3
Cu
++
1-10200 mg/m
3
200-1500 mg/m
3
Mn
++
0-46 mg/m
3
<2 mg/m
3
1. Mật rỉ

Đây là nguồn cơ chất phổ biến hiện nay, có chất lượng rất đa dạng tùy theo nguồn. Và để dùng
sản xuất acid citric thì ta cần dùng những nguồn mật rỉ có chất lượng cao. Hai loại mật rỉ này có
thành phần không giống nhau, do đó người ta sẽ chọn một trong hai cho quy trình của mình.
Cũng có những trường hợp người ta trộn cả hai loại mật rỉ với nhau, nhằm thu được những
nguồn dinh dưỡng từ cả 2 nguồn. Chất lượng lượng của mía hoặc củ cải phụ thuộc vào các yếu tố
canh tác như: điều kiện đất trồng và khí hậu, hình thức bón phân, phương pháp gieo trồng, thời
gian và điều kiện bảo quản, kỹ thuật sản xuất, dụng cụ kỹ thuật, quy trình kỹ thuật,…
• Rỉ đường mía
Rỉ mía có khoảng 65-80% lượng chất kho và 20-25% là nước. Thành phần các chất dinh dưỡng
của nó được liệt kê trong bảng sau:
6
Đường tổng số (%) 48 – 56
Chất hữu cơ khác(%) 9 – 12
Protein(%) 2 – 4
K(%) 1.5 – 5
Ca(%) 0.4 – 0.8
Mg(%) 0.06
P(%) 0.6 – 2
Biotin (vitamin H) mg/kg 1 – 3
Axit pantothenic mg/kg 15 – 55
Inositol mg/kg 2500 – 6000
Thiamin mg/kg 1.8
Trong đường tổng số bao gồm sucrose (44-54%), đường chuyển hóa (0.4-1.5%), raffinose (0.5-
2%), kestose và neokestose (0.6-1.6%), arabinose, xylose và mannose (0.5-1.5%). Trong đó,
raffinose là một thành phần tự nhiên của đường mía, trong khi kestose là sản phẩn của các chủng
vi sinh trong quá trình xử lý. Tất cả các đường trên (trừ sucrose) đều được xem là cơ chất hữu cơ
không nito trong rỉ đường.Các sản phẩm hóa và nhiệt phân hủy của đường (melanoidine và
caramel) và các acid hữu cơ cũng thuộc nhóm này.Caramel chứa đường anhydride và các chất có
màu, còn melanoidine là sản phẩm của một phản ứng giữa đường giảm và acid amin.
Ngoài ra, trong rỉ đường còn chứa các acid hữu cơ không bay hơi và bay hơi, và nếu lượng acid

không bay hơi cao hơn 1% thì thường sẽ có màu rất đậm và không được dùng cho quy trình lên
men acid citric.
Các chất chửa nito trong rỉ mía gồm chủ yếu là betaine (có trong mía nhưng không được vi sinh
vật sử dụng làm nguồn N), sau đó là acid amin, protein và các chất vi lượng như ammonium
nitrate và amid.
Ngoài các yếu tố trên thì một yếu tố cũng rất quan trọng để đánh giá chất lượng rỉ mía nhằm đạt
năng suất cao trong sản xuất acid citric là lượng các nguyên tố vi lượng trong mỗi loại rỉ.
pH của mật rỉ phụ thuộc vào cộng nghệ chiết, và pH được cho là tối ưu để lên men acid citric là
trung tính hoặc kiềm nhẹ. Nhằm đạt được độ giảm pH cần thiết trong quy trình sản xuất acid
citric, ta cần mật rỉ với khả năng đệm thấp.
• Rỉ dường củ cải
Rỉ đường củ cải có thành phần khá khác biệt so với rỉ đường mía: chứa ít sucrose hơn và nhiều
đường chuyển hóa hơn, chứa ít nito và raffinose, màu sắc đậm hơn và khả năng đệm cũng thấp
hơn.
Cả hai loại rỉ ngoài những thành phần chính còn chứa các yếu tố vi lượng, dù rất ít nhưng lại là
thành phần quyết định xem rỉ có đủ điều kiện để đưa vào sử dụng sản xuất acid citric hay không.
Các chất này bao gồm thuốc trừ sâu, trừ nấm và trừ cỏ (từ quá trình canh tác) và cả các chất phá
bọt (từ quá trình sản xuất đường), là những chất có tính độc và có ảnh hưỡng tiêu cực đến chất
7
lượng mật rỉ.Thường thì mật rỉ mía được dùng phổ biến hơn trong sản xuất acid citric, đặc biệt là
trong lên men chìm, khi mà chất lượng của mật rỉ trở nên càng quan trọng hơn.
Các vi sinh vật cũng là nhân tố ảnh hưởng đến chất lượng, có khi lượng vi sinh trong mật rỉ lên
đến hơn 10,000/g mật rỉ (Bacillus, các loài thuộc Candida, Penicillium – dù rất hiếm,
Aspergillus, và các loài khác). Ngoài ra để xử lý mật rỉ ta còn phải loại một số kim loại nặng
bằng nhiều phương pháp như sử dụng kali ferrocyanide và EDTA (và một số chất khác). Tuy
nhiên cũng cần lưu ý giữa lại những chất cần thiết cho Aspergillus niger sử dụng trong quá trình
lên men.
2. Sucrose:
Đường tinh luyện được xem như là nguồn sucrose nguyên chất mà A.niger có khả năng sử dụng
rất tốt.Nồng độ tối ưu của sucrose là vào khoảng 15% - 22%, và dương nhiên ta cần thêm vào

các nguồn dinh dưỡng khác như NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
, MgSO
4
, đồng thời cần acid hóa bằng acid
sulfuric đến khi đạt pH 2.6-3.0.
3. Syrup:
Xi-rô đường cũng có thế được sử dụng làm cơ chất cho lên men acid citric chìm.Ưu điểm nổi trội
nhất của nguồn cơ chất này là độ tinh khiết của nó.Tuy nhiên syrup lại rất dễ giảm chất lượng
nhanh chóng trong quá trình vận chuyển và lưu trữ.Vì thế nguồn cơ chất này chỉ có thể sử dụng
trong những khoảng thời gian sản xuất đường đạt cao điểm, và nhà máy đường phải rất gần với
nhà máy sản xuất acid citric.
Đối với cơ chất này, ta hòa tan vào nước đến nồng độ 15-20%, thêm vào các chất dinh dưỡng cần
thiết (NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
, MgSO
4
và (NH

4
)
2
C
2
O
4
), acid hóa và sau đó tiến hành hấp khử trùng.
4. Tinh bột
Sản xuất acid citric bằng nguồn cơ chất là tinh bột ngô, lúa mì, khoai tây,… tương đối phổ biến.
Nguồn cơ chất này có độ tinh khiết và phương thức thủy giải (bằng acid hoặc bằng enzyme, hoặc
kết hợp cả hai) khá phù hợp cho việc sản xuất acid citric.
Sử dụng phương thức thủy giải của tinh bột bằng enzyme cũng có thể sử dụng cho nguồn cơ chất
là syrup dextrose.Quy trình này thậm chí đã được áp dụng vào quy mô công nghiệp. Tuy nhiên
cần phải chú ý đến lượng kim loại nặng trong dịch lên men và tiến hành loại bỏ chúng nếu chúng
vượt ngưỡng cho phép.
5. Alkan
Với giá thành rẻ và được nhiều chủng vi sinh vật sử dụng, alkan đã làm thay đổi mạnh mẽ
phương thức sản xuất acid citric trong những thập niên 1960 – 1970. Ví dụ điển hình là quy trình
8
sử dụng nấm Candida lipolytica. Hiện nay alkan không còn được sử dụng phổ biến như trước do
vấn đề thu hồi gặp khó khăn (do sự tạo thành acid isocitric).
6. Dầu & chất béo
Hiện nay dầu được sử dụng làm nguồn carbon chính để sản xuất acid citric tương tự như alkan
trước đây. Trong một ví dụ cụ thể: dầu cọ được chủng đột biến của Candida lipolytica có thể lên
men tạo acid citric với hiệu suất lên đến 145%. Ngoài ra dầu cũng được thêm vào môi trường lên
men bằng Aspergillus niger với nồng độ thấp, thậm chí có trường hợp là nguồn carbon duy nhất.
Người ta thấy rằng đây là nguồn carbon có thể cho năng suất cao trong việc tạo acid citric.Dầu
và chất béo có thể thay thế alkan trong vài quy trình, tuy nhiên giá thành thì chưa hẳn vẩn còn ở
mức thấp.

III. Sản xuất acid citric
1) Các phương pháp sản xuất acid citric:
Quá trình tổng hợp sản xuất acid citric bằng công nghệ lên men là phương pháp có giá trị
kinh tế nhất và được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Hơn 90% lượng acid citric trên thế giới
được sản xuất bằng công nghệ lên men, vì chúng có những ưu điểm sau:
(1) quy trình đơn giản và ổn định
(2) nhà máy thường ít phức tạp và cần ít hệ thống điều khiển phức tạp
(3) yêu cầu kỹ thuật cần thiết ít
(4) tiêu thụ năng lượng ít hơn và những sự cố mất điện thường xuyên không gây ảnh
hưởng nghiêm trọng đến hoạt động của nhà máy sản xuất.
Sản xuất acid citric bằng công nghệ lên men gồm 3 giai đoạn:
(1) chuẩn bị và cấy nguyên liệu thô (inoculation)
(2) lên men
(3) thu hồi sản phẩm.
Trong sản xuất acid citric theo quy mô công nghiệp, thông thường người ta sử dụng 3 phương
pháp lên men: lên men chìm, lên men bề mặt và lên men bán rắn (solid-state) hay còn gọi là quá
trình Koji.
a. Phương pháp lên men bề mặt
Phương pháp lên men bề mặt ứng dụng nhiều vào những năm đầu của thế kỷ XX, theo đó các vi
sinh vật phát triển hẳn trên bề mặt môi trường nằm giữa pha rắn và pha khí hoặc nằm giữa pha
lỏng và pha khí. Như vậy, phương pháp lên men bề mặt có thể sử dụng hai loại môi trường: môi
trường bán rắn, còn gọi là môi trường xốp và môi trường lỏng.
+ Lên men bề mặt với môi trường bán rắn
Phương pháp này ít được áp dụng vì hiệu suất thu không cao và khá phức tạp ở khâu chiết, tách
acid citric. Trước kia người ta dùng môi trường cám mì, cám gạo có trộn khoảng 15 - 25% trấu
để tăng độ xốp của môi trường. Ngoài ra, trong một số cơ sở người ta còn dùng môi trường khác
từ sắn, khoai tây, bắp… Môi trường làm nguyên liệu phải được nghiền nhỏ đến kích thước vừa
9
phải. Sau khi nghiền xong môi trường phải được làm ấm đến độ ẩm khoảng 60 - 65% và đem
hấp thanh trùng bằng hơi nóng. Môi trường làm xong phải được làm nguội và chuẩn bị cho quá

trình nuôi cấy. Trước đó ta phải chuẩn bị giống. Quá trình này còn gọi là giai đoạn thu nhận bào
tử giống.
Phương pháp thu nhận bào tử giống: Có 2 phương pháp thu nhận:
•Phương pháp thứ nhất: Chuẩn bị 3 - 4 bình tam giác dung tích 150 ml, cho vào đó khoảng 50g
cám để có độ ẩm 60%. Hấp thanh trùng và để nguội.
Từ ống giống Aspergillus niger gốc, ta chuyển toàn bộ khuẩn lạc bằng cách cho vào mỗi ống
nghiệm 10ml nước vô trùng, khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn trong nước.
Bằng phương pháp vô trùng chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị môi trường sẵn.
Lắc đều cho môi trường trộn đều bào tử. Nuôi chúng trong tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37
o
C, trong
thời gian 3 ngày. Khi thấy trong bình tam giác toàn là bào tử màu đen là kết thúc giai đoạn nuôi
cấy.
Tiếp đó, cũng môi trường như trên nhưng được chuẩn bị vào khay nhôm hoặc inox. Tải đều khi
cho 10% môi trường giống từ bình tam giác đã nuôi ở trên vào. Chiều dày khối trộn khoảng tử 3
- 5cm. Để trong phòng có nhiệt độ ổn định là 32oC. Nuôi trong khoảng 3 - 4 ngày khi bào tử
màu đen xuất hiện kín bề mặt môi trường, đem sấy ở nhiệt độ < 40oC ta thu được giống bào tử
sẵn sàng cho quá trình sản xuất đại trà.
•Phương pháp thứ 2: Người ta nuôi trong môi trường lỏng giống Aspergillus niger. Môi trường
để thu nhận bào tử có thành phần như sau:
Dung dịch nước malt có nồng độ chất khô 3 - 5%.
NH4Cl:0,25g
KH2PO4 1,25g
MgSO4 0,25g
FeSO4 0,0125g
Môi trường đã chuẩn bị xong được đưa vào bình có dung tích 2 - 3lít với chiều cao của dung
dịch trong các bình là 1cm, đem hấp thanh trùng ở 1 at trong 30phút. Sau đó chuyển giống từ
ống nghiệm giống vào. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 32oC trong thời gian 4 ngày hoặc lâu hơn cho
đến khi trên bề mặt xuất hiện váng nấm sợi, lúc đầu là màu trắng sau đó là đen chứa toàn bào tử.
Người ta thu bào tử này đem sấy ở nhiệt độ < 40

o
C và dùng nó như bào tử giống cấp 1. Để sản
xuất bào tử giống cấp 2,3, người ta thực hiện như quá trình nuôi nấm sợi trên khay đã trình bày ở
trên.
Cách thức thực hiện quá trình lên men bề mặt:
Trộn cám với nước theo tỷ lệ 1:1. Hấp thanh trùng ở 1at trong 30 phút và tãi đều ra khay, sau khi
làm nguội sẽ được trộn giống với tỷ lệ 0,3 - 0,5%. Chiều dày của khối cám + bào tử giống
khoảng 3 - 5cm. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ ổn định là 30 – 32
0
C trong 4 - 5 ngày. Thời gian lên
men kết thúc khi bào tử nấm sợi mới bắt đầu xuất hiện nhiều nhưng chưa hoàn toàn chuyển qua
màu đen. Phương pháp nuôi cấy bề mặt để thu nhận acid citric trên môi trường bán rắn hiện nay
không còn áp dụng ở các nước châu Âu nữa. Tuy nhiên, ở nhiều nước vẫn phương pháp này vẫn
10
còn được áp dụng và thay cám bằng bột khoai mì. Cứ 3 – 4kg bột khoai mì người ta thu được
1kg acid citric.
+Lên men bề mặt với môi trường lỏng
Thông thường người ta thay đường saccharose bằng mật rỉ. Mật rỉ được xử lý trước khi làm môi
trường. Xử lý mật rỉ gồm 3 vấn đề cần giải quyết: -Xử lý màu.
-Xử lý hệ keo có trong mật rỉ
-Xử lý sắt nếu mật rỉ chứa sắt
Mật rỉ đường cần phải được xử lý màu và hệ keo bằng cách cho dịch qua than họat tính để hấp
phụ và pha loãng để điều chỉnh hệ keo của dịch mật rỉ. Nếu trong mật rỉ có Fe3+ người ta cho
vào mật rỉ sau pha loãng K4{Fe(CN)6}.
Tiếp theo ta hiệu chỉnh hàm lượng đường và pH để thuận lợi cho quá trình lên men. Hàm lượng
đường được hiệu chỉnh ở hàm lượng từ 14 - 15% về khối lượng.
Ngoài ra để quá trình lên men thuận lợi cho vi sinh vật người ta bổ sung MgSO4, NH4NO3,
KH2PO4 và điều chỉnh pH từ 2,2 - 6 tùy thuộc vào thành phần các chất bổ sung mà điều chỉnh
pH cho hợp lý. Quá trình chuẩn bị giống đã được trình bày ở mục trên.
Môi trường lên men phải được lọc kỹ và thanh trùng, làm nguội, phân phối vào các khay, nuôi ở

nhiệt độ 28 – 32OC trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Quá trình lên men trên bề mặt của dịch lỏng
nhờ lớp váng dày ở trên đó là khuẩn lạc của nấm Aspergillus niger.
Acid citric sẽ được thẩm thấu qua màng tế bào vào môi trường. Kết thúc quá trình lên men,
người ta lấy phần dịch lên men đem đi lọc để thu acid citric và tiếp tục lên men mẻ mới.
b. Phương pháp lên men chìm
Trong công nghệ sản xuất acid citric theo phương pháp chìm, người ta sử dụng môi trường giống
như môi trường lỏng dùng trong phương pháp lên men bề mặt.
Quá trình được thực hiện trong các thiết bị lên men có cánh khuấy và có hệ thống thổi khí liên
tục. Người ta tiến hành lên men ở 28 – 320C trong thời gian 6 – 7 ngày.
Trong qúa trình lên men, người ta thường phải sử dụng CaCO3 để điều chỉnh pH vì acid citric
được tạo thành sẽ làm giảm pH xuống 1 – 1,5. Việc điều chỉnh này còn có ý nghĩa là người ta
chuyển acid citric thành xitrat canxi lắng xuống. Kết thúc quá trình lên men, người ta sử dụng
H2SO4 để tách acid citric ra. Tiến hành cô đặc và kết tinh acid citric.
Trong kỹ thuật sản xuất này, công nghệ sản xuất công nghiệp chính cho axít citric, các mẻ
cấy nấm Aspergillus niger được nuôi trong môi trường chứa sucroza hayglucoza để sinh ra axít
citric. Nguồn đường là nước ngâm ngô cô đặc, nước rỉ đường, tinh bột ngô thủy phân hay các
dung dịch đường rẻ tiền khác. Sau khi nấm được lọc ra khỏi dung dịch được tạo thành, axít citric
được cô lập bằng kết tủa nó với vôi tôi (hydroxit canxi) để tạo ra muối citrat canxi, từ đó axít
citric được sinh ra bằng xử lý muối này với axít sulfuric.
Ngoài ra axít citric còn được tách từ sản phẩm lên men của nước lèo bằng cách dùng một
dung dịch hydrocacbon của một bazơ hữu cơ Trilaurylamin để chiết. Sau đó tách dụng dịch hữu
cơ bằng nước.
11
• So sánh giữa lên men chìm và lên men bề mặt :
Mặc dù quá trình sản xuất bề mặt cần ít năng lượng hơn, nhưng rất nhiều nhược điểm
trong đó. Yêu cầu không gian lớn hơn cho sản xuất và cô lập, yêu cầu sự thông hơi và vô trùng
cao hơn. Một trong những vấn đề lớn nhất của quá trình sản xuất là vô trùng. Ưu điểm chính của
quá trình lên men chìm là: thời gian lên men ngắn (6-7 ngày), đảm bảo mức độ vô trùng cao hơn
và kiểm soát các thông số quá trình, quá trình hoạt động đơn giản, yêu cầu không gian nhỏ hơn,
quá trình lặp lại và năng suất cao hơn.

Schierholt so sánh lợi nhuận kinh tế của quá trình lên men bề mặt và lên men chìm trong
sản xuất axit citric. Với 300m3 và 150m3 lên men trong 9 ngày thu được năng suất 72 tấn và 12
tấn mỗi ngày. Ông kết luận chi phí đầu tư xây dựng quá trình lên men bề mặt cao hơn so với lên
men chìm 2,5 lần. Trái ngược với điều này, các chi phí về trang thiết bị là cao hơn đáng kể ở quá
trình lên men chìm, và hơn 60 phần trăm những chi phí bao gồm các thành phần phức tạp cũng
như các phản ứng sinh học và kiểm soát công cụ tinh vi hơn
Tổng chi phí đầu tư cho quá trình chìm thấp hơn khoảng 25 phần trăm cho dung lượng
cao hơn và thấp hơn 15 phần trăm đối với dung lượng nhỏ hơn so với quá trình lên men bề mặt.
Chi phí đầu tư cho quá trình chìm ngược với chi phí sản xuất cao hơn đáng kể so với các quy
trình khác. Đặc biệt rõ ràng là tiêu thụ năng lượng điện cao, cao hơn khoảng 30 phần trămso với
yêu cầu của quá trình lên men bề mặt. Chi phí lao động ở các nước phát triển cao cho nênlên
men bề mặt được sử dụng nhiều hơn. Các nước nơi nhiệt độ nước làm mát vượt quá 20⁰C, thêm
chi phí để làm mát cho các phản ứng sinh học xảy ra do đó phải cài đặt hệ thống làm mát tổng
hợp cho quá trình lên men chìm. Quá trình lên men chìm nhạy cảm nếu bị gián đoạn ngắn hoặc
sự cố trong thông khí, kết quả không chỉ ở mất năng suất, mà còn gây ra sự cố trên các lô tương
ứng. Quá trình lên men bề mặt, các dung dịch axit citric hoặc dịch lên men tập trung nhiều hơn
so với quá trình lên men chìm, bị ảnh hưởng bởi sự bay hơi cao hơn quá trình lên men chìm.
Sản xuất axit citric bởi bề mặt rắn hoặc bằng cô lập từ cam, quýt,nước trái cây chiếm tỷ lệ
không đáng kể trên quy mô thế giới. Mặc dù cả hai quá trình sản xuất với chi phí thấp, chúng
được sử dụng chủ yếu ở các nước có truyền thốnglâu đời (Ý, Hy Lạp, Châu Á).
2) Công nghệ sản xuất acid citric bằng phương pháp lên men chìm sử dụng nấm mốc
Aspergillus niger
Công nghệ sản xuất acid citric gồm 8 giai đoạn
- Nuôi cấy nấm mốc (nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và nhân giống trong sản xuất)
- Chuẩn bị dung dịch rỉ đường 3-4% trong những thùng nuôi cấy ở nhiệt độ 35-38
0
C.
Bổ sung dung dịch các chất dinh dưỡng vào thùng nuôi cấy. Chuyển men giống từ
phòng thí nghiệm vào theo tỷ lệ 3g bào tử khô/ 2-3 lit dung dịch rỉ. Sau đó mở cánh
khuấy và cung cấp không khí vô trùng (nạp không khí và đảo trộn suốt quá trình nhân

giống). Duy trì áp suất trong thùng 0.1-0.2at, nhiệt độ bằng 34-35
0
C và thời gian 28-
36h. Thời kì đầu cho oxy vào tới lượng 9-10m
3
/h, thời kỳ cuối (24-30h) là 90-
100m
3
/h.
- Chuẩn bị dịch lên men:
12
Trước hết phải dùng hơi cao áp để tiệt trùng thiết bị và đường ống. Rỉ đường được pha thành 2
loại nồng độ: nồng độ 3-4% để nuôi cấy mốc giống và lên men ban đầu. Nồng độ 25-28% để bổ
sung trong quá trình lên men, để pha chế dịch lên men, dùng nước vô trùng trộn với dung dịch
các muối dinh dưỡng và rỉ đường rồi khuấy đều. Môi trường 3-4% được pha chế trong thiết bị
lên men. Sau đó cho mốc giống từ thiết bị nuôi cấy vào và tiếp tục khuấy trộn trong 30 phút.
- Lên men:
Trong quá trình lên men lượng đường giảm nhanh, để bù lại dùng dung dịch rỉ có nồng độ 25-
28% để bổ sung gián đoạn vào dung dịch lên men. Thời kì đầu giữ ở 33-34
o
C , khi tạo acid
mạnh thì giữ ở nhiệt độ 31-32
o
C. Thời kì đầu cung cấp 100m
3
/h ( thể tích thiết bị 50m
3
). Thời kì
cuối 800-1000m
3

/h.
- Tách nấm mốc:
Kết thúc quá trình lên men bằng cách kiểm tra mẫu. Nếu hai mẫu kiểm tra cách nhau 4-6 giờ mà
có độ acid như nhau thì coi như kết thúc quá trình lên men. Thời gian lên men có thể kéo dài 5-
10 ngày, phụ thuộc vào hoạt lực của nấm mốc. Khi kết thúc quá trình lên men thì đun nóng dịch
lên men 60-65
0
C và chuyển vào thùng trung gian để tách nấm mốc. Nấm mốc được tách trên
máy lọc chân không.
- Tạo canxi citrate
Dung dịch đã lên men là hỗn hợp gồm: acid gluconic, acid oxalic, đường không lên men và các
hợp chất khoáng.
Tách acid citric bằng cách cho liên kết với cation Ca để tạo muối ít tan canxi citrate. Dung dịch
đã lên men cho vào thiết bị trung hòa và đem đun sôi. Sau đó mở cách khuấy và cho sữa vôi vào
để trung hòa. Quá trình trung hòa được kết thúc khi pH =6.8 – 7.5.
Khi trung hòa tạo thành
C
6
H
8
O
7
+ 3Ca(OH)
2
 Ca
3
(C
6
H
5

O
7
)
2
 + 6H
2
O
Acid citric canxi citrate
2C
6
H
12
O
7
+ Ca(OH)
2
 Ca(C
6
H
11
O
7
)
2
+ 2H
2
O
Acid gluconic Canxi gluconat
C
2

H
2
O
4
+ Ca(OH)
2
 CaC
2
O
4
+ 2H
2
O
Acid oxalic canxi oxalate
Dùng thiết bị lọc chân không tách các chất kết tủa canxi citrate và canxi oxalate rồi đem sấy khô.
- Tách canxi citrate: Dùng H
2
SO
4
để tách canxi citrate (trong thiết bị tách có cánh
khuấy, ống phun hơi và thoát hơi). Đầu tiên cho nước vào thiết bị 0.25-0.5m
3
/1 tấn
acid citric chứa trong citrate, mở cánh khuấy và cho chất kết tủa vào. Để làm trong
acid citric, dùng than hoạt tính với lượng 2% so với lượng acid citric trong citrate.
13
Sau đó đem đun nóng lên 60
0
C và cho H
2

SO
4
có tỷ trọng 1.8-1.84 vào (0.425l
H
2
SO
4
/1kg acid citric có trong citrate). Khuấy đều rồi đun sôi 10-15’.
Ca
3
(C
6
H
5
O
7
)
2
+ 3H
2
SO
4
2C
6
H
8
O
7
+ 3CaSO
4

Để tách canxi oxalate khi có mặt acid citric, sử dụng 1 lượng dư acid sulfuric, khi đó canxi
oxalate sẽ kết tủa với thạch cao được tạo thành và lúc đó trong dung dịch chỉ còn acid citric. Để
tách dung dịch acid citric khỏi kết tủa có chứa thạch cao, canxi oxalate, than, các hợp chất sulfur
của kim loại nặng, chuyển hóa hỗn hợp vào lọc chân không, dung dịch sau khi lọc đem sấy.
- Sấy dung dịch acid citric trong thiết bị sấy chân không:
+ Giai đoạn đầu sấy đến tỷ trọng 1.24-1.26.
+ Giai đoạn hai sấy đến tỷ trọng 1.32-1.36 tương ứng với nồng độ 80%.
- Kết tinh và sấy khô acid citric:
Khi nhiệt độ của dung dịch từ 35-37
0
C thì cho mầm kết tinh (tinh thể acid citric) vào để kết tinh,
tiếp tục làm nguội 8-10
0
C và cho khuấy liên tục trong 30’. Sau đó cho qua thiết bị ly tâm để tách
tinh thể rồi đưa đi sấy khô (dùng thiết bị sấy kiểu băng tải, tác nhân sấy là không khí với nhiệt độ
không quá 35
0
C).
3) Các yếu tố quyết định đến quá trình sản xuất acid citric:
-Môi trường dinh dưỡng bao gồm đường, các hợp chất hữu cơ, vô cơ. Để nuôi cấy Asp. niger sử
dụng môi trường có thành phần (g/l):
Saccharose 140; NH
4
N
3
-2.23; KH
2
PO
4
– 1; MgSO

4
.7H
2
O – 0.23.
-Môi trường lên men bao gồm:
Nước 1000ml + đường 150g + NH
4
Cl 1.9g và bổ sung ZnSO
4
làm tăng khả năng tích lũy acid
citric.
-pH của môi trường:
+ Để nấm mốc phát triển tốt giữ pH = 6
+ Để lên men tốt giữ pH 3.4-3.5
+ Điều chỉnh pH thường dùng một số acid như HCl.
Vì điều kiện môi trường để nấm phát triển và để thu acid citric là khác nhau nên trong sản xuất
phải chuẩn bị môi trường cho nấm phát triển đầy đủ, sau đó điều chỉnh môi trường thích hợp để
lên men citric.
-Sự thoáng khí: Tất cả hệ sợi của nấm mốc là loại hiếu khí điển hình, rất cần oxy tự do. Trong
sản xuất có thể dùng quạt gió vô trùng vào phòng lên men hoặc thổi khí vô trùng vào dịch lên
men.
14
-Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp khoảng 31-37
0
C. Sinh khối nấm mốc phát triển
mạnh ở 34-37
0
C. Để tạo ra nhiều acid, cần duy trì nhiệt độ 31-32
0
C. Để tạo ra nhiều acid, cần

duy trì nhiệt độ 31-32
0
C. Nhiệt độ thấp hơn thì tích lũy nhiều acid gluconic. Nhiệt độ cao hơn thì
việc tạo acid citric bị kìm hãm.
-Thời gian nuôi cấy 7-10 ngày.
IV. Tình hình sản xuất acid citric hiện nay
65% lượng acid citric sản xuất được sử dụng vào công nghệ thực phẩm và nước giải khát. Lượng
acid citric được sản xuất:
- Năm 2004 là 1.4 triệu tấn
- Năm 2005 là 1.6 triệu tấn
Trong đó Trung Quốc là nước có lượng sản xuất cao nhất, chiếm khoảng 50% sản lượng của
thế giới. Trong khi đó sản lượng của cả châu Âu và Mỹ chiếm khoảng 1/3 thế giới.
Về lượng sử dụng thì 3 khu vực trên cũng là 3 khu vực có mức tiêu thụ cao nhất, chiếm tổng
cộng khoảng 65%-70% của thế giới.
V. Hướng tương lai trong sản xuất acid citric
Hiện nay acid citric không còn được nhận nhiều sự quan tâm của sinh học phân tử, một phần là
do đây là một lĩnh vực tương đối hoàn thiện.
Hiện nay, với những hiểu biết tích lũy về các cơ chế điều hòa, việc cải biến quá trình chuyển hóa
có thể thực hiện được.
15
- Công nghệ lên men mẻ có thể thay thế bằng công nghệ lên men bán liên tục nhằm nâng
cao năng suất và hạ giá thành. Tuy nhiên, điều này sẽ dẫn đến sự phá hủy hệ sợi của nấm.
Nguyên nhân vẫn chưa được giải đáp.
- Khi nồng độ NH
4
+
nội bào giảm dưới mức 1mmol/g sinh khối khô, sinh tổng hợp acid
citric bị ngưng lại, nấm thay đổi hình thái theo hướng bất lợi => bổ sung ở nồng độ thấp
(30g/m
3

~ 2mmol/g sinh khối khô) trong quá trình lên men. Nếu điều này được khẳng
định, chỉ cần ở quy mô pilot trong thời gian lên men dài nó có thể dẫn đến một sự thay
đổi toàn diện trong sản xuất acid citric.
- Khả năng cố định sinh khối nấm bằng vật liệu vô cơ hoặc hữu cơ và sử dụng trong thời
gian nhiều tuần, hoặc vài tháng đang còn là một thách thức.
- Công nghệ thu hồi truyền thống làm phát sinh một số vấn đề liên quan tới việc xử lý dịch
thải (với COD khoảng 20kg/m
3
) và chất thải rắn (cụ thể là khoảng 0.15kg sinh khối khô,
2kg thạch cao cho mỗi kg acid citric khan). Một số công nghệ đã được đề xuất: thay thế
nguyên liệu rỉ đường bằng tinh bột thủy phân nhằm giảm độ phức tạp trong quá trình thu
hồi. Có thể thu hồi qua 1 bước duy nhất nếu thu hồi tricalcium citrat từ dịch lên men đã
lọc và loại màu bằng điện ly giải, và acid citric được hấp phụ lên nhựa trao đổi anion yếu
hoặc ziolit sử dụng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion pha rắn chuyển động. Sản phẩm sau đó có
thể thu hồi bằng nước, acid loãng hoặc sử dụng màng lòng => hạn chế lượng chất thải rắn
tạo ra => giảm thiểu chi phí xử lý.
Tài liệu tham khảo
/> /> />Công nghệ sinh học tập 5 – “Công nghệ vi sinh và môi trường” – GS.TS. Phạm Văn Ty – TS. Vũ
Nguyên Thành
Cơ sở công nghệ sinh học tập 4 – Công nghệ vi sinh – Lê Văn Hương, Nguyễn Văn Cách.
Citric acid production - Marin Berovic, Matic Legisa
16