Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời almitrine bimesylat và raubasine trong viên nén bao phim kalmitril raubasine bằng sắc khí lỏng hiệu năng cao

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĐỖ HỒNG VÂN
NGHIẺN cúu DỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DỒNG THỜI
■ * m m
ALMITRINE BIMESYLAT VÀ RAUBASINE TRONG VIÊN NÉN
BAO PHIM KALMITRIL BANG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NANG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001 - 2006)
Người hướng dẫn : PGS. TS THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN
Nơi thực hiện : Phòng Hoá Lý I - Viện kiểm nghiệm
Bộ môn hoá dược
Thời gian thực hiện : 9/2005 đến 5/2006
HÀ NỘI 5 - 2006
Lời cảm ơn
Khoá luận này được thực hiện tại phòng hoá lý I- Viện kiểm nghiệm và
Bộ môn Hoá Dược-Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện
khoá luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn và
các cán bộ phòng hoá lý I-Viện kiểm nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội
đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và cơ sở hoá phân tích, hoá dược để
tôi áp dụng trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành khoá luân tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin cảm ofn tập thể cán bộ phòng hoá lý I-Viện kiểm nghiệm đã
tạo điều kiện và giúp tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết cfn sâu sắc đối với:
- TS.Thái Duy Thìn (phó chủ nhiệm bộ môn Hoá Dược-Trưòfng đại
học Dược Hà Nội)
- PGS.TS. Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý I-Viện
kiểm nghiệm)
đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm khoá luận.
Hà Nội, tháng 5/2006

Sinh viên
Đỗ Hồng Vân
MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Đặt vấn đề
1
Phần 1: Tổng quan 3
1.1. Almitrine bimesylat 3
1.2. Raubasine 5
1.3. Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến 8
1.4. Kỹ thuật HPLC 8
1.4.1. Khái niệm cơ bản 8
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng 9
1A3. Hệ thống HPLC 12
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC 12
1.4.5. Pha động trong HPLC 13
1.4.6. Cách đánh giá pic 14
1.4.7. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

14
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
.
17
2.1. Hoá chất và thiết bị
17
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 17

2.2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18
2.3. Kết quả thực nghiệm và nhận xét

22
2.3.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc k ý 22
2.3.2. Xây dựng phương pháp định tính Almitiine bimesylat và Raubasine
trong chế phẩm Kalmitril 29
2.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Almitrine bimesylat và
Raubasine trong chế phẩm Kalmitril
33
2.3.4. Đánh giá phương pháp 34
2.3.4. Đánh giá ưu, nhược điểm của HPLC 43
2.3.5. Bàn luận 43
Phần 3: Kết luận và đề xuất 45
3.1. Kết luận 45
3.2. Đề xuất 45
Tài liệu tham khảo
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
SKĐ
: Sắc ký đồ
SKS
: Số kiểm soát
CTCP
: Công ty cổ phần
CIDL
: Công ty dược liệu
s
: Diện tích

c
: Chuẩn
T
:Thử
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Ký hiệu
Nội Dung
Trang
1
Bảngl
Hệ số match so sánh giữa phổ chuẩn và thử.
29
2 Bảng 2
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ
thống
34
3
Bảng 3 Các nồng độ dung dịch chuẩn.
35
4 Bảng 4
Kết quả khảo sát độ tuyến tính.
36
5 Bảng 5 Kết quả khảo sát độ lặp lại.
39
6 Bảng 6
Kết quả khảo sát độ đúng.
41
7
Bảng?

Kết quả định lượng đồng thời hai chất bằng
phương pháp sắc ký vừa xây dựng trên một
số mẫu lưu hành.
43
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Ký
hiệu
Nội Dung Trang
1
Hình 1
Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc
trưng.
9
2
Hình 2 Phổ hấp thụ UV- VIS trong pha động của
Raubasine.
24
3 Hình 3
Phổ hấp thụ UV- VIS trong pha động của
Almitrine bimesylat.
25
4 Hình 4
Chồng phổ UV- VIS của Raubasine và
Almitrine bimesylat.
26
5
Hình 5
Sắc ký đồ của Almitrine bimesylat và
Raubasine khảo sát tại bước sóng 230nm.

27
6 Hình 6
Sắc ký đồ của Almitrine bimesylat và
Raubasine khảo sát tại bước sóng 240nm.
27
7
Hình? Sắc ký đồ của Almitrine bimesylat và
Raubasine khảo sát tại bước sóng 254nm.
28
8
Hình 8
Săc ký đồ mẫu chuẩn Almitrine bimesylat
và Raubasine; cột C18 (250x4nm; 5|im);
tốc độ dòng l,2 ml/phút.
30
9
Hình 9
Săc ký đồ mẫu thử - cột C18 (250x4nm;
5|im); tốc độ dòng l,2 ml/phút.
30
1 0 Hình 10
So sánh phổ UV- VIS của Raubasine.
31
11 Hình 11
So sánh phổ UV- VIS của Almitrine
bimesylat.
32
12
Hình 12
ĐỒ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic

của Almitrine bimesylat vào nồng độ.
37
13 Hình 13
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic
của Raubasine vào nồng độ.
37
Đặt vấn đề
•
Trong những năm gần đây, tỉ lệ ngưòi mắc các bệnh lý về tim mạch ở
nước ta ngày càng gia tăng. Do đó, trên thị trường đã xuất hiện nhiều chế
phẩm dùng để điều trị các bệnh về tim mạch. Các chế phẩm này bao gồm
những chế phẩm đofn thành phần và cả đa thành phần. Hiện nay, nhờ sự phát
triển cao của công nghệ bào chế, các nhà sản xuất dược phẩm cho ra đòi
nhiều loại thuốc có kết hợp nhiều dược chất khác nhau để đáp ứng nhu cầu về
phòng và chữa các bệnh khác nhau về tim mạch. Tuỳ theo mục đích điều trị
mà các nhà sản xuất đã phối hợp các thành phần hoạt chất khá đa dạng trong
công thức bào chế.
Công ty Dược phẩm Khánh Hoà đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm viên
nén bao phim Kalmitril với công thức bào chế như sau:
Almitrine bimesylat 30,0mg
Raubasine 10,0mg
Tá dược vừa đủ 500,Omg
Biệt dược này là sản phẩm dựa trên sự phối hợp tác dụng dược lý các chất
có tác dụng giãn mạch ngoại v i, hoạt hoá não bộ . Thuốc được chỉ định khi
rối loạn thần kinh nhẹ liên quan đến tuổi tác, các rối loạn về thị giác do bệnh
lý mạch máu, các rối loạn của tai trong do bệnh lý mạch máu (mất thmh giác,
choáng váng, ù tai).
Thuốc đa thành phần này là sản phẩm mới, không có trong Dược điển
hiện hành. Do đó, để giúp cho nhà sản xuất tiêu chuẩn hoá sản phẩm, về hai
tiêu chí quan trọng là định tính và định lượng cần phải được nghiên cứu xây

dựng phương pháp. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu định
tính và định lượng đồng thời Almitrine bimesylat và Raubasine trong viên nén
bao phim Kalmitril bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” nhằm đóng góp cho
ngành kiểm nghiệm thuốc một qui trình kỹ thuật để đánh giá chất lượng của
1
thuốc trong sản xuất, lưu thông phân phối đối với các chế phẩm có thành phần
tương tự.
Mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng chương trình sắc ký thích hợp cho phép tách, định tính và
định lượng đồng thời Almitrine bimesylat và Raubasine.
- Đánh giá phương pháp đã xây dựng.
- Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu lưu hành.
Phầnl
Tổng Quan
1.1. Almỉtrine bimesylat [4],[6], [7], [8], [9]
* Tên khoa hoc:
2,4-bis[allylamino]-6-[4-[bis(p-flourophenyl)methyl]-l-piperazinyl]-s-triazine
dimethanesulfonate.
* Cống thức phân tử: C26lỈ29F2N7.2 CH4S0 3 .
* Phân tử lương: 669,6.
* Cống thức cấu tao của Almitrine bimesvlat
ĩ
.2CH4SO3
Y
F
*Tính chất:
- Bột màu trắng, không mùi, không vị, không hút ẩm.Thông thường không tan
trong nước, tan ít trong methanol và ethanol, tan được trong chloroform.
- Độ chảy 243° .
- Túih hấp thụ tử ngoại: Dung dịch Almitrine bimesylat trong ethanol có các

cực đại hấp thụ tử ngoại ở bước sóng: 227nm và 246nm.
*Tác dung và cống dung:
Almitrine bimesylat có tác dụng làm tăng áp lực O2 trong khi đó nó sẽ
làm giảm áp lực CO2 ở động mạch đối với những bệnh nhân mắc chứng tắc
nghẽn phổi mạn tính. Đồng thời, nó làm giảm sự bão hoà O2 về đêm mà
không ảnh hưởng đến chất lượng của giấc ngủ.
Dùng trong trường hợp : Suy hô hấp kèm giảm oxy huyết có liên quan
đến bệnh viêm phế quản mạn gây tắc.
* Đinh tính:
- Phổ hồng ngoại: phổ IR thu được của mẫu thử phải tưofng tự phổ IR của
Almitrine bimesylat chuẩn.
- Phổ tử ngoại: Hoà tan 50mg trong ethanol, thêm ethanol vừa đủ lOOml, lắc
đều. Hút lOml dung dịch trên cho vào bình định mức lOOml, thêm ethanol đến
vạch, lắc đều. Đo phổ tử ngoại bước sóng từ 200 đến 350nm. Kết quả có hai
cực đại hấp thụ ở khoảng 227nm và 246nm.
- Sắc ký giấy: Các vết chính trẽn các sắc ký đồ thu được của dung dịch thử
phải giống với các vết chmh trên các sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn
về vị trí và kích thước.
- Nhiệt độ nóng chảy của Almitrine bimesylat: 243°c.
* Các phương pháp đinh lucfng:
+ Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan
Chuẩn độ Almitrine bimesylat trong môi trường acid acetic khan bằng dung
dịch acid percloric 0,1M. Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể.
1ml acid percloric 0,1M tương đương với 33,48mg C26H29F2N7.2 CH4SO3.
+ Phương pháp HPLC [6 ]:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Cột Lichrosorb RP 18 (250x4mm, 5|am).
- Detector UV: 254nm.
- Pha động: dung dịch B- acid acetic băng (100:2), Trong đó:
❖ Dung dịch A: Hoà tan 5,5g natri heptansulphonat trong nước,

thêm 3ml acid acetic băng, rồi thêm nước cất vừa đủ lOOml.
❖ Dung dịch B: Lấy 770ml methanol, thêm 2 O1Ĩ1I dung dịch A, rồi
thêm nước cất vừa đủ lOOOml.
- Tốc độ dòng : l,2ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20|il.
- Nhiệt độ phòng.
1.2. Raubasine [4], [6], [7], [10]
*Tên khoa hoc:
(19a)-16,17-Didehydro-19-methyloxayohimban-16-carboxy lie
acid methyl este.
* C ổ n g t h ứ c p h â n t ử : C 2 1 H 2 4 N 2 O 3 ,
* Phân tử lương: 352,4.
* Cổng thức cấu tao:
MeOoC
*Tính chất:
- Bột màu trắng hoặc hofi vàng, thường không tan trong nước, hiếm khi tan
được trong methylen chlorid và rất ít tan trong methanol.
- Độ chảy 257° .
- Tính chất quang học:
+ Dung dịch Raubasine 0,5M ttong chloroform có góc quay cực là: [a] =-60°
+ Dung dịch Raubasine 0,5M trong pyridin có góc quay cực là: [a] 0 =-45°
+ Dung dịch Raubasine 0,25M trong meứianol có góc quay cực là; [a] =-39°
-Tính hấp thụ tử ngoại: Dung dịch Raubasine trong methanol có các cực đại
hấp thụ tử ngoại ở bước sóng : 227 nm và 292 nm.
*Tác dung và cồng dung:
Là một trong các alcaloid của Rauwolfia serpentina, nhưng có tác dụng
dược lý khác hẳn reserpin vì có tác dụng liệt giao cảm mạnh, làm đảo ngược
tác dụng của adrenalin và cả noradrenalin. Có tác dụng chống thiếu máu cục
bộ ở não và ngoại vi(do tác dụng chọn lọc đến các mạch máu cỡ nhỏ và trung
bình). Ngoài ra, nó còn tăng cường tuần hoàn não, cơ, da, không gây tăng

huyết áp và không ảnh hưởng đến chuyển hoá glucid.
Các chứng bệnh do giảm tuần hoàn não như: xơ cứng mạch não kèm triệu
chứng chóng mặt ù tai, nhức đầu, giảm tập trung tư tưởng Các rối loạn tâm
thần-thần kinh ở người già như giảm hoạt động trí óc Các rối loạn tuần
hoàn ngoại vi như: loét giãn tĩnh mạch, rối loạn chức năng và suy tĩnh mạch,
viêm động mạch
* Đinh tmh:
- Phổ hồng ngoại: Phổ IR thu được của mẫu thử phải tương tự phổ IR của
mẫu chuẩn Raubasinẽ.
- Phổ tử ngoại: Hoà tan 50mg trong methanol, thêm ethanol vừa đủ lOOml, lắc
đều. Hút lOml dung dịch trên cho vào bình định mức lOOml, thẽm methanol
đến vạch, lắc đều. Đo phổ tử ngoại trong dải sóng từ 200 đến 350nm. Kết quả
có hai cực đại hấp thụ ở khoảng 227nm và 292nm.
- Sắc ký giấy: Các vết chính trên các sắc ký đồ thu được của dung dịch thử
phải giống với các vết chúih trên các sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn
về vị trí và kích thước.
* Các phưcrng pháp đinh lương:
+ Phương pháp chuẩn độ:
Chuẩn độ Raubasine trong môi trường acid acetic khan bằng dung dịch acid
percloric 0,1M.
Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tún tinh thể.
Iml acid percloric 0,1M tưcfng đương vói 35,24 mg C21H24N2O3.
+ Phương pháp HPLC [6 ]:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Cột Lichrosorb RP 18 (250x4mm, 5|j,m).
- Detector u v : 254nm.
- Pha động: dung dịch B- acid acetic băng (100:2). Trong đó:
❖ Dung dịch A: Hoà tan 5,5g natri heptansulphonat trong nước,
thêm 3ml acid acetic băng, rồi thêm nước cất vừa đủ lOOml.
❖ Dung dịch B:Lấy 770ml methanol, thêm 20ml dung dịch A, rồi

thêm nước cất vừa đủ lOOOml.
- Tốc độ dòng : l,2ml/phút.
- Thể t í c h tiêm: 20|il.
- Nhiệt độ phòng.
1.3. Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến
Phương pháp này dựa trên định luật Lambert-Beer là mật độ quang của
dung dịch một chất tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem
đo
ở một bước sóng nào đó:
D=k.l.c
Trong đó k là hệ số hấp thụ, c là nồng độ và 1 là bề dày của lớp dung
dịch đem đo.
Trong trường hợp c tính theo nồng độ phần trăm(kl/tt), 1 tính bằng cm
thì hệ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là A(l%,lcm) và
khi đó ta sẽ có công thức sau;
D=A(l%,lcm).C.l
Thông thường khi định lượng bằng phưoĩig pháp này, người ta có thể đo
trực tiếp độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử trong môi trường thích hợp
song song với mẫu chuẩn hoặc so với A(l%,lcm) tại các bước sóng xác định,
hoặc đo độ hấp thụ quang của mẫu thử song song với mẫu chuẩn sau khi tạo
màu với thuốc thử thích hợp.
1.4. Kỹ thuật sác ký lỏng hiệu năng cao [1], [2], [5]
1.4.1. Khái niệm cơ bản:
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) là phương pháp tách hoá lý dựa vào
ái lực khác nhau của các chất khác nhau vói hai pha luôn tiếp xúc và không
đồng tan vói nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy
qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học vói các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra do cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi

ion hoặc rây phân tử.
8
• Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
loại sắc ký. Nếu pha tũih là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tũih là
chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã được gắn pha
liên kết ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký
rây phân tử. Quyết địoh hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tưottig tác :
Chất phân tích
(A+B+C)
F3
Tổng 3 tưcmg tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên khi
lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng:
* Thời gian lưu và thề tích liĩu:
Thời gian lưu của một chất là thòi gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ:
iig ỉm l
Hình 1 : sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng.
Nếu gọi tjỊ là thời gian lưu giữ của một chất thì:
í’r = Ír" to
Trong đó ; t’jỊ là thời gian lưu thực (thòi gian lưu hiệu chỉnh).
to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ).
Khi pha động chảy qua cột vói một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể
thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột
trong khoảng thời gian tương ứng với thòi gian lưu.
* Hê số phân bố :
Trong quá trình chạy sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha
động và pha tĩnh, Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ
số phân bố được tính theo công thức :

:
Trong đó : Cs, Cj^ là nồng độ chạt phân tích ừong pha động và pha tĩnh tại
thời điểm cân bằng.
* Thừa số dung lương:
Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan
trong hai pha cộng vói sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thòi điểm cân bằng.
k’= ^ = K x - ^
Qm
Trong đó Qs, Qm là lượng chất tan trong pha tũih và pha động.
Vs, là thể tích pha tĩnh và pha động.
Có thể tmh k’ theo một công thức khác:
t L
k’=
10
* Hê số chon loc:
Hai chất chỉ tách ra khi chúng có các giá tri k’ khác nhau, hệ số chọn lọc
cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
^ B — B — ^RB — ^0 RB
K
k\
Ta quy ước chất B bị lưu giữ lâu hợn chất A, do đó a luôn lớn hơn 1, a càng
lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thường phân tích trong điều kiện a
trong khoảng 1,5 đến 2.
* Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa Iv thuyết:
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức ;
N=16x
^ hoặc 5,54

í '» ì
Trong đó W: là chiều rộng pic ở đáy pic
Wi/2- là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Chiều cao của đĩa lý thuyết tmh theo công thức:
H = é
N
Trong đó L: chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất định,
chiều cao của đĩa lý thuyết (L) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với
một chất phân tích.
11
* Đổ phân giải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính
theo 1 trong 3 công thức sau:
R ^ 2 x ' « » hoặc l,18x , — hoặc
n '. + i r . ■ h'„,2a, + x'„,2b, « 1 + * '. -t
* Hê số đối xứng (T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký và được tính theo công thức:
T = ^
2A
Trong đó Wx là bề rộng của đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic
đ ế n c h â n đ ư ờ n g c o n g p h í a t r ư ớ c , ở t ạ i 1 / 2 0 c h i ề u c a o p i c .
1.4.3. ffệ thống ffPLC:
Theo thứ tự từ đầađến cuối của hệ thống máy HPLC bao gồm các bộ phận
sau:
- Bình chứa dung môi
- Bofm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc ký
- Bộ phận tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định
- Cột tách (pha tĩnh)

- Detector
- Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tmh
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC:
* Khái niêm: pha tũih trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một
hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp , kích thước hạt rất nhỏ,
đường kính cỡ hạt từ 3-10|am, diện tích bề mặt hạt thường từ 50-500 mVg.
12
* Phân loai:
- Căn cứ vào bản chất của quá trình sắc ký trong cột tách, ngưòi ta chia
nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương
ứng với loại chất nhồi như thế ngưòi ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật
HPLC.
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tũih và pha động, có các loại: sắc ký
pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, ngưòi ta chia nó
thành hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài).
* Điêu kiên đối vái mốt pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc
- Tính chất bề mặt phải ổn định
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.4.5. Pha động trong HPLC:
+ Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh
động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều
dung môi trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ nhất định. Nó cũng có thể là dung dịch
các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ
có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
+ Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của

một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả
sự tách sắc ký.
+Pha động có thể ảnh hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thòi gian lưu giữ của chất tan
13
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tữih
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.
+ Điều kiện đối vói một pha động
- Phải trơ đối vói pha tĩnh
- Hoà tan được chất cân phân tích
- Bền vững theo thòi gian
- Có độ tmh khiết cao
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
- Có túih kinh tế và không quá hiếm.
+ Các yếu tố chính eần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động
- Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
1.4.6. Cách đánh giá pic:
- Đánh giá diện tích pic : Diện tích pic của một chất tương ứng với tổng
lượng chất đó.
- Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là
một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá.
1.4.7. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC.
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là
: Nồng độ của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó . Có 4 phương
pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:

* Phương pháp ngoai chuán.
Có thể dùng đường chuẩn thiết lập bằng nhiều chuẩn có nồng độ khác
nhau. Nồng độ của thử được tính theo tỷ lệ thuận giữa diện tích pic hoặc chiều
cao pic của dung dịch chuẩn.
14
Trong đó: Cp: nồng độ dung dịch thử
Spi diện tích pic thử
SqI diện tích pic chuẩn
Cci nồng độ dung dịch chuẩn ngoại
* Phương pháp nồi chuán
Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, ngưòd ta thêm một chất chuẩn thứ 2 vào
mẫu chuẩn. Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn. Trong cùng điều kiện sắc ký
nó có thời gian lưu giữ gắn với thòi gian lưu của chất phân tích nhưng được
tách hoàn toàn và có tương đưcmg, với cấu trúc hoá học tưofng tự.
Tính yếu tố hiệu chỉnh:
-I^
__
Sq C
F x = — X ^
Sc c.
Trong đó: So: diện tích pic của chất chuẩn nội
Cq. nồng độ dung dịch ngoại chuẩn
Sc : diện tích pic của chuẩn ngoại
Cq. nồng độ dung dịch chuẩn nội
Fx phải hằng định trong vùng nồng độ nghiên cứu, khi đó nồng độ Cr sẽ
tính theo công thức:
C r= ^x Q ,xF x
* Phương pháp thêm chuán
Dùng trong trường hợp chất chuẩn có nồng độ quá nhỏ hoặc bị ảnh hưcmg
bỏi các chất khác. Khi đó dung dịch thử được thêm một lượng xác định chất

chuẩn, khi này nồng độ dung dịch được túih theo công thức:
15
Trong đó As: phần tăng của diện tích pic thử
Ac:lượng chất chuẩn thêm vào
* Phương pháp phẩn trăm diên tích pic (hoâc phán trăm chiều cao pic)
Dùng trong trường hợp cần biết hàm lượng tính theo chế phẩm khô của
hoặc tỷ lệ tạp chất mà ta không có chất chuẩn. Kết quả chỉ là tương đối vì nó
đòi hỏi trong hỗn hợp đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau.
16
Phần 2
Thực nghiệm và kết quả
2.1. Hoá chất và thiết bị:
*Hoá chất:
- Almitrine bimesylate chuẩn làm việc do Viện Kiểm nghiệm cung cấp.
- Raubasine chuẩn làm việc do Viện Kiểm nghiệm cung cấp,
- Methanol tinh khiết HPLC.
- Acid acetic tinh khiết HPLC.
- Acetonitril tinh khiết HPLC .
- Diethylamin tinh khiết HPLC.
- Natributansulfonat.
- Nước cất.
* Dụng cụ-thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng HPl 100 vói detector UV- VIS
- Máy sắc ký lỏng Water 1525 vói detector Diode Aưay
- Máy đo quang phổ UV- VIS
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với đường kứih lỗ màng lọc 0,45 Ịxm
- Máy lắc siêu âm BRANSON 5210
- Cân phân tích Mettler AB 204
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức chúih xác lOOml; 50ml; 25ml;
20ml; lOml; ống đong, pipet chính xác, cốc có mỏ và các dụng cụ thuỷ tinh

khác.
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu:
• Mẫu sử dung: Viên nén bao phim Kalmitril
17
Almitrine bimesylat 30,0mg
Raubasine 10,0mg
Tá dược vđ 1 viên
(tinh bột ngô, ethylcellulose, glycerol,hypromellose, lactose, chất màu
đỏ sẫm hoa mỹ nhân 4R nhồm, titan oxyd, macrogol 6000, povidon, silic
oxyd khan keo, magnesi stearat, bột talc).
Số kiểm soát: 050305 .
Nơi sản xuất; Công ty Dược phẩm Khánh Hoà.
2.2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu:
• Xây dựng chương trình HPLC để định tmh và định lượng đồng thời
Almitrine bimesylat và Raubasine trong viên nén Kalmitril
Qua tham khảo một số tài liệu và trong điều kiện trang thiết bị của cơ sở
nghiên cứu (Phòng hoá lý I- Viện kiểm nghiệm), cũng như điều kiện thực
nghiệm ở nước ta hiện nay, chúng tôi khảo sát những điều kiện sau để chọn
chương trình sắc ký thích hợp:
+ Lựa chọn cột sắc ký; chúng tôi sử dụng cột sắc ký pha đảo
Cột Lichrosorb RP18(250x4mm, 5-10|xm). Đây là cột sắc ký thông dụng
và được sử dụng khá nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc.
+ Khảo sát, lựa chọn dung môi pha động và tốc độ dòng thích hợp cho
phép tách đồng thòi Almitrine bimesylat và Raubasine. Chúng tôi tiến hành
khảo sát trên cơ sở hệ dung môi pha động trong tiêu chuẩn của nhà sản xuất
đã tham khảo được, lựa chọn và điều chỉnh các thành phần, tỷ lệ các thành
phần sao cho các chất được tách tốt nhất.
+ Khảo sát bước sóng xác định đồng thòi Almitrine bimesylat và
Raubasine: tiến hành đo phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch đơn chất hai chất

này, dựa trên nguyên tắc chọn bước ẳóng phát hiện ưu tiên cực đại hấp thụ của
• Công thức:
18