Nghiên cứu ảnh hưởng của glycosid toàn phần từ quả mướp đắng (monordica charantia) lên hoạt độ enzym glucose 6 phosphatese của gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm

Bộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
NGUYỄN THANH M ơ
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GLYCOSID TOÀN PHẦN
TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG {MOMORDIGA CHARANTIA) LÊN
HOẠT ĐỘ ENZYM GLUCOSE-6-PHOSPHATASE CỦA GAN
CHUỘT TÃNG ĐƯỜNG HUYẾT THựC NGHIỆM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn : Ths. Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại học Dược Hà nội
Thời gian thực hiện: 512005-5 12006
Hà Nội-5/2006
Em xỉn bày tỏ lồng biết ơn sáu sắc, sự khâm phục và yêu qúy tới Cô
giáo: Ths. Phùng Thanh Hương - người đã rất tận tình, chu đáo hướng
dần em trong quá trình làm khoá luận và đã giúp em trưởng thành hơn
trong cuộc sông.
Em xin gửi tới Thầy giáo - GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng, người đã
giúp đỡ và cho em những lời khuyên quí giá trong quá trình làm khoá
luận - lời cảm ơn chán thành nhất.
Em xin cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo, chị em kỹ thuật viên - bộ
môn Hóa sinh, trường Đại học Dược Hà Nội - đã luôn tạo mọi điều kiện
giúp đỡ để em hoàn thành khoá luận.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới các Thầy, Cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy để chúng em có được
ngày hôm nay.
Sinh viên: Nguyễn Thanh Mơ
J ¿ é i C Ẩ Ỉ U I đ n ^
LỜI CẢM ƠN Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN 3
1.1. Bệnh đái tháo đường: 3
1.1.1. Khái niệm:

3
1.1.2. Dịch tễ: 3
1.2. Các dược liệu điều trị ĐTĐ và xu hướng nghiên cứu cơ chế tác dụng:

4
1.3. Mướp đắng: 7
1.3.1. Sơ lược về cây Mướp đắng: 7
1.3.1. Tác dụng hạ đường huyết của Mưófp đắng: 9
1.4. Enzym Glucose-6-phosphatase: 10
1.4.1. Đại cương về enzym GóPase:
10
1.4.2. Vai trò của Glucose-6-phosphatase trong điều hòa đường huyết và bệnh đái
tháo đường; 15
1.4.3. Một số phương pháp xác định hoạt độ enzym GóPase: 15
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18
2.1. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu: 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu: 19
2.2.1. Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzym GóPase:

19
2.2.2. Phương pháp xác định giá trị hoạt độ enzym GóPase trên gan chuột bình
thường: 20
2.2.3. Mc định ảnh hưởng của glycosid quả Mướp đắng lên hoạt tính enzym
GóPase ở gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm với liều Iglkg:

20
MỤC LỤC
2.2.4. Xác định ảnh hưởng của glycosỉd quả Mướp đắng lên hoạt tính emym
GóPase ở gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm bởi STZ với liều lOOmg/kg: 20
2.2.5. Phương pháp định lượng phospho vô cơ (phương pháp FISKE và
SUBBAROW, kỹ thuật VANDEN-CARAVAY): 21
2.2.6. Phương pháp đo đường huyết dùng glucose oxidase: 21
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu: 21
2.3. Thực nghiệm và kết quả:
22
2.3.1. Xây dựng đường chuẩn về mật độ quang của dung dịch phospho:

22
2.3.2. Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzym GổPase:

23
2.3.3. Hoạt độ enzym GóPase của gan chuột bình thường:

26
2.3.4. Ảnh hưởng của glycosid quả Mướp đắng lên hoạt tính enzym GổPase gan
chuột nhắt trắng tăng đường huyết bởi adrenalin liều Ig/kg:

28
PHẦN 3: BÀN LUẬN 30
3.1. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym GóPase:

30
3.2. Hoạt độ enzym GóPase của chuột bình thường: 31
3.3. Về khả năng hạ glucose máu của glycosid quả Mướp đắng:

32
3.4. Hoạt độ enzym GóPase ở mô hình tăng đưòfng huyết bằng adrenalin (Ig/kg):
.32
3.5. Hoạt độ enzym GóPase ở mô hình tăng đưòfng huyết do STZ; 33
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 36
4.1. KẾT LUẬN: 36
4.2. ĐỂ XUẤT:

37
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐTĐ
Đái tháo đường
Fl,6DPase
Fructose-1,6 Diphosphatase
G6P Glucose 6 phosphat
GóPase
Glucose-6-phosphatase
G6PD
Glucose-6-phosphat dehydrogenase
GK
Glucokinase
GS
Glycogen synthase
HĐE Hoạt độ enzym
MD
Malate dehydrogenase
SD
Succinate dehydrogenase
STZ
Streptozotocin

TĐH Tăng đường huyết
WHO Tổ chức Y tế thế giới
ĐÃT VẨN ĐỂ
Hiện nay, cùng với bệnh ung thư và tim mạch, đái tháo đường là một trong
ba bệnh được thế giới quan tâm nhiều bởi đây là một bệnh mạn tính thường có
nhiều biến chứng nguy hiểm với số người mắc tăng nhanh, chi phí cho điều trị
cao do phải sử dụng thuốc lâu dài và thường xuyên. Do vậy, việc tìm ra một
thuốc có tác dụng điều trị tốt, giá cả phù hợp, ít tác dụng phụ là mục tiêu của
nhiều nghiên cứu về thuốc điều trị bệnh này.
Để phòng và điều trị đái tháo đường, từ lâu nhân dân ta đã sử dụng Mướp
đắng theo kinh nghiệm dân gian một cách rộng rãi và có hiệu quả. Đồng thời, có
nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đều đi đến kết luận: trong các
bộ phận khác nhau của Mướp đắng (thân, lá, quả ) chứa các thành phần có tác
dụng gây hạ đường huyết trên động vật thí nghiệm cũng như trên người [1], [5],
[6], [7], [16]. Đặc biệt, Phạm Văn Thanh (Viện Dược Liệu) đã chiết xuất và bào
chế thành công viên nang với thành phần chính là glycosid quả Mướp đắng, kết
quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm này gây hạ đường huyết đáng kể
trên người bệnh đái tháo đường [5]. ở nước ta, mặc dù Mướp đắng đã được
nghiên cứu và ứng dụng từ lâu nhưng cơ chế hạ đường huyết của Mướp đắng vẫn
là một câu hỏi chưa có lời giải đáp. Đến nay, các nghiên cứu đưa ra nhiều 2Ìả
thuyết khác nhau về cơ chế hạ đường huyết của Mưóỉp đắng như;
> Tác dụng tại tụy: Kích thích tế bào beta của đảo tụy tăng tiết insulin
[16].
> Tác dụng ngoài tụy :
a. ức chế tổng hợp glucose bằng cách ức chế các enzym tân
tạo đường như GóPase; Fl,6DPase [17].
b. Tăng cường vận chuyển glucose vào các mô [17], [16].
c. Tăng cường oxi hóa glucose bằng cách hoạt hóa enzym
glucose-6-phosphat dehydrogenase [16].
> Chứa thành phần có tác dụng tương tự insulm [17], [16].

> Mướp đắng có tác dụng thu nhặt, loại trừ các gốc tự do Superoxyd và
hydroxyl là những gốc có liên quan đến đái tháo đường [16], [17].
GóPase là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong quá trình tân tạo đường,
do đó hoạt tính của enzym này ảnh hưởng đến nồng độ đường huyết. Mặt khác,
các nghiên cứu ở nước ngoài cũng cho thấy, nhiều thuốc có tác dụng hạ đường
huyết thông qua ức chế hoạt tính enzym GóPase. Hơn nữa, ở Việt Nam cho đến
nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phương pháp xác định hoạt độ enzym
GóPase. Việc xây dựng một phương pháp xác định hoạt độ GóPase phù hợp, hiệu
quả để góp phần vào các nghiên cứu thực nghiệm khác cũng là một vấn đề cần
được giải quyết. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài này vói các
mục tiêu sau :
1. Khảo sát phương pháp xác định hoạt độ enzym GóPase thông qua
kỹ thuật định lượng phospho vô cơ của Fiske và Subbarow.
2. Xác định giá trị hoạt độ enzytn GóPase ở gan chuột nhắt trắng và
chuột cống trắng bình thường.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của glycosid toàn phần từ quả mướp đắng
lên hoạt tính enzym GóPase gan chuột tăng glucose huyết thực
nghiệm.
PHẨN I; TỔNG QUAN
1.1. Bệnh đái tháo đường:
1.1.1. Khái niêm: Theo định nghĩa của WHO, Đái tháo đưòỉng {Diabete Mellitus)
là “tình trạng tăng glucose huyết mạn tính” [10]. Trên thực tế, đây là một tập hợp
các rối loạn chuyển hoá có biểu hiện chung nhất là sự tăng nồng độ glucose trong
máu, với nguyên nhân là sự giảm tuyệt đối hoặc tương đối về tác dụng và/hoặc
bài tiết insulin.
ĐTĐ được phân loại theo nhiều cách khác nhau. Dựa trên căn nguyên bệnh,
Hiệp hội ĐTĐ Mỹ (1997) đã phân chia ĐTĐ thành các loại như sau [10], [25]:
■ ĐTĐ typ I: do tổn thương tế bào beta dẫn đến thiếu hụt insulin hoàn
toàn, với các căn nguyên như sau:
* Miễn dịch qua trung gian tế bào.

* Không rõ nguyên nhân.
■ ĐTĐ typ II: từ tình trạng kháng insulin là chính kèm theo thiếu hụt
insulin tương đối đến tình trạng thiếu hụt bài tiết insulin kèm theo đề
kháng insulin.
■ Các typ ĐTĐ đặc hiệu khác.
1.1.2. Dich tễ:
Theo ước tính của WHO, năm 2000 toàn thế giới có khoảng 171 triệu người
mắc bệnh và theo dự đoán đến năm 2030, con số người mắc bệnh sẽ tăng lên đến
366 triệu [10], [25]. Đáng chú ý là bệnh có xu hướng gia tăng mạnh tại các quốc
gia đang phát triển ở châu Phi, châu Mỹ La tinh và châu Á, trong đó có Việt
Nam.
ở Việt Nam, đái tháo đường là bệnh thưòng gặp nhất và có tỷ lệ tử vong cao
nhất trong các bệnh nội tiết. Thống kê năm 2000 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở Hà
Nội là 4%, thành phố Hồ Chí Minh là 4% [2].
Với tính chất là một bệnh mạn tính, kéo dài gần như suốt đời, lại kèm theo
nhiều biến chứng nguy hiểm, ĐTĐ không chỉ làm giảm chất lượng cuộc sống của
người bệnh mà còn gây ra gánh nặng về kinh tế do làm giảm lực lượng lao động
xã hội và các chi phí tốn kém cho điều trị. Vì những lí do đó, ĐTĐ không chỉ là
một vấn đề của riêng ngành y tế mà đã trở thành vấn đề chung của xã hội, đòi hỏi
phải được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn nữa.
1.2. Các dươc liêu điều tri ĐTĐ và xu hưởng nghiên cứu cơ chẽ tác dung;
Thuốc điều trị đái tháo đường được chia làm hai nhóm chính: Thuốc tân
dược và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Có nhiều nhóm thuốc tân dược đang
được sử dụng trong điều trị đái tháo đưòfng (insulin, sulfonylurea, nhóm
biguanid ) tuy nhiên nhược điểm của hầu hết các thuốc này là có nhiều tác
dụng phụ, chi phí điều trị cao.
Từ lâu nay, nhân dân ta đã khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc cực kỳ
phong phú của Việt Nam để dùng trong các bài thuốc cổ truyền điều trị ĐTĐ.
Rất nhiều loài cây quen thuộc như Chè xanh
{Camellia sinensis), cỏ ngọt (Stevia

rebaudiana), Cải xoong {Nasturtium ojficinal) được dùng hàng ngày để phòng và
điều trị ĐTĐ theo kinh nghiệm dân gian, vừa mang lại hiệu quả tốt, lại rất ít tác
dụng phụ và độc tính, đặc biệt là dễ kiếm và rẻ tiền, Việc khai thác và sử dụng
các thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong điều trị bệnh cũng là một xu hướng chung
của thế giới.
Không chỉ dừng lại ở việc sử dụng thuốc theo kinh nghiệm dân gian, rất
nhiều nghiên cứu ở cả Việt Nam và trên thế giới đã khẳng định tác dụng và tìm
ra cơ chế của nhiều dược liệu. Lô hội {Aỉoe vera) là một ví dụ. Nghiên cứu của
tác giả s. Rajasekaran và cộng sự (2004) cho thấy điều trị dài ngày bằng dịch
chiết ethanol của Lô hội cho chuột cống đái tháo đưòfng gây bởi STZ (55mg/kg)
làm giảm đường huyết một cách có hiệu quả và không có bất cứ biểu hiện độc
tính cấp nào. Đồng thời nghiên cứu này cũng làm sáng tỏ cơ chế hạ đường huyết
của Lô hội: tăng tổng hợp glycogen (139%) do kích thích enzym glycogen
synthase (tăng hoạt tính 50%) và ức chế enzym glycogen phosphorylase (giảm
hoạt tính 29%); làm tăng hoạt tính hexokinase (98%) và giảm hoạt tính của các
enzym: lactat dehydrogenase (46%), glucose-6-phosphatase (44%), fructose 1,6
diphosphatase (32%) [10].
Năm 2001, một nghiên cứu của Peter Natesan Pushparạị và cộng sự về cơ
chế hạ đường huyết của Averrhoa bilimbỉ cũng cho kết quả tương tự. Dịch chiết
ethanol của dược liệu này gây hạ đường huyết một cách có ý nghĩa trên chuột đái
tháo đường do STZ. A.bilimbi tác động vào nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ
glucose máu: tăng nồng độ insulin trong huyết thanh, ức chế hoạt tính enzym
glucose-6-phosphatase ở gan, tăng dự trữ glycogen ở gan [19].
Một dược liệu quan trọng nữa được dùng trong điều trị ĐTĐ là Thổ phục
linh (Smiỉax glabra). T. Fukunaga (1997) đã ghi nhận dịch chiết methanol từ
thân rễ Thổ phục linh có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột nhắt bình thưòfng
và chuột ĐTĐ typ 2 [28]. Từ thân rễ Thổ phục linh, các nhà khoa học đã tách
được các hoạt chất gây hạ glucose huyết như; phenylpropanoid, glycosid và một
số flavonoid. ở Việt Nam, Nguyễn Ngọc Xuân và Đào Văn Phan đã xác định
ảnh hưởng của Thổ phục linh lên nồng độ glucose và insulin máu ở chuột cống

ĐTĐ di truyền chủng GK và trên đảo tuỵ cô lập [3].
Ngoài ra, có rất nhiều dược liệu có tác dụng gây hạ đường huyết khác đã và
đang nghiên cứu ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung như Tri mẫu
(Anemarrhena asphodeloides), Nghệ (Cucurma longa), Dừa cạn (Catharanthus
roseus), Sinh địa (Rehmannia glutinosa), Chè (Cameỉỉia sinensis) [31], [20].
Trong đó, Dừa cạn có khả năng phục hồi hoạt tính các enzym GS, G6PD, SD,
MD ở gan chuột ĐTĐ thực nghiệm bởi STZ [20]. Sinh địa một mặt có tác dụng
tăng cường sản xuất insulin nội sinh, mặt khác làm giảm hoạt tính enzym GổPase
và kích thích tổng hợp glycogen ở gan của chuột ĐTĐ thực nghiệm bởi alloxan
[23]. Những nghiên cứu này đã mở ra triển vọng trong việc khai thác, sử dụng
nguồn cây thuốc phong phú đa dạng, không chỉ dưới dạng các bài thuốc cổ
truyền hay các thực phẩm chữa bệnh theo kinh nghiệm mà còn tiến đến xây dựng
các dạng bào chế tiên tiến để tạo điều kiện thuận lợi cho người sử dụng. Trên
thực tế, đã có một số chế phẩm có nguồn gốc dược liệu được bào chế và đưa vào
sử dụng có hiệu quả trên người. Viên nén Diasulin và Diabeta là các ví dụ. Các
chế phẩm này đang được sử dụng một cách có hiệu quả trên thế giới trong điều
trị đái tháo đường. Một điều đáng chú ý là trong thành phần của 2 chế phẩm trên
đều chứa Mưóp đắng- một dược liệu được biết đến khá lâu về tác dụng phòng và
điều trị đái tháo đường [21].
Mặt khác, qua kết quả của các nghiên cứu về cơ chế hạ đường huyết của các
dược liệu như trên chúng ta có thể nhận thấy xu hướng nghiên cứu chủ yếu là xác
định ảnh hưởng của dược liệu lên các yếu tố liên quan đến nồng độ đường huyết
như:
^ Nồng độ insulin trong máu.
Hoạt tính các enzym tham gia vào quá trình thoái hóa glucose
và tổng hợp glycogen.
Hoạt tính các enzym tham gia vào quá trình tân tạo glucose,
thoái hóa glycocen.
Thông thường, một dược liệu làm hạ đường huyết có thể thông qua một trong các
tác động nêu trên hoặc tổng hợp của nhiều tác động.

1.3. Mướp đấng:
1.3.1. Sơ lược về cây Mướp đắng:
Mướp đắng, thuộc họ Bầu bí, là một loài cây quen thuộc đối với người dân
Việt Nam và nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á. Quả thường
được sử dùng hàng ngày như một loại thực phẩm. Quả Mướp đắng chứa thành
phần dinh dưõtig khá phong phú:
Bảng 1: Các thành phần dinh dưỡng có trong quả Mướp đắng [5]
TT
Thành phần
dinh dưỡng
Đơn vị
lOOg ăn
được
TT
Thành phần
dinh dưỡng
Đơn vị
lOOg ăn
được
1
Năng lượng KJ
67
12
Magnesium
mg 70
2 Nước
g
99,4
13 Sắt
mg 0,6

3 Protein TP
g
0,9
14
Kẽm mg 0,8
4
Protein TV G
0,9
15 lod
mg 0,6
5 Glucid
g
3,0 16
Beta caroten
mg
110
6 Cellulose
g
1,1
17 Vitamin BI
mg 0,07
7 Tro
g
0,6
18
Vitamin B2 mg 0,04
8 Natri mg
2,0 19 Vitamin pp mg
0,3
9 Kali mg

270
20 Vitamin c mg
22
10
Calcium mg
18
21
Acid folic mg 72
11 Phospho mg
29
Thành phần hóa học của Mướp đắng bao gồm:
❖ Các chất thuộc nhóm glycosid: Momordicosid A,B, c, D, E,
Fl, F2, I, K, L; Charantin (hỗn hợp của 6 chất); Cucurbitan
triterpenoid I, II, III; Momordicin I, II, III; Momorcharasid I,
II, III; Nuominosid A [8], [6].
♦♦♦ Polypeptid-Lectin: Nhiều protein đã xác định được chuỗi acid
amin tận cùng và trọng lượng phân tử: MAP-30, MCI, MCTI
I, II,III; momorchrin; momorcharin I, II; P-insulin [8],
[6].
Các hợp chất khác: Chất dẫn dụ côn trùng; Chất màu
(Lycopen, beta caroten); các acidamin; khoáng (Ca, Mg, Fe,
Cu, Zn ); các vitamin; các acid béo; các alcol;
aldehyd [8], [6].
Ngoài sử dụng làm thực phẩm, quả và một số bộ phận khác nhau của
Mướp đắng còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian trong các bài thuốc cổ
truyền để chữa một số bệnh: chữa ho; viêm họng; ngứa họng; trừ rôm sảy cho trẻ
nhỏ; bổ máu; đái buốt; rắn cắn; viêm xoang mũi
Bên cạnh đó, theo các nghiên cứu khoa học, Mướp đắng còn có một số tác
dụng dược lý quan trọng như [6], [8], [9]:
• Chống ung thư: Chống gây đột biến, ức chế sự hình thành khối u,

chống bệnh bạch cầu ở chuột.
• Chống virus HIV: Trong hạt Mướp đắng có protein MAP30 có tác
dụng ức chế virus HIV. A momorcharin là thành phần duy nhất của
Momorcharin có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus HIV.
• Chống đái tháo đường; nhiều nghiên cứu chứng tỏ khả năng phòng
và điều trị đái tháo đường của Mướp đắng.
1.3.1. Tác dụng hạ đường huyết của Mướp đắng:
Tác dụng hạ đưcmg huyết của Mướp đắng đã được biết đến từ lâu trong dân
gian, đồng thời cũng được khẳng định trong rất nhiều công trình khoa học trong
và ngoài nước. Có nhiều hoạt chất khác nhau trong Mướp đắng được chứng minh
là có tác dụng hạ glucose huyết. Charantin có khả năng kích thích bài tiết Insulin
ở tuỵ cô lập [5]. Một protein có cấu trúc và hoạt tính tương tự như Insulin cũng
được phát hiện trong quả Mướp đắng [8]. Gần đây nhất (2004) tác giả D.Sathish
sekar và cộng sự đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết từ hạt
Mưófp đắng trên chuột đái tháo đường do STZ. Các tác giả cũng xác định được cơ
chế tác dụng của dịch chiết hạt Mướp đắng là: ức chế hoạt tính các enzym
GóPase (giảm 44%), Fl,6DPase (giảm 33%); kích thích hoạt tính enzym
hexokinase (tăng 98%); làm tăng tổng hợp glycogen ở gan (141%) do kích thích
enzym glycogen synthase (tăng 50%) và ức chế enzym glycogen phosphorylase
(giảm 28%). Như vậy kết quả của các nghiên cứu về cơ chế gây hạ đưòfng huyết
của Mưófp đắng cũng phù hợp với xu hướng nghiên cứu cơ chế tác dụng của
nhiều dược liệu khác.
ở Việt Nam, Bùi Chí Hiếu và cộng sự đã nghiên cứu điều trị 22 bệnh nhân
ĐTĐ không phụ thuộc Insulin bằng viên khổ qua chế từ quả Mướp đắng với liều
hàng ngày 10 viên 0,25g. Sau 5 tuần điều trị, đường máu giảm ở 54% số bệnh
nhân [14]. Để mở rộng khả năng sử dụng của Mướp đắng, Phùng Thanh Hương
đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết toàn phần thân Mướp đắng trên các mô
hình gây tăng đường huyết ở động vật thí nghiệm. Kết quả cho thấy dịch chiết
này cũng gây hạ đường huyết đáng kể trên động vật thí nghiệm. Đáng chú ý là
nghiên cứu gần đây của Phạm Văn Thanh (Viện Dược liệu) đã xác định một

thành phần quan trọng trong quả và thân Mướp đắng có tác dụng hạ glucose
huyết là glycosid. Tác giả này cũng đã sản xuất thành công viên nang Morantin
với thành phần hoạt chất là glycosid toàn phần và thử nghiệm lâm sàng đạt kết
quả tốt trên người [5]. Tuy vậy, cho đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào ở
Việt Nam xung quanh cơ chế tác động của glycosid Mướp đắng.
1.4. Enzym Gỉucose-6-phosphatase:
1.4.1. Đại cương về enzym GóPase:
Glucose-6-phosphatase (EC 3.1.3.9) là một enzym thuỷ phân, có tên đầy
đủ là D-Glucose-6-phosphat phosphohydrolase. Enzym này đóng một vai trò
quan trọng trong quá trình tân tạo đường và quá trình thoái hóa glycogen ở gan:
xúc tác phản ứng thủy phân glucose-6-phosphat thành glucose. Không giống như
hầu hết các enzym phosphatase tan trong nước khác, đây là một enzym nằm
trong màng lưới nội chất. Cấu tạo của enzym này được mô tả như hình 1.
Hình 1: Mô hình mô tả vị trí enzym GóPase trong màng lưới nội chất.
Enzym GổPase bao gồm một tiểu đơn vị xúc tác liên kết glucose có khối
lượng 36 kDa được ký hiệu là P36 và một protein có khối lượng 46kDa (Tl) là
kênh vận chuyển cơ chất GÓP ký hiệu là P46. Ngoài ra, hệ thống enzym này còn
chứa một kênh vận chuyển phosphat vô cơ (T2) và một kênh vận chuyển glucose
10
tự do ra ngoài (T3). Kết quả nghiên cứu cấu tạo không gian của enzym này cho
thấy có 9 chuỗi xoắn protein của P36 với đầu N tận quay ra phía ngoài màng của
lưới nội chất trong khi ở P46 có 10 chuỗi [14].
Trong cơ thể, quá trình xúc tác phản ứng thuỷ phân G6P của GóPase bao
gồm qúa trình hình thành phức hợp enzym-cơ chất qua liên kết giữa nhóm
imidazol của histidin trên enzym và nhóm phosphat của cơ chất. Khi được tách ra
khỏi tế bào hoặc tế bào bị can thiệp bởi một số loại chất tẩy thì enzym này còn có
thể xúc tác cho phản ứng thủy phân một số cơ chất khác: Mannose-6-P,
Carbamoyl-P, Mannitol-l-P, PPi, với cơ chế phản ứng tương tự [13].
G l u c o s e - 6 - P
G i u c o s e

\hưiiií»sc-fi-P
Míỉiiiiost*
( 'itrhatiiale
Pi
MaiiiiỉtDÌ
K -llis
! -Ilis-P
Pi
H i O
Hình 2: Mô tả cơ chê xúc tác của GóPase đối với một sô cơ chất
Để giải thích cho khả năng xúc tác phản ứng không đặc hiệu của GóPase
khi được tách khỏi tế bào, năm 1975 W.Arion và cộng sự đã đưa ra giả thuyết
sau: bình thường trong tế bào, tiểu đơn vị xúc tác của enzym nằm hướng vào phía
trong mạng lưới nội chất. Khi cơ chất muốn được xúc tác phải được vận chuyển
vào trong mạng lưới nội chất qua kênh vận chuyển là TI (P46). Kênh TI đặc hiệu
với cơ chất G6P do vậy các cơ chất khác hầu như không tiếp xúc được với enzym
khi enzym còn nằm trong mạng lưới nội chất. Khi tách khỏi tế bào, enzym và các
11
cơ chất được tiếp xúc tự do nên enzym có thể tham gia xúc tác cho các cơ chất
không đặc hiệu. Cho đến nay, giả thuyết này đã được nhiều kết quả thực nghiệm
chứng minh là đúng. Do vậy, tính nguyên vẹn của microsom ảnh hưởng nhiều
đến khả năng xúc tác của GóPase. Kết quả của các nghiên cứu cho thấy khi màng
microsom còn nguyên vẹn, hoạt tính của GóPase trên cơ chất GÓP lớn gấp 10 lần
trên Mannose-6-P (Man-6-P). Dùng chất tẩy anion, cation hay trung tính để xử lý
microsom đều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. Trên thực tế, các chất tẩy này
kích thích hoạt tính của enzym trên cơ chất GÓP đồng thời làm tăng hoạt tính của
nó trên các cơ chất khác (man-6-P, glucosamine-6-phosphate, 2-deoxyglucose-6-
phosphat ) lên 10-15 lần [14], [18], [24].
Có nhiều tác nhân kích thích hoạt tính của GóPase: alamethicin, histone
A2, các tác nhân này kích thích GóPase thông qua thay đổi tính thấm của

microsom [14], [24].
Mặt khác, hoạt tính của GóPase lại bị ức chế bởi khá nhiều tác nhân khác.
Một loại muối được xác định là tác nhân ức chế các enzym phosphatase điển
hình là muối của Vanadi. Hợp chất này ức chế quá trình thuỷ phân cắt nhóm
phosphat và vận chuyển nhóm phosphate của enzym GổPase. Mức độ ức chế tăng
lên khi màng microsom bị xử lý với các chất tẩy. Bình thường, hệ số ức chế của
Vanidi là Ki = 5,6 ỊJ. M, trong khi đó với microsom sau khi được xử lý với chất
tẩy hệ số này là Ki= 2,2 ụ M. Ngược lại, EDTA là chất làm mất khả năng ức chế
của muối Vanadi do tạo phức chelat giữa EDTA và Vanadi. Phospho vô cơ là
một chất ức chế không cạnh tranh trong microsom nguyên vẹn nhưng nó lại trở
thành chất ức chế cạnh tranh khi có mặt của các chất tẩy. Ngoài ra còn nhiều tác
nhân có thể ức chế hoạt tính enzym này: phospho vô cơ, các muối Vonfram, các
phosphoinositid như: diphosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat,
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat và phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat.
12
Khả năng ức chế của các phosphoinositid tuy kém hơn nhưng đây là đại diện cho
loại chất ức chế cạnh tranh có cơ chế liên kết với enzyme tại vị trí xúc tác. Nồng
độ ức chế của các hợp chất này rất cao, lên tới 30%. Gần đây, người ta đã tổng
hợp được hợp chất có khả năng ức chế enzym GóPase ở nồng độ 0,17// M với cơ
chế là tác động lên kênh vận chuyển GÓP [14], [18], [24].
Về đặc điểm dược động học, giá trị Km của GóPase là 2-3 lĩiM, cao hơn
nồng độ G6P thường có trong tế bào (0,05-ImM). Trong khi đó, hoạt động sinh
lý của enzym được điều hoà bởi nồng độ cơ chất. Điều này giải thích tại sao khi
lượng glucose tăng hoặc giảm trong máu ảnh hưởng rất ít đến hoạt độ enzym
này. Bình thường, khả năng hoạt động của enzym này luôn lớn hơn lượng cơ chất
sẵn có trong cơ thể để tham gia phản ứng, nên khi nồng độ glucose máu giảm
hoạt tính của enzym không cần bị kích thích mà vẫn đủ để đáp ứng nhu cầu tân
tạo đường của cơ thể. Trong trường hợp nồng độ glucose máu tăng cao hơn bình
thường, glucose chỉ có tác dụng ức chế gián tiếp thông qua tăng tổng hợp
glycogen nhờ vậy giảm nồng độ GÓP. Hơn nữa nhiều nghiên cứu cho thấy, khi ủ

gan với glucose ở nồng độ cao sau một thời gian từ 24- 48 giờ lượng mARN của
GóPase còn tăng lên nhiều lần.
Nhiều mô trong cơ thể chứa enzym GốPase, tuy nhiên enzym này chủ yếu
có ở gan, vỏ thận, một lượng rất nhỏ ở ruột non, tế bào beta của đảo tuỵ. Đối với
chuột cống trắng, nếu coi lưọfng GóPase ở gan là 100% thì phân bố của enzym
này trong các cơ quan khác nhau được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2: Phân bô của enzym G6Pase trong các cơ quan trong cơ thể chuột
cống trắng
Gan Thận Ruột non Tim
Lách
Cơ Phổi Dạ dày Não Máu
100 31 18 0,8 1 0,8 0,4 0,4 0,8
0,1
13
Ngoài ra, đối với cùng một cơ quan, hoạt độ của GổPase thay đổi theo tình
trạng bệnh của cơ quan đó. Điển hình là ở gan hoạt tính enzym trong một số
bệnh được các tác giả Ruth c. Harris và Carmen Olmo nghiên cứu trên một sô
bệnh nhân nhỏ tuổi, kết quả như sau:
Bảng 3; Hoạt độ enzym G6Pase ở các bệnh nhân nhỏ tuổi mắc các bệnh
khác nhau
Bệnh nhân
Tuổi Tinh trạng bệnh
Hoạt độ enzym (mg p/ Gm gan)
S.D
3 tháng
Viêm gan
1,6
c. D so 2 năm
Xơ gan
3,6

A.s
10 tháng
Viêm phổi
3,2
T. s 5 tuần Tắc ruột non bẩm sinh
6,1
Mặt khác, sự thay đổi của enzym GóPase là nguyên nhân của một số bệnh
do GóPase tham gia vào 2 quá trình chuyển hoá trong cơ thể là: quá trình tân tạo
đường và quá trình thoái hoá glycogen. Bệnh Gierke hay còn gọi là bệnh về dự
trữ glycogen typ I là do bất thường về GóPase, dẫn đến cơ thể không thoái hóa
được glycogen thành glucose. Cụ thể, Typ la - typ thường gặp nhất đối với các
bệnh về dự trữ glycogen - là do thiếu hụt lượng GóPase trong cơ thể, nguyên
nhân của sự thiếu hụt này là do bất thường về gen của GốPase, còn hậu quả của
sự thiếu kênh vận chuyển GÓP là nguyên nhân của bệnh về dự trữ glycogen typ 2.
Đối với quá trình tân tạo đường, hoạt tính của GóPase tăng mạnh là một trong
những nguyên nhân làm tăng thêm mức đường huyết ở bệnh đái tháo đường.
Như vậy có thể thấy, rất nhiều yếu tố khác nhau làm ảnh hưởng đến hoạt
tính của enzym GóPase. Việc xác định mức độ thay đổi của G6Pase có thể được
tiến hành thông qua các phương pháp định lượng khác nhau. Do đó, việc khảo sát
14
và xây dựng một phương pháp định lượng hoạt độ G6Pase hiệu quả, phù hợp với
điều kiện thực tế là rất cần thiết.
1.4.2. Vai trò của Glucose-6-phosphatase trong điều hòa đường huyết và
bệnh đái tháo đường:
Glucose-6-phosphatase là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng của con
đường tân tạo glucose, để chuyển từ glucose-6-phosphat thành glucose tự do.
Enzym này chỉ có ở gan và một phần không đáng kể ở thận, ruột non [14], [18].
Do đó, gan là tổ chức quan trọng nhất có khả năng tổng hợp glucose nội sinh để
điều hoà glucose huyết.
Bên cạnh glucose nội sinh do cơ thể tự tổng hợp, nồng độ glucose trong

máu ở thời điểm xa bữa ăn còn có thể được điều hoà bằng sự thoái hoá glycogen
ở gan, để giải phóng một lượng lớn glucose vào máu. Trong quá trình thoái hóa
của glycogen cũng tạo ra sản phẩm trung gian là glucose-1-phosphat nhanh
chóng được đồng phân hoá thành GÓP, do vậy quá trình này cũng cần sự xúc tác
của enzym glucose-6-phosphatase để đi đến sản phẩm cuối cùng là glucose.
ở cơ thể bị bệnh đái tháo đường, hoạt độ enzym GóPase không chỉ cao vào
thời điểm xa bữa ăn mà ngay cả lúc no hoạt độ enzym cũng ở mức cao. Nguyên
nhân của tình trạng này là do thiếu insulin tương đối hoặc tuyệt đối làm mất cân
bằng giữa các yếu tố kích thích và ức chế hoạt tính GóPase dẫn đến tăng hoạt
tính của enzym này và cũng chính là một trong những nguyên nhân làm tăng
thêm mức đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đưòỉng.
1.4.3. Một sô phương pháp xác định hoạt độ enzym GổPase:
Cho đến nay, có ba phương pháp chủ yếu được sử dụng để xác định hoạt độ
GóPase dựa trên khả năng xúc tác của GóPase cho phản ứng thuỷ phân cơ chất
15
GÓP. Sự khác nhau giữa 3 phương pháp này là sử dụng những tác nhân khác nhau
để làm ngừng phản ứng:
♦♦♦ Phương pháp thứ nhất của Surholt và Newsholme (1981): nguyên tắc của
phương pháp này là ủ dịch chiết mô với cơ chất G6P đánh dấu trong một
thời gian nhất định, ngừng phản ứng bằng cách dùng dung dịch Ba(OH) 2
và ZnSO 4 để hấp phụ lượng phosphat hữu cơ trong hỗn hợp phản ứng, cơ
chất bị hấp phụ vào tủa tạo thành do vậy không tiếp xúc được với enzym
nên phản ứng bị ngừng [14], [22].
♦> Phưoìig pháp thứ 2: ngừng phản ứng bằng cách dùng dung dịch FeC13
được điều chỉnh đến pH = 6 bởi dung dịch NaOH, Protein trong hỗn hợp bị
kết tủa và tủa Fe(OH) 3 tạo thành cũng sẽ hấp phụ cơ chất làm ngừng phản
ứng [18], [22].
♦> Phương pháp thứ 3: làm ngừng phản ứng bằng dung dịch acid
trichloroacetic 10% gây kết tủa enzym làm mất hoạt tính [12], [24].
Sau khi ngừng phản ứng, hoạt độ enzym tính bằng lượng phospho vô cơ

giải phóng ra. Lượng phospho này được định lượng trực tiếp bằng một số phương
pháp định lượng phospho vô cơ khác nhau hoặc gián tiếp thông qua lượng
glucose tạo thành đã được đánh dấu phóng xạ bằng phưofng pháp sắc khí giấy.
Đối với phương pháp thứ nhất, do trong hỗn hợp phản ứng ngoài GÓP còn
có một số cơ chất khác (PP, manitol-6-phosphat ) có thể bị thuỷ phân bởi
GóPase, các cơ chất này không bị hấp phụ bởi BaSO 4 và Zn(OH) 2 nên phản ứng
không được ngừng hoàn toàn gây nên sai số dương rất lớn trong kết quả thu
được. Với phương pháp thứ hai và thứ 3 mức độ chính xác cao hơn nhiều, do đã
làm ngừng phản ứng hoàn toàn bằng cách tủa enzym. Một nghiên cứu về hoạt độ
16
GóPase ở cơ một số động vật của các tác giả Reihard.L, Doreen .w đã chứng
minh điều này thông qua các số liệu thu được trong bảng 4 [22]:
Bảng4; Hoạt độ G6Pase ở cơ động vật với các phương pháp định lượng khác
nhau [22]
Động vật Loại cơ
Hoạt độ enzym (ụ mol/phút/g)
PPl
PP2
PP3
Gián Cơ cánh
0
0,35+0,04
0,35+0,05
Ong chúa
Cơ cánh 5±0,22
2,0±0,25
1,8±0,30
Ong mật Cơ cánh
3,5
2,0±0,25 1,8±0,20

Bồ câu Cơ ngực
1,8
0,63±0,05 0,53±0,06
Chuột cống trắng
Tim
0,30
- -
(PP: Phương pháp)
Tuy nhiên, ở phương pháp thứ hai cần điều chỉnh hỗn dịch phản ứng đến
pH = 6 một cách chính xác nên khá phức tạp và mất thời gian.
Hiện nay, với đặc điểm đofn giản, chính xác, phương pháp thứ 3 là phương
pháp được sử dụng nhiều hơn cả và phospho vô cơ giải phóng ra thưòỉng được
định lượng bằng phương pháp Fiske và Subbarow. Do đó, phương pháp này được
lựa chọn trong nghiên cứu của chúng tôi.
17
IS"«''
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tương, nguyên liêu nghiên cứu:
• Glycosid toàn phần từ quả mưóp đắng do Viện Dược Liệu cung cấp, được pha
thành dạng hỗn dịch trong nước với nồng độ 48 mg/ml có gôm Arabic để làm
ổn định hỗn dịch.
• Chuột nhắt trắng, giống đực và cái, trọng lượng 28-30 g mua tại Viện Vệ Sinh
Dịch Tễ trung ương. Chuột được chia thành các lô 5 con.
• Chuột cống trắng thuần chủng, giống đực, cái, trọng lượng : 90-100 g mua tại
Viện Quân Y 103. Chuột được chia thành các lô 5 con.
• Cơ chất G6P (Fluka biochemie Gmbh CH 9471, Switzeland).
• Eikonogen- Trung quốc.
• Dụng cụ nghiền đồng thể.
• Máy ly tâm lạnh HERAESU-Sepatech.
• Kít đo glucose máu One Touch Basic (JOHNSON & JOHNSON).

• Máy đo glucose máu One touch Basic (JOHNSON & JOHNSON).
• Máy đo mật độ quang ư v -VIS auto-Lamed.inc.
• Adrenaline, ống tiêm Img/ml (Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương II).
• Glucose dược dụng (Công ty dược phẩm Trung ương I),
• Các hóa chất khác đạt độ tinh khiết hóa học.
18
2.2. Phương pháp nghién cứu:
2.2.1. Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzym GóPase:
Nguyên tắc; : Xác định hoạt độ enzym G6Pase bằng cách giải phóng nhóm
phosphat từ cơ chất GÓP ở điều kiện nhiệt độ và pH thích họp, trong một khoảng
thời gian xác định. Ngừng phản ứng bằng acid trichloroacetic. Hoạt độ GóPase
được tính dựa vào lượng phospho giải phóng trên một đơn vị thời gian của một
lượng gan xác định.
Tao dich enzvm GổPase: Cân 0,5 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó cho
vào ống nghiền đồng thể đã có sẵn 5ml dung dịch đệm lạnh (pH = 6,8). Nghiền
gan trong điều kiện lạnh (T® < 4 ° C) đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm
đệm lạnh để được tỷ lệ (gan: đệm) là (1:40). Lắc đều hỗn dịch và lọc qua lớp
bông mỏng. Ly tâm lạnh ở 4 °c X 3000 rpm X 10 phút thu dịch trong là dịch
enzym dùng để xác định hoạt độ.
Quá trình xúc tác của enzvm: Cơ chất và hỗn dịch enzym được ủ ở 37 °c, lấy
lần lượt 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml dung dịch enzym cho vào các ống nghiệm có vạch
đánh dấu 5ml chứa sẵn 0,2 ml dung dịch cơ chất. Mỗi ống nghiệm trên được ủ
tiếp ở 37 °c trong 10 phút. Ngừng phản ứng bằng 2ml acid tricloacetic. Lắc kỹ và
để 10 phút cho phản ứng ngừng hoàn toàn, thêm nước cất vừa đủ 5ml. Sau đó ly
tâm 3000 rpm X 10 phút. Định lượng phospho vô cơ giải phóng ra theo phương
pháp Fiske và Subbarow. Làm lại quy trình như trên nhưng với lượng enzym
tham gia xúc tác là 0,2 ml trong các thời gian ủ là 12; 14; 16; 18 và 20 phút.
♦♦♦ Tương ứng với mỗi lượng cơ chất được lấy cũng như thời gian ủ, luôn có một
ống không chứa cơ chất được tiến hành song song để loại trừ sai số do các cơ
chất khác có sẵn trong dịch enzym cũng tham gia phản ứng do GóPase xúc tác.

19
<♦ Để xác định độ lặp lại của phương pháp trên cùng một mẫu gan, tiến hành lấy
4 mẫu dịch enzym của cùng một mẫu gan để định lượng song song rồi so sánh
kết quả.
2.2.2. Phương pháp xác định giá trị hoạt độ enzym GóPase trên gan chuột
bình thường:
Chuột được chia thành các lô 10 con, chuột đực cái phân lô riêng. Nuôi
đến trọng lượng 28-30 g đối với chuột nhắt, và 90-100g đối với chuột cống. Cho
chuột nhịn đói 12 giờ, đo giá trị đường huyết sau đó gây mê rồi mổ chuột lấy gan
xác định hoạt độ enzym như trên. Giá trị thu được là giá trị trung bình của tất cả
các chuột trong mỗi lô.
2.2.3. Xác định ảnh hưởng của glycosỉd quả Mướp đắng lên hoạt tính enzym
GóPase ở gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm với liều Ig/kg:
Chuột nhắt trắng nhịn đói 12 giờ được cho uống glycoside (0,8g/kg) sau
4giờ đo đường huyết. Tiêm màng bụng adrenalin, sau 1 giờ đo đường huyết. Mổ
chuột lấy gan ngay sau đó để đo hoạt độ GóPase. Tiến hành song song với một lô
chứng (uống nước cất). So sánh kết quả giữa các lô về hoạt độ enzym.
2.2.4. Xác định ảnh hưởng của glycosỉd quả Mướp dắng lên hoạt tính enzym
GóPase ở gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm bởi STZ với liều
lOOmg/kg:
Chuột cống trắng nhịn đói 12 giờ, đo đường huyết rồi tiêm màng bụng
STZ liều 100 mg/kg, sau đó điểu trị hàng ngày bằng glycoside mướp đắng với
liều: 1,6 g/ kg trong 1 tuần. Đến ngày thứ 7 chuột được để nhịn đói 12 giờ, cho
uống thuốc, sau 4giờ đo đường huyết rồi mổ để lấy gan xác định hoạt độ enzym.
20