BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN LISTERIOLYSIN O ĐỘT BIẾN TRONG BACILLUS SUBTILIS

LỜI MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn tồn tại phổ biến trong trong tự nhiên,
được biết tới như tác nhân gây bệnh thực phẩm, có khả năng xâm nhập, sống sót và
nhân lên trong tế bào có hay không có khả năng thực bào. L. monocytogenes gây bệnh
listeriosis trên nhiều đối tượng khác nhau gồm người già, trẻ em, phụ nữ mang thai và
người suy giảm miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng. L. monocytogenes với nhiều loại
độc tố đa dạng, có khả năng nhận biết thụ thể chuyên biệt trên màng, để tiếp cận cũng
như phá vỡ màng tế bào. Protein listeriolysin O (LLO) là loại độc tố có khả năng nhận
diện cholesterol và hình thành cấu trúc lỗ trên màng phospholipid, giúp vi khuẩn thoát
khỏi các bóng không bào vào tế bào tế chất. Nhờ đặc tính này mà LLO được nghiên
cứu ứng dụng cho việc hỗ trợ vận chuyển các tác chất (phân tử thuốc, kháng nguyên-
kháng thể, plasmid DNA, antisense oligonucleotide,…) vào bên trong tế bào mục tiêu.
Tuy nhiên, hiện nay đa phần các nghiên cứu tập trung sử dụng LLO dạng tự nhiên
của L. monocytogenes. Các phân tử dạng tự nhiên có đặc điểm nhạy cảm với pH của
môi trường. Hoạt tính của LLO giảm nhanh ở điều kiệp pH trung tính. Do đó, việc ứng
dụng LLO còn nhiều mặt hạn chế khi phải đối mặt với điều kiện pH môi trường không
đồng nhất trong invivo. Khi sử dụng dạng LLO này đòi hỏi phải có nhiều chất hỗ trợ đi
kèm để bảo vệ chúng không bị ảnh hưởng bởi pH. LLO được ứng dụng nhiều trong hỗ
trợ liposome vận chuyển tác chất. Nhưng khi liposome dung hợp với màng tế bào và bị
thực bào, các enzyme phân hủy trong không bào sẽ phân cắt tác chất trước khi LLO kịp
phá vỡ không bào. Điều này làm giảm hiệu quả tác động của tác chất, cho thấy ứng
dụng đặc điểm hoạt động ở pH acid của LLO còn nhiều hạn chế.
Để khắc phục khó khăn cũng như mở rộng hơn nữa hướng ứng dụng của LLO
trong y học, LLO dạng đột biến điểm thay thế glutamate247 thành Methionine và
Aspartate320 thành lysine (LLO
E247M/D320K
) hoạt động không phụ thuộc pH bước đầu
được nghiên cứu ứng dụng. Nhờ hoạt tính ổn định trong khoảng pH rộng, LLO đột
biến hoạt động tốt trong nhiều điều kiên pH khác nhau bên trong tế bào. Nhờ vậy, LLO
dạng đột biến có khả năng hỗ trợ tốt hơn trong việc giải phóng tác chất và làm đơn
giản hơn cho việc thiết kế cấu trúc liposome.

LLO dạng đột biến vẫn còn là hướng mới có nhiều tiềm năng ứng dụng, nhưng
đến nay các nghiên cứu vẫn còn hạn chế. Để tiến hành nghiên cứu sâu hơn về ứng
dụng của LLO, chúng tối tiến hành biểu hiện và tinh chế thu nhận để bước đầu đánh
giá đặc tính sinh hóa quan trọng của dạng đột biến này.
Chủng B. subtilis được chúng tôi chọn làm chủng biểu hiện vì có nhiều ưu điểm
nổi trội như là vi khuẩn an toàn, sinh trưởng mạnh, môi trường nuôi cấy đơn giản, có
khả năng sản xuất protein dưới dạng tiết, có hệ thống vector biểu hiện để nâng cao hiệu
suất. Nguồn protein thu nhận sẽ tiến hành thử nghiệm đặc tính sinh hóa quan trọng để
xác định hoạt tính của protein.
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học – Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh với các nội
dung sau:
- Lên men chủng B. subtilis 1012 mang vector pHT387 cho phép biểu hiện
protein dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite-LLO
E247M/D320K
trong hệ thống lên men 5 lít
- Tinh chế thu nhận protein LLO
E247M/D320K
tinh sạch.
- Tiến hành thử nghiệm hoạt tính của protein đã thu nhận trên tế bào hồng cầu.
Phần 1
TỔNG QUAN
1.1. Vi Khuẩn Listeria monocytogenes
1.1.1. Đặc điểm chung
Listeria monocytogenes được mô tả lần đầu tiên vào năm 1926 bởi Murray và
cộng sự [24]. L. monocytogenes thuộc chi Listeria, là vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy
ý, nó phân bố rộng rãi trong đất, nước bề mặt và cũng được tìm thấy trong thức ăn ủ
chua, nước thải, sữa, phân người và động vật [45], 278. Vi khuẩn có khả năng di
chuyển theo hình thức bơi đẩy nhờ vào tiêm mao, di chuyển tốt ở nhiệt độ khoảng 20-
25

0
C, nhưng giảm di động đáng kể ở 37
0
C [26].
Đầu những năm 1980, L. monocytogenes được công nhận là vi khuẩn gây bệnh
thực phẩm, đối tượng có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn này cao gồm người già, trẻ em,
người suy giảm miễn dịch và đặc biệt nguy hiểm cho phụ nữ mang thai. Ở trẻ em, L.
monocytogenes là lí do phổ biến thứ 3 gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn, đứng
sau Escherichia Coli và Streptococcus Agalactiae [35]. Ở người, tỉ lệ nhiễm L.
monocytogenes trong cộng đồng không cao (7/1000000 người), tuy nhiên tỉ lệ tử vong
rất cao (30% số ca bị nhiễm) [31]. L. monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ
-0.4
0
C - 50
0
C, có thể tiếp tục nhân chậm ở nhiệt độ thấp, trong thực phẩm bảo quản
lạnh và có khả năng tồn tại trong điều kiện có tính axid hoặc mặn [10][9]. Do vậy, L.
monocytigenes là lí do đe dọa sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế.
1.1.2. Quá trình xâm nhiễm nội bào
L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh nội bào, có khả năng phát triển và nhân
rộng trong bào tương của tế bào vật chủ. Vi khuẩn có khả năng vượt trội để qua mặt ba
rào cản của cơ thể: hàng rào biểu mô ruột, hàng rào máu não và hàng rào nhau thai. L.
monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào bằng cách phá vỡ các bóng không bào, thoát ra
tế bào chất, nhân lên và xâm nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác. (Hình 1.1)
: Quá trình lây nhiễm của Listeria monocytogenes [28].
L. monocytogenes nhận diện và bám vào tế bào chủ nhờ vào sự tương tác giữa các
protein bề mặt ( InlA và InlB) với thụ thể trên màng sinh chất của tế bào vật chủ. Thụ
thể bám dính của InlA là E-caherin, còn InlB thì liên kết với tyrosine kinase Met, cả
hai tương tác này đều thúc đẩy quá trình “ubiquitin hóa”, huy động protein clathrin tập
trung, mở kênh protiein này, thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào [28]. Với các

tế bào không có khả năng thực bào, vi khuẩn sẽ cảm ứng cơ chế “zipper” để vào bên
trong tế bào chủ.
Ngay khi tấn công tế bào chủ, L. monocytogenes bị bao lấy bởi màng tế bào, hình
thành bóng không bào. Nếu không có cơ chế thoát khỏi bóng không bào, vi khuẩn
được chuyển vào lizosome, nơi nó sẽ bị tiêu thực. Tuy nhiên, L. monocytogenes có khả
năng đặc biệt riêng của nó, các bóng không bào đang bao bọc vi khuẩn bị ly giải bởi
độc tố do vi khuẩn tiết ra, tạo điều kiện cho vi khuẩn phóng thích ra tế bào chất. Các
độc tố thiết yếu cho L. monocytogenes thực hiện tính năng này là listeiolysin O (LLO)
và hai phospholipase (PlcA and PlcB) [28]. LLO là độc tố có khả năng hình thành lỗ
trên màng tế bào ở điều kiện pH thấp và có sự hiện diện của cholesteron màng.
Bên trong tế bào chủ, vi khuẩn nhân lớn số lượng, chúng bị bao lấy bởi các sợi
actin rất ngắn. Vi khuẩn sắp xếp lại các sợi actin để hình thành dạng phân cực “comet’s
tail” kéo dài từ một đầu của vi khuẩn. Đuôi “comet’s tail” này giúp vi khuẩn di động
theo chiều ngược với đuôi, đầu không có đuôi actin sẽ lao ra ngoài màng, tạo ra những
chỗ lồi xâm lấn sang các tế bào chủ bên cạnh, cảm ứng cơ chế thực bào của tế bào lân
cận này [41]. Vận tốc nhu động trung bình từ 10-15 mm/phút.
Sau khi bị thực bào vào tế bào kế cận, vi khuẩn lúc này đang bị bao bọc bởi 2 lớp
màng (một màng của tế bào chủ cũ và một màng của tế bào chủ mới, tạo thành lớp
màng kép). Ngay sau đó, với độc tố LLO và phospholipage của mình, nó nhanh chóng
phá vỡ lớp màng kép này và thoát ra ngoài, thực hiện một chu trình xâm nhiễm mới.
1.2. Protein Listeriolysin O (LLO)
1.2.1. Nguồn gốc
LLO là thành viên trong họ Cholesterol-dependent cytolysins, một họ lớn trong
nhóm β-PFTs. Nhóm β-PFTs là nhóm nhỏ được phân ra từ nhóm pore-forming toxins
(PFTs), một nhóm độc tố phổ biến nhất ở vi khuẩn.
1.2.1.1. Pore-forming toxins (PFTs)
Pore-forming toxins (PFTs) là những protein gây độc phổ biến nhất ở vi khuẩn
(25-30% độc tố tế bào vi khuẩn). PFTs là nhóm lớn nhất của các protein độc lực, có
mặt hầu hết trong các tác nhân gây bệnh quan trọng, bao gồm Streptococcus
pneumonia, Streptococci nhóm A và B, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và

Mycobacterium tuberculosis [19]. Nhóm độc tố PFTs được vi khuẩn tiết ra dưới dạng
monomer, nhận biết các receptor chuyên biệt trên màng tế bào chủ để tiếp cận và hình
thành lỗ trên màng. Khi hình thành lỗ, tùy loại độc tố PFTs mà kích thước lỗ to nhỏ
khác nhau, lỗ nhỏ có kích thước 0,5-5 nm, lỗ lớn 20-100 nm . Dựa vào cấu trúc thứ cấp
khi xâm nhập vào màng tế bào chủ, PFTs phân thành 2 dạng chính: β-barrel (α-PFTs)
và α-helical (β-PFTs). Đa số các độc tố vi khuẩn là thuộc nhóm β-PFTs. Các α-PFTs
hình thành lỗ nhờ vào cấu trúc xoắn α. Một ví dụ cho độc tố nhóm α-PFT là Colicin A
(ClyA) (Hình 1.2A, 1.2B). ClyA thuộc nhóm colicin, một kháng sinh do Ecoli tiết ra.
Các gấp β là cấu trúc chủ yếu giúp β-PFTs hình thành lỗ trên màng. Đại diện cho nhóm
β-PFTs là α-hemilysin (Hình 1.2C, 1.2D), độc tố làm tan tế bào hồng cầu, có nguồn
gốc từ Staphylococcus aureus.
: Mô hình cấu trúc của nhóm α-PFTs và β-PFTs [8]. (A) Cấu trúc monomer của
ClyA (α-PFTs), (B) Dạng dodecamerric của ClyA. (C) Cấu trúc monomer của α-
hemolysin (β-PFTs), (D) dạng heptameric của β-PFTs.
1.2.1.2. Β-pore-forming toxins (β-PFTs)
Β-PFTs đến nay là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất của PFTs. Một số đột tố
trong nhóm này gồm có Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), perforin, α-
hemolysin, aerolysin, pseudomonas aeruginosa cytotoxin. Các β-PFTs được tiết ra ở
dạng monomer hòa tan, có cấu trúc tinh thể dạng hình nấm gồm 3 phần: nắp, vành và
domain gốc (Hình 1.2D). Các mũ có đường kính khoảng 100Å, giàu phiến β xếp thành
β-sandwich, cùng với phần vành tạo nên cốt lõi cho protein. Các gốc được xây dựng từ
14 phiến β-barrel của 7 β-hairpins, mỗi β-hairpin hình thành từ một monomer đơn, đặc
trưng bởi các phần phân cực và không phân cực xen kẽ nhau. Vùng giàu aromatic nằm
giữa domain vành và domain gốc hình thành vị trí bám cho α-hemolysin. [25]
1.2.1.3. Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs)
CDCs là một trong những độc tố phổ biến rộng rãi nhất được biết đến, trong đó có
chứa hơn 20 độc tố hình thành lỗ [7]. Các gen độc tố hoặc các sản phẩm của gen đã
được xác định có trong nhiều loài từ năm chi khác nhau của vi khuẩn gram dương. Bao
gồm: Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Listeria, và gần đây nhất là
Arcanobacterium [43]. Streptolysin O (SLO), pneumolysin (PLY) và perfringolysin O

(PLO) là 3 cấu trúc chính của CDCs, mức tương đồng về cấc trúc của 3 độc tố khoảng
40 - 70% trình tự CDCs [11][27]. Các độc tố CDCs được tiết ra ở dạng monomer tan
trong nước, kích thước từ 50 - 70 kDa [30]. Độc tố thuộc họ CDCs có 2 đặc trưng hoạt
động: phụ thuộc sự có mặt của cholesterol trên màng, nhận diện cholesterol như một
recepter và hình thành lỗ có kích thước rất lớn trên màng tế bào nhân thực. Nhận diện
và bám vào màng, độc tố tập hợp hình thành phức hợp homo-oligomeric dạng vòng
cung hoặc tròn lên đến 50 monome trên bề mặt, sau đó chèn vào màng tạo thành lỗ
chịu trách nhiệm ly giải tế bào với đường kính lên tới 300 Å [30].
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc của LLO
Năm 1987, Geoffroy và cộng sự cung cấp những bằng chứng rõ ràng đầu tiên về
một loại hemolysin tiết ra từ L. monocytogenes giống với streptolysin O (SLO-được
tiết ra bởi Streptococcus pyogenes), thuộc họ Cholesterol-dependent cytolysins
(CDCs), đặt tên là listeriolysin O (LLO) [5]. Protein LLO được mã hóa bởi gen
hemolysin, hly, dưới sự điều tiết của PrfA, nhân tố điều hòa phiên mã chính cho các
gen độc lực trong Listeria. Gen hly và PrfA cùng 4 độc tố khác (plcA, mpl, actA, và
plcB) liên kết trong một nhiễm sắc thể 9 kb, gọi là cụm gen LIPI-1, gen hly mã hóa cho
LLO nằm ở vị trí trung tâm trong locus này [14]. LLO được hình thành từ chuỗi
peptide dài 529 amino acid, với kích thước khoảng 58.6 kDa.
: Sơ đồ gene hly mã hóa cho LLO và cấu trúc monomer của LLO [7].
(a) Sơ đồ thể hiện gene hly mã hóa cho LLO của Listeria; (b) Mô hình cấu trúc một
monomer của LLO dựa trên cấu trúc tinh thể của PFO, intermedilysin, và suilysin
(tham khảo từ Protein DataBank PDB1PFO, PDB1S3R và PDB3HVN).
Cấu trúc LLO và phân tích X-ray đã được thực hiện gần đây nhưng chưa xác định
được cấu trúc chi tiết của protein này [12]. Trình tự gen mã hóa cho LLO, ivanolysin O
(ILO) và seeligerilysin O (LSO) có mức độ tương đồng cao về nucleotide (76-78%) và
protein (86 – 91%). Các protein thuộc họ CDCs tương đồng 40 – 70% trình tự amino
acid. Do đó, sự tương đồng cấu trúc của LLO với các protein cùng họ là giả thuyết ban
đầu để thiết lập mô hình cho LLO. Năm 1997, Rossjohn và cộng sự lần đầu tiên xác
định cấu trúc của PFO, một thành viên thuộc họ CDCs. Có thể dựa vào cấu trúc PFO
để xác định cấu trúc tương đối của các thành viên còn lại trong họ CDCs, trong đó có

LLO.
Phân tử LLO có cấu trúc kéo dài phân thành 4 domain chính (D1-D4) (Hình 1.3).
Các doamain D1, D2 và D3 của LLO gắn kết với nhau, còn domain D4 gần như là một
đơn vị độc lập kết nối với D2 qua một glycine (G417) [13]. Domain D4 tham gia liên
kết với lớp kép phospholipid của tế bào chủ qua 3 vòng kị nước (L1-L3), nằm ở vùng
đáy của D4. Vùng trình tự undecapeptide ở D4 kiểm soát quá trình tái sắp xếp trong D3
cho tới khi độc tố “oligomerization”. Vùng D3 có hai xoắn α chuyển đổi thành hai
phiến β chèn (TMHs) vào màng đôi lipid của tế bào chủ tạo thành oligome với 34-35
tiểu phần [3]. Vùng D1 và D2 cũng có chức năng trong việc hình thành cấu trúc
oligome và cấu trúc xuyên màng.
: Mô hình cấu trúc LLO mô phỏng theo cấu trúc tinh thể của PFO [37]. Các kí hiệu
D1-D4 tương ứng với các vùng domain từ 1 tới 4.
Trong các thành viên của họ CDCs, cặp threonine-leucine (Thr515 / Leu516) nằm
trong L1 là bảo tồn, cặp amino acid này đã được chứng minh là nhân tố bám vào
cholesterol và có vai trò trong hình thành lỗ ở LLO [37]. Leucine 461 cũng đã được
chứng minh là yếu tố điều khiển tốc độ oligomerization của LLO [36].
1.2.3. Chức năng của LLO
Protein LLO là một dạng protein tan được tiết ra bởi L. monocytogenes, giúp vi
khuẩn này trốn thoát khỏi các bóng không bào của tế bào chủ. Chèn các gen nhảy vào
gen hly hay xóa bỏ gen hly khỏi L. monocytogenes, vi khuẩn vẫn bị kẹt trong bóng
không bào, không thể thoát ra và phân chia được. L. monocytogenes không tổng hợp
được LLO là một dạng không có độc lực trong cơ thể, cho thấy sự quan trọng của
protein LLO trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn [29]. Để vi khuẩn thoát ra khỏi
bóng không bào vào tế bào chất, LLO hình thành cấu trúc lỗ trên màng. Cơ chế hình
thành cấu trúc lỗ ở LLO cũng được xác định tương tự như các thành viên khác của họ
CDCs [7]. Cơ chế cụ thể LLO tạo thành lỗ được tham khảo từ cơ chế hình thành lỗ
của PFO (Hình 1.4).
: Cơ chế hình thành lỗ của LLO [7].
Tất cả độc tố trong họ CDCs đều đặc trưng bởi khả năng bám với cholesterol trên
màng tế bào chủ, khởi xướng quá trình chuyển đổi cơ cấu cần thiết cho sự hình thành

của các lỗ phức tạp. Từ bước khởi đầu đó, LLO tái sắp xếp lại cấu trúc, hình thành
phức hợp oligome dạng vòng trên bề mặt màng, chèn vào màng tạo thành những lỗ với
đường kính lên tới 35 nm [37]. Trên màng tế bào vi khuẩn không có cholesterol như
màng tế bào nhân thực, đó là lí do vì sao nó không phá vỡ chính nó, chỉ tập trung vào
tế bào chủ, thực hiện chu trình xâm nhiễm đặc biệt.
Protein LLO có điểm riêng để phân biệt với các độc tố khác trong họ CDCs, chỉ
hoạt tính của độc tố này bị phụ thuộc vào pH. Độ nhạy pH của LLO là do bộ ba acid
nằm trong D3 (Asp208, Glu247, và Asp320), đóng vai trò như một bộ cảm biến pH
[36]. Sự hình thành lỗ của LLO là phụ thuộc vào nhiệt độ cơ thể 37
0
C và phụ thuộc vào
pH, LLO năng động hơn ở khoảng pH acid [37]. Do đó, khi bị nuốt vào không bào, pH
acid ở không bào thích hợp cho LLO hoạt động, phá vỡ bóng không bào, thoát ra tế
bào chất. Ở tế bào chất, pH môi trường trung tính (~ pH 7.4), LLO bị mất khả năng
hoạt động, vi khuẩn chỉ nhân lên trong tế bào mà không làm vỡ tế bào chủ [7].
Ngoài khả năng hình thành lỗ, phá vỡ bóng không bào. Trong vòng 10 năm gần
đây, LLO đã được xác định là có một số vai trò trong nội và ngoại bào. LLO là một
phân tử tín hiệu trước khi vi khuẩn nhập bào. Nồng độ thấp của độc tố ảnh hưởng đến
tín hiệu tế bào chủ trong nhiều con đường khác nhau như kích hoạt nuclear factor-κB
(NF-κB), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), the c-Jun N-terminal
pathways, cảm ứng NALP3 inflammasome [48][40][22]. LLO còn gây autophagy cũng
như ức chế enzyme NOX2 NADPH oxidase, một enzyme thúc đẩy phản ứng ROS
(Reactive oxygen species) – phản ứng miễn dịch của đại thực bào đáp ứng lại sự xâm
nhiễm của L. monocytogenes, nhằm ngăn chặn sự nhân lên của vi khuẩn trong tế bào
chủ [16][23]. LLO còn chính là nguyên nhân gây chết tế bào bạch cầu, qua mặt hệ
thống miễn dịch tế bào bằng cách làm mất tính năng của tế bào T giúp đỡ CD4
+
[7].
Trong những năm gần đây, LLO được cho là kích hoạt nhiều con đường tế bào bao
gồm rối loạn quá trình sửa đổi sau dịch mã thông qua SUMOlyation, gây stress mạng

lưới nội chất và đảo ngược quá trình phân mảnh của ti thể cũng như thay đổi di truyền
do sự thay đổi sau dịch mã của đuôi histone [33][39][6].
1.3. Protein LLO dạng đột biến
Với tính năng phá vỡ màng trong điều kiện pH thấp, LLO được tập trung nghiên
cứu để ứng dụng vào y học, chủ yếu theo hướng sản xuất vaccine và làm tá chất vận
chuyển thuốc tới tế bào. Xây dựng mô hình protein LLO đột biến nhằm xác định chức
năng của một amino acid, một vùng gen hoặc để tối ưu hóa hoạt tính của LLO trong tế
bào chủ.
1.3.1. Các dạng đột biến của LLO
Vùng N-terminal của LLO giống như chuỗi PEST-like, trình tự PEST do sáu
proline, chuỗi helix xoắn 4 lần, không có liên kết hidro nội phân tử. Sự sắp xếp này
cũng được biết đến như một loại polyproline II helix (PPII), tham gia vào tương tác
giữa các phân tử LLO, trình tự này bảo tồn trong các loài thuộc chi Listeria. Đột biến
trong vùng PPII, gồm mất đoạn PPII (LLO
DPPII
) hay đột biến trong vòng xoắn PPII
(LLO
A40W
, LLO
S44D
, LLO
S44E
) cho thấy hoạt động tán huyết tăng đáng kể (tế bào hồng
cầu với một một lượng lớn cholesterol trên màng, thí nghiệm khả năng phá vỡ tế bào
hồng cầu để xác định mức độ hoạt động của LLO). Ở nghiên cứu này, cũng quan sát
thấy rằng hoạt tính tán huyết tăng đáng kể ở LLO
D394W
. Ngược lại, các đột biến thay thế
K175 bởi glutamate (LLO
K175E

) hay E262 bởi lysine (LLO
E262K
) làm cho LLO hầu như
không hoạt động. Tương tự, thay thế S176 bằng tryptophan (LLO
S176W
), LLO bị mất
hoạt tính tán huyết, trong khi thay thế E262 bởi tryptophan (LLO
E262W
) không cho thấy
bất kì ảnh hưởng nào tới hoạt tính tán huyết của LLO. Những kết quả thử nghiệm này
cho thấy rõ ràng giao diện giữa phân tử LLO liền kề trong cấu trúc tinh thể có chức
năng quan trọng và các đột biến ở vùng này ảnh hưởng lớn đến sự hình thành oligome
và hoạt động tan máu. [36]
LLO còn tạo điều kiện thuận lợi cho dòng Ca
2+
từ môi trường ngoại bào vào bên
trong tế bào hoặc giúp giải phóng Ca
2+
lưu trữ nội bào. Mức Ca
2+
nội bào tăng đột ngột
gây xáo trộn sự cân bằng Ca
2+
, làm giải phóng chất trung gian gây viêm, thay đổi
chuyển hóa trong tế bào, tổ chức lại khung xương tế bào và cuối cùng gây hiện tượng
chết theo chương trình [42][32][4]. Ở giai đoạn sớm khi nhiễm Listeria, việc tăng
lượng Ca
2+
gây giảm khối lượng tế bào, thay đổi kích thước tế bào và làm lớp biểu mô
yếu hơn [34]. LLO đột biến được ủ với dòng tế bào biểu mô ruột Caco-2 để theo dõi

mức Canxi nội bào. Quan sát các đột biến trong vùng PPII (LLO
A40W
, LLO
S44D
,
LLO
S44E
) và đột biến mất đoạn PPII, dòng Ca
2+
vào tế bào tăng rõ rệt kèm theo hiện
tượng tế bào co rút, trong khi đó các thể đột biến LLO
K175E
, LLO
S176W
không gây ra hiện
tượng co rút tế bào và không làm tăng lượng Ca
2+
nội bào. Với LLO
E262W
thì không gây
tăng lượng ca
2+
nội bào nhưng làm tăng nhẹ hoạt động tán huyết. [13]
Giảm hoạt động tán huyết cũng còn do quá trình chuyển đổi oligomerization bị
kìm hãm hay các oligome ban đầu bị ức chế không thể hình thành các trúc tiền lỗ và lỗ.
Kiểm tra trên các đột biến LLO
DPPII
, LLO
A40W
, LLO

S44D
, LLO
S44E
, LLO
N230W
, LLO
E262W
,
kết quả cho thấy vòng được hình thành trên màng hồng cầu. Các dạng đột biến khác
nhau so sánh với dạng LLO hoang dại (LLO
WT
), hình dạng lỗ tạo thành là khác nhau.
Các đột biến không tán huyết LLO
K175E
, LLO
S176W
và LLO
E262K
không tìm thấy cấu trúc
dạng vòng mà chỉ có những cấu trúc dạng vòm không thành vòng hoàn chỉnh xung
quanh màng hồng cầu. Độ cong của các cấu trúc hình vòm trên màng hồng cầu tạo ra
bởi các thể đột biến khác hoàn toàn với các lỗ và vòng do thể đột biến gây ra. Khẳng
định rằng, các thể đột biến này vẫn có thể bám vào màng và bắt đầu quá trình
oligomerization nhưng không hoàn chỉnh, không tạo thành lỗ đặc trưng cho tán huyết.
[13]
Đặc trưng của LLO là hoạt động phụ thuộc vào pH, được quy định bởi bộ ba
amino acid nằm trong D3 (Asp208, Glu247, và Asp320). Cũng có giả thuyết cho rằng
aminoacid Leu461 tham gia quy định sự phụ thuộc pH và nhiệt độ của LLO. Leu461
nằm ở một trong ba loop đầu domain 4. Do đó, ban đầu người ta nghĩ rằng thể đột biến
LLO

L461T
không bị biến tính ở pH 7.4 khi không còn phụ thuộc vào pH nữa. Tuy nhiên,
ở pH 5.5 hoạt động của LLO đột biến cũng tương tự như LLO
WT
; đột biến này làm tăng
đáng kể tỉ lệ tán huyết ở 23
o
C và vẫn bị biến tính ở 37
o
C khi thí nghiệm ở điều kiện pH
7.4. [36]
Nghiên cứu tối ưu hóa hoạt tính tán huyết của LLO trong các điều kiện pH khác
nhau, đột biến vùng đầu dò pH có khả năng thành công cao nhất. Một số nghiên cứu đã
được tiến hành.
1.3.2. Dạng đột biến E247M và D320K
Hoạt động phụ thuộc pH của LLO là do sự biến tính của LLO ở điều kiện pH
không thích hợp. LLO mất hoạt tính do các TMH của domain 3 không gấp cuộn để
hình thành cấu trúc xuyên màng. Sự không gấp cuộn sớm của TMH được điều hòa bởi
bộ ba amino acid trong domain 3. Sự biến tính LLO cũng cần nhiệt độ cao, nhiệt độ
cao kết hợp với pH trung tính kích thích sự biến tính. Bộ ba amino acid Glu247, Asp-
320, và Glu208 nằm cạnh nhau trong domain 3 (Hình 1.5), sự tích điện giữa 3
carboxylate này tạo điều kiện thích hợp làm domain 3 bị mất ổn định ở pH trung tính.
Khi pH càng tăng các carboxylate càng bị khử proton hóa, do đó tăng lực đẩy tĩnh điện
giữa các gốc làm domain 3 rối loạn. Sự rối loạn làm domain 2 và 3 không hình thành
được giao diện liên kết, thêm vào đó sự không gấp cuộn của các bó α-helix trong
domain 3 khiến cho LLO không hình thành được tương tác với màng. [36]
Từ các đột biến điểm riêng lẻ, mức ảnh hưởng của từng amino acid trong vùng
đầu dò pH tới hoạt tính của LLO đã được biết rõ. Đột biến Glu247Met cải thiện đáng
kể tính ổn định của LLO ở pH 7.4, nó giữ lại 32% hoạt tính sau 16 phút, trong khi đó
LLO

WT
chỉ có 2% hoạt tính so với pH 5.5. Dựa trên cấu trúc PFO, Glu247 được xác
định là nằm trong domain 3 gần Asp208 và Asp320 trên LLO mô hình. Đột biến điểm
LLO
D208S
là độc hại với E. coli và sự kết hợp với các đột biến điểm khác không được
nghiên cứu sâu hơn. Dạng LLO
D320K
duy trì hoạt tính tương tự như LLO
WT
ở pH 5.5, và
có tác dụng rất ít trong việc ổn định hoạt tính ở pH 7.4. Tuy nhiên sự kết hợp 2 đột biến
điểm trong bộ ba acid này cho hiệu quả tăng cao. Đột biến 2 điểm LLO
E247M/D320K
cho
kết quả tốt ở pH 5.5 đồng thời không bị biến tính và hoàn toàn ổn định ở pH 7.4. [36]
: Mô hình cấu trúc của LLO với các điểm được gây đột biến [36].
1.3.3. Các ứng dụng của LLO đột biến
Protein LLO là một trong những độc lực chính của L. monocytogenes và không
được tìm thấy ở các loài listeria khác [1]. Dựa trên đặc điểm này, protein được nghiên
cứu sử dụng vào phương pháp chẩn đoán miễn dịch. LLO còn là nguồn cung cấp
epitope chính cho đáp ứng miễn dịch của tế bào TCD4 và TCD8 sau khi bị nhiễm L.
monocytogenes. LLO được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật, thu nhận
kháng thể phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán nhanh L. monocytogenes trong thực
phẩm.
LLO hoạt động như một chất cảm biến pH, thích hợp với điều kiện pH acid
nhưng lại bị biến tính ở pH trung tính. Đặc tính đó rất thích hợp với điều kiện môi
trường bên trong bóng không bào khi bước đầu xâm nhập vào tế bào. Lợi dụng tính
chất này của LLO nhiều nghiên cứu ứng dụng LLO như một trung gian vận chuyển,
giúp phân phối các sản phẩm mục tiêu vào tế bào chất của tế bào mong muốn. Hiện

nay, để vận chuyển thuốc, các tác chất vào tế bào gặp rất nhiều khó khăn khi phải đối
mặt với hàng rào thực bào của tế bào chủ. Các liposome mang tác chất, bị thực bào bởi
màng tế bào chủ, lúc này liposome bị mắc kẹt trong các bóng không bào. Tại đây,
liposome và các chất kèm theo dần bị phân cắt bởi enzyme của bóng không bào, không
thể thoát ra tế bào chất để thực hiện chức năng theo mong muốn của người dùng.
LLO được đóng gói trong liposome cùng với thuốc, đại phân tử như plamid DNA,
các antisense oligonucleotide, kháng nguyên hòa tan, toxin peptide [17][18][20][38].
Khi vào cơ thể liposome sẽ dung hợp với màng tế bào và bị mắc kẹt trong bóng không
bào, nhạy cảm với pH acid ở không bào liposome giải phóng tác chất vào bóng không
bào. LLO gặp điều kiện pH acid của bóng không bào, hoạt hóa chức năng ly giải màng,
phá vỡ bóng không bào, thuốc và tác chất được phóng thích vào tế bào chất, thực hiện
chức năng đã được quy định.
Nồng độ cao LLO có thể gây độc cho tế bào, do đó lượng LLO cần thiết để phân
phối thuốc càng ít càng tốt, nhưng vẫn đảm bảo hiệu qua phân phối [2]. Đột biến điểm
tại ví trí có nhiều cytein, LLO
C484S
đã được chứng minh là nâng cao hoạt tính, ổn định
hơn LLO
WT
khi vào trong tế bào cùng với liposome, cho phép giảm lượng LLO sử
dụng cho các ứng dụng phân phối thuốc nhờ liposome trong tương lai, giảm thiểu khả
năng gây độc cho tế bào. [44]
Ngoài cách đóng gói LLO vào liposome, LLO còn được sử dụng cho bám dính
quanh liposome, giảm hiệu quả của thuốc. Cách này ứng dụng trong một nghiên cứu
tiếp cận thuốc vào tế bào ung thư vú sử dụng liposome và LLO để hỗ trợ [15].
Các ứng dụng trên đều lợi dụng đặc tính chỉ hoạt động trong điều kiện pH acid
của LLO, để ứng dụng phá vỡ rào cản không bào ngăn cản phân phối thuốc, nhưng
không làm ảnh hưởng tới tế bào. Thể đột biến 2 điểm E247M/D320K hoạt động tốt ở
các pH khác nhau, bước đầu mở ra hướng ứng dụng LLO ở nhiều điều kiện khác nhau
trong tế bào. Do đó, so với dạng tự nhiên, LLO dạng đột biến này có khả năng hỗ trợ

tốt hơn trong việc giải phóng tác chất và đơn giản hóa quá trình thiết kế cấu trúc
liposome. Đột biến dạng này còn có tiềm năng ứng dụng để tiêu diệt tế bào ung thư, ở
pH trung tính của tế bào, LLO vẫn hoạt động tốt và ly giải tế bào mục tiêu. Đây là
hướng nghiên cứu mới và nhiều tiềm năng ứng dụng. Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng
dạng đột biến này vẫn còn rất hạn chế. Để có được những nghiên cứu sâu hơn, bước
đầu cần thu nhận và đánh giá các đặc tính sinh hóa của dạng LLO đột biến này.
1.4. Hệ thống biểu hiện Bacillus sutilis
1.4.1. Chủng biểu hiện
Bacillus subtilis là một loài vi khuẩn Gram dương có lợi, được ứng dụng rộng rãi
trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học và công nghệ thực phẩm.
Hiện nay, hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp trên B. subtilis cũng dần được hoàn
thiện, tỷ lệ protein tái tổ hợp biểu hiện cao với hình thức biểu hiện đa dạng như tiết, nội
bào hay cố định trên vách tế bào. Ngoài ra, B. subtilis còn có rất nhiều ưu điểm thích
hợp để làm tế chủ trong lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp ứng dụng cho công nghiệp
và cho nghiên cứu:
- Là sinh vật an toàn, không gây bệnh, được xếp vào nhóm sinh vật GRAS
(Generally Regarded As Safe)
- Thông tin về di truyền và lên men quy mô lớn đã được nghiên cứu rõ
- Tốc độ tăng trưởng nhanh, cho hiệu quả lên men cao
- Quy trình nuôi cấy và thu nhận sản phẩm đơn giản, chi phí thấp
Tuy nhiên việc sử dụng B. subtilis làm tế bào chủ cũng gặp phải một số khó khăn
nhất định do mang nhiều đặc điểm bất lợi về chủng và vector biểu hiện như:
- Thiếu các vector biểu hiện thích hợp
- Plasmid không ổn định
- Tạo nhiều protease, đặc biệt là protease ngoại bào làm giảm hiệu suất biểu hiện
- Thiếu hệ thống biến đổi sau dịch mã
Các nghiên cứu gần đây đã tìm cách khắc phục những hạn chế đó, mở ra hướng
ứng dụng lớn của loài vi khuẩn này trong công nghiệp cũng như nghiên cứu. Với sự ra
đời của hệ thống biểu hiện pHT mang promoter mạnh Pgrac, có khả năng sao chép
theo kiểu θ, cảm ứng bởi IPTG, cho phép biểu hiện tốt protein ngoại lai và khắc phục

sự thất thoát plasmid, đã cải thiện đáng kể khó khăn. Đồng thời, vector con thoi có thể
được tạo dòng trong E. coli và biểu hiện trong B. subtilis. Để nâng cao hiệu quả sản
xuất protein tái tổ hợp, nhiều chủng B. subtilis bị đột biến bất hoạt protease đã được
thiết kế và đưa vào sử dụng như: WB600, WB700, WB800, WB800N… [21][47][46].
Nhờ các đặc điểm sẵn có và các hạn chế đã được khắc phục nhằm tối ưu chủng, B.
subtilis dần trở thành sinh vật chủ hấp dẫn trong sản xuất protein tái tổ hợp.
1.4.2. Vector biểu hiện
Hệ thống vector pHT là một trong những hệ thống vector plasmad cho phép biểu
hiện trong B. subtilis khá hiệu quả, điển hình là pHT01 (Hình 1.7) và pHT43 (Hình
1.8). Tất cả các vector trong hệ thống pHT đều sử dụng promoter Pgrac (Hình 1.9),
được dung hợp từ promoter PgroES của B. subtilis với lac operator (lacO) của E. coli,
cho phép biểu hiện cảm ứng bằng IPTG ở cả B. subtilis và E. coli. Ngay sau promoter
Pgrac, trình tự Shine-Dalgarno (SD) của gen gsiB và vùng Multi cloning site – MCS
(BamHI, XbaI, AatII, SmaI) được chèn vào để hỗ trợ cho việc tạo dòng và biểu hiện
gen của hệ thống vector plasmid pHT. pHT43 được tạo ra từ pHT01 nhằm hỗ trợ cho
việc tiết protein bằng cách chèn thêm trình tự tín hiệu tiết ssamyQ của α-amylase ngay
sau promoter Pgrac.
: Sơ đồ plasmid pHT01
: Sơ đồ plasmid pHT43
Vector pHT01 được chèn thêm các đuôi dung hợp dùng cho tinh chế như 8xHis-
tag (pHT08), Strep-tag (pHT09) và epitope c-Myc-tag (pHT10).
Pgrac: Pgrac promoter (chứa
groES promoter, lacO operator,
chuỗi gsiB SD).
ColE1: ColE1 origin.
Amp
R
: gen kháng Ampicillin.
LacI: gen lacI (lac repressor).
Cm

R
: gen kháng Chloramphenicol
Pgrac: Pgrac promoter (chứa
groES promoter, lacO operator,
chuỗi gsiB SD).
ColE1: ColE1 origin.
Amp
R
: gen kháng Ampicillin.
LacI: gen lacI (lac repressor).
Cm
R
: gen kháng Chloramphenicol
: sơ đồ promoter Pgrac
Phần 2
VẬT LIỆU
PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm:
- Máy lắc (Pol-Eko)
- Tủ ấm (Pol-Eko)
- Autoclave (SS325 – TOMY)
- Máy vortex (Biocote)
- Máy đo pH (TRANS instruments)
- Máy ủ nhiệt khô (Benchmark)
- Máy ly tâm eppendorf (Hermle)
- Máy ly tâm fancol lạnh (Hermle)
- Máy đo quang phổ chuyên dụng Nanodrop®
- Bộ điện di protein (BioRad)

- Bộ nguồn (Cleaver)
- Màng lọc 0,2 μm
- Cột Histrap HP 5 ml (GE healthcare)
- Bơm nhu động (GE healthcare)
- Tủ mát 4
ο
C (Lucland Fukusima)
- Tủ lạnh -20°C (Lucland Fukusima)
- Tủ lạnh sâu -80
°
C (Testler)
- Máy phá mẫu (Sonicator)
- Đèn UV
- Lò viba
- Máy heat nhiệt (Benchmark)
- Dụng cụ lên men GX-Fermentor 5L (BIOTRON Inc)
- Các dụng cụ tiêu hao khác: eppendorf, tip, fancol, màng thẩm tích…
2.1.2. Vật liệu sinh học
2.1.2.1. Chủng sinh vật
- Chủng b. subtilis 1012 mang vector pHT387. pHT387 (Hình 2.1) là vector cho
phép biểu hiện protein LLO
E247M/D320K
dung hợp với đuôi LysSN-6xHis-TEVsite
trong B. subtilis. Đuôi LysSN-6xHis-TEVsite chứa 3 vùng trình tự chính gồm:
LysSN là vùng đầu N của protein LysS của B. subtilis, vùng này có tác dụng
tăng cường biểu hiện và ổn định của protein mục tiêu. Đuôi 6xHis giúp tinh chế
và thu nhận protein được thuận lợi. TEVsite là vị trí cắt của TEV protease giúp
loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu. Chủng vi sinh và plasmid được
cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Hình 2.1: sơ đồ plasmid pHT387
- Tế bào máu cừu (RSBC) cung cấp bởi công ty Nam Khoa biotec.
2.1.2.2. Thang chuẩn
Thang protein chuẩn (Hình 2.2)
Hình 2.2: thang protein chuẩn
2.1.3. Hóa chất, môi trường
2.1.3.1. Hóa chất
a. Hóa chất dùng trong điện di protein SDS-PAGE
- Tris – HCl 1.5 M (pH 8,8 và 6,8), 40% acrylamide – 2.5% bis-acrylamide (giữ ở
4°C), SDS 10%, APS 10% TEMED (N, N, N’, N’ tetramethylethylene diamine)
(giữ ở 4 °C).
- Dung dịch nạp mẫu SDS-PAGE 5X: 250 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% SDS; 30%
glycerol; 500 mM DTT; 0,02% bromophenol blue.
- Dung dịch chạy SDS-PAGE 1X: 25 mM Tris base; 192 mM glycine; 0,1% SDS.
- Gel điện di polyacrylamide 12% gồm gel gom và gel phân tách, thành phần:
+ Gel gom: 4% acrylamide/bis-acrylamide 29:1; 125 mM Tris-Hcl pH 6,8; 0,1%
SDS; 0,07% APS; 0,1% TEMED.