Nghiên cứu một số thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của khương hoạt có trên thị trường việt nam

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
Họ tên sinh viên : Nguyễn Quỳnh Chi
NGHIÊN cứu sơ BỘ THÀNH PHAN h ó a h ọ c
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA KHƯƠNG HOẠT
CÓ TRÊN THỊ TRƯỜNG VIỆT NAM
KHÓA LCIỢN TỐT NGHIỆP
DƯỢC Sỉ ĐỢI HỌC
Khoa 51 (1996 - 2001)
Người hướng dẫn : PGS. TS. Mai Tất Tô'
: PGS. TS. B ế Thị Thuấn
Nơi thực hiện : Bộ môn dược lý
: Bộ môn dược liệu
Thời gian thực hiện : 2/200
Hà Nội, tháng 5-2001
M Ờ J ( ỉ ớ k í l l Ơ Q i
(f uu ầ in /t thiù' /tiền đê tà i jV ỹ/tiân cứu áư ểâ t/iàn/i ỷikun Aoẩ
ểtoe 'tm mM áổ ẵíc duny àrnÁ /uie của /cÁưổnỹ /tout m (àền th i tà ưổny í i ê t jVam
toi đ ã n/tđn đưổc /t ưổnọ dẫn tan ũ n/t của
ỉỹSSP. &ĨP. 'Ẩũu 3ư% &o
ỉ ỹ ê ỉ y . P ĩ ỉ j P . S B ế ỉS ìd & ỉ iu ấ n
3 o i xin ểà y ủ ỉ lòn<j é iế t ổn bâu ầắc oảa niìnA tồi títít/y m
7
M ầiàn l/tê cấc
títầ/y ỹflẩũ
,
m ỹiảù , cẩc m /k ỹ ừ ii«u 'ềùên tâtmỹ ểô mon
í2Wd?
(ỷ , ểô môn (SsiMỉ ửêu
càn<j cúc ývỉiòny ếan tfamy tàưổny đ ã ỹkiỷệ đ õ 'IM tao nud đmu

/ l
iên l/tu đn ủỉi đê tôi
hoàn 1/iừnÁ tỉiì Á/toẩ ỉuăn n à y .doi xin <Ádn l/tàn /i cảm ổn ỹiiĩỷỉ đ õ (ỊỊuỷ ếãu
m à <xíc thư/y
,
cô đ ã ỹiànÁ c/to lôi
.
(&UM càrưj ỉôi XỈ/H đtửĩc cảm ổn ỹửíýi- đ õ , đônỹ 'M'ền
,
/íềt4Mfến ÁAí(Á của
ểưn ếè} nỹrừỉi thăn ầ<m <j[ buêt tỉùti yrun tồ i t/uù' /t iền đê tà i na if
.
Hà nội, ngày 16 tháng 5 năm 2001
Sinh viên
Nguyên Quỳnh Chi
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần 1 : Tổng quan tài liệu 2
1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.2. Đặc điểm vị thuốc 3
1.3. Thu hái, chế biến 5
1.4. Thành phần hoá học 5
1.5. Tác dụng , công dụng 6
Phần 2 : Nguyên liệu , nội dung, phương pháp nghiên cứu 8
Phần 3 : Thực nghiệm , kết quả và bàn luận 11
3.1. Sơ bộ định tên khoa học vị thuốc 11
3.2. Thành phần hoá học 12
3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong khương hoạt 12
3.2.2 Định tính một số nhóm chất tự nhiên trong dược liệu

bằng các phản ứng hoá học 13
3.2.3 Chiết tách , phân lập định tính coumarin trong
khương hoạt 20
3.3 Tác dụng dược lý 29
3.3.1 Tác dụng trên tim ếch tại chỗ 29
3.3.2 Tác dụng trên tim ếch cô lập 30
3.3.3 Tác dụng chống viêm cấp 31
3.3.4 Tác dụng chống viêm mãn 32
3.3.5 Tác dụng giảm đau 34
3.3.6 Tác dụng trên huyết áp 36
3.3.7 Tác dụng chống loạn nhịp tim 37
Phần 4 : Kết luận và đề nghị 39
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
ĐẶT VÂN ĐỂ
Từ xa xưa tới nay con người đã biết sử dụng cây cỏ trong thiên nhiên để làm
thuốc chữa bệnh . Qua tích luỹ kinh nghiệm dân gian đã dần hình thành nên một
nền y học cổ truyền dân tộc . Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại, ngày
nay, việc sử dụng các vị thuốc y học cổ truyền đã có một số cơ sở khoa học nhất
định .Việc kết hợp giữa y học hiện đại và y học cổ truyền đã , đang và sẽ từng
bước giúp cho việc sử dụng các vị thuốc này ngày một hợp lý và hiệu quả hơn .
Khương hoạt đã được sử dụng từ lâu trong đông y với công năng giải cảm ,
tán phong khử thấp .Theo một số bài thuốc có vị khương hoạt dùng trong đông y,
khương hoạt được dùng theo hai cách chính : dưới dạng nước sắc hoặc tán nhỏ ,
dùng rượu chiêu thuốc . Hiện nay đây là một trong các vị thuốc chúng ta vẫn phải
nhập từ Trung Quốc . Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành
phần hoá học và tác dụng dược lý của vị thuốc này .
Với mong muốn tìm hiểu vị thuốc khương hoạt có trên thị trường Việt Nam
nhằm xác định tên vị thuốc và làm sáng tỏ công dụng của nó, chúng tôi tiến hành
đề tài “Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của

khương hoạt có trên thị trường Việt Nam “ với các mục tiêu sau:
- Sơ bộ định tên loài khương hoạt có trên thị trường Việt Nam hiện nay .
- Định tính một số hợp chất tự nhiên trong vị thuốc . Chiết tách , phân lập và
nhận dạng chất phân lập được .
- Thử sơ bộ một số tác dụng sinh học của nước sắc khương hoạt: tác dụng trên
tim , tác dụng trên huyết áp , tác dụng chống viêm , tác dụng giảm đau và tác
dụng chống loạn nhịp tim .
1
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật
Theo các tài liệu [8,10,12] vị thuốc khương hoạt được chế biến từ rễ và
thân rễ đã phơi khô của hai loài :
- Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang ( khương hoạt)
- Notopterygium forbesii Boiss .( khương hoạt lá rộng )
Họ Hoa tán Apiaceae
Khương hoạt có nguồn gốc chủ yếu từ Tứ Xuyên , Thanh Hải , Cam Túc , Vân
Nam (Trang Quốc ), sinh trưởng tại nơi núi cao , rừng sâu ẩm ướt, màu mỡ , có
được trồng . Theo Đỗ Tất Lợi [7] khương hoạt là một cây sống lâu năm , toàn
cây có mùi thơm đặc biệt, thân rễ to thô , có đốt . Thân cây cao từ 0.5 - 1 m ,
không phân nhánh , thân phía dưới hơi có màu tím . Lá mọc so le , kép lông
chim , phiến lá chia thuỳ , mép có răng cưa tù , mặt trên màu tím nhạt, mặt dưới
màu xanh nhạt, phía dưới cuống lá phát triển thành bẹ ôm lấy thân. Hoa rất nhỏ,
màu trắng , họp thành hình tán kép . Quả bế đôi hình thoi dẹp , màu nâu đen ,
hai mép và ở lưng phát triển thành dìa .
Khương hoạt lá rộng có nguồn gốc từ Tứ Xuyên , Thanh Hải , sinh trưởng
trong bụi cỏ và bụi cây trên sườn núi , hướng ra mặt trời trên núi cao . Lá to ,
kép lông chim 2-3 lần , mép có răng cưa nhọn. Cụm hoa hình tán kép, hoa có
màu vàng nhạt [8].
2

1.2 Đặc điểm vị thuốc
1.2.1 Dược điển Trung Quốc - Tập 1 [12] đã mô tả hình thái vị thuốc :
- Thân rễ của loài Notopterygium incisum : hình trụ hơi cong, dài 3 -1 4 cm,
đường kính 0,6 cm - 2,5 cm . Đoạn đầu còn lưu giữ vết thân, một số ít chia
nhánh . Bề ngoài có màu từ nâu đến nâu hơi đen , phần bị tróc vỏ ngoài có màu
vàng . Đốt ngắn dày đặc nổi lên kết thành vòng như con tằm hoặc các đốt kéo
dài như đốt của cây tre . Chất nhẹ, dễ bẻ, dễ gẫy . vết bẻ không nhẩn , có những
đường n ứ t, phần vỏ màu nâu hơi vàng tới nâu sẫm , có dầu với những điểm dầu
màu nâu . Phần gỗ màu hơi vàng với các tia rõ ràng , phần lõi màu vàng đến
vàng nâu . Mùi thơm , vị hơi đắng và hăng .
- Thân rễ và rễ của loài Notopterygium forbesii : thân rễ gần hình trụ mang vết
thân và phần còn lại của vỏ lá cây . Rễ gần hình nón , có các vết nhăn theo chiều
dọc . Bề ngoài màu nâu với những đốt vòng mau, dài 8cm - 15cm , đường kính
lcm - 3cm . Một số thân rễ mập chắc , có các đốt không đều , phần đầu mang
vết thân , rễ tương đối nhỏ . Chất xốp , dễ bẻ, dễ gãy . vết bẻ hơi nhẩn , vỏ màu
nâu , phần gỗ hơi vàng , mùi thơm .
1.2.2 Theo “ Trang Quốc trung dược tài chân nguỵ kiểm biệt đồ sách” [10]
khương hoạt chính phẩm gồm hai loại:
3
- Khương hoạt: nguyên liệu làm thuốc là
phần thân rễ và rễ đã phơi khô của
khương hoạt Notopterygium incisum
Ting ex .T . Chang họ Hoa tán (Ảnh 1).
Thành phẩm thường chia làm 3 loại :
tàm khương , trúc tiết khương và điều
khương . Đặc điểm của vị thuốc được mô
tả như trong dược điển Trung Quốc [12] Nọtopterygium incisum Ting ex H.T. Chang
ẢNH 1
- Khương hoạt lá rộng : nguyên liệu làm
thuốc là phần thân rễ và rễ khô của khương

hoạt lá rộng Notopterygium forbesii Boiss
(Ảnh 2). Sản phẩm có hình nón dài hoặc
hình trụ tròn , một số hơi cong , dài 4-17 cm
, đường kính 0,5-1,6 cm . Bề mặt màu nâu
đến nâu sẫm , phần đầu thân rễ hơi phình to ,
trên đầu có vết gốc thân và vết cuộng lá nổi gồ lên . ẢNH 2
Phần trên của rễ có vân tròn ngang ,nhỏ , rãnh dọc , nếp nhăn dọc , nổi gồ dạng
cục theo hướng ngang , phần bị tróc vỏ có màu vàng trắng . Chất xốp, dễ gãy ,
mặt gãy hơi phẳng , có vân hình phóng xạ và vết n ứ t, phần vỏ màu nâu vàng nhạt
, phần gỗ màu vàng. Mùi thơm đặc biệt,vị đắng.
1.2.3 Dược điển Việt Nam I tập 2 [6] đã định nghĩa : khương hoạt là thân
rễ và rễ đã phơi khô của cây khương hoạt ( Notopterygium sp. ), họ Hoa tán
(Umbelliferae = Apiaceae) có đặc điểm bên ngoài : hình trụ tròn, sần sùi hoặc
Notopterygium íorbesii Boiss.
4
phân nhánh , dài 3 -1 0 cm , đường kính 0,5 - 1,5 cm , mặt ngoài màu nâu , có
nhiều đốt vòng chi chít lồi lên , trên đốt có nhiều vết sần sùi. Chất nhẹ , xốp , dễ
bẻ gẫy . Mặt bẻ ngang có màu vàng nhạt, có điểm chấm đỏ .
1.3. Thu hái, chế biến
Hai đến ba năm sau khi trồng thì thu hoạch . Thường thu hoạch vào mùa
thu : đào về, rửa sạch đất cát , làm mềm cẩn thận , cắt thành miếng dày , phơi
hoặc sấy khô [10]. Theo “Trung thảo dược học” [8] thân rễ và rễ được chế biến
riêng , thân rễ đốt vòng mau được gọi là “ tàm khương” , đốt thưa gọi là “ trúc
tiết khương “ , rễ gọi là “ điều khương “.Trong đó tàm khương là loại có chất
lượng tốt nhất [9].
1.4 Thành phần hoá học
Những nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy trong khương hoạt có tinh dầu , các
dẫn chất coumarin , dẫn chất acid ferulic , acid amin và một số thành phần khác
1.4.1 Tinh dầu :
Các tài liệu [7,8] đều đề cập đến sự có mặt của tinh dầu trong dược liệu . Các

tác giả Trung Quốc bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ liên hợp đã xác định
được 78 thành phần có trong tinh dầu của loài Notopterygium incisum [21]
1.4.2 Coumarin
Theo tài liệu [18,19,20] trong thân rễ Notopterygium incisum có các chất :
bergapten , bergaptol , bergamottin , isoimperatorin , notopterol , notoptol
nodakenin , demethylfuropinnarin , anhydronotoptol , xanthotoxol , 7-
isopentenyloxy- 6- methoxy- coumarin , 7-(3,7- dimethyl- 2,6- octadienyloxy ) -
6 methoxy coumarin , notoptolide , ethylnotopterol , anhydronotoptoloxide ,
columbianetin . Tài liệu [13] đã nêu phương pháp phân lập notopterol và
isoimperatorin.
5
1.4.3 Acid amin
Đã phân lập được 3 acid amin lần đầu tiên từ loài Notopterygium incisum vào
năm 1994 [18] . Đó là : T- aminobutyric acid , acid aspartic và leucin.
1.4.4 Dân chất acid ferulic
Trong thân rễ của khương hoạt có acid ferulic [18] , phenethyl ferulate và
(-)- bomyl ferulate. Các tác giả Đức đã nêu phương pháp phân lập các dẫn
chất này.
1.4.5 Một số thành phần khác
Một số thành phần khác cũng đã được xác định . Đó là falcarindiol ,
pregnenolone , P- sitosterol, acid oleic , acid linoleic [13,18].
1.5 Tác dụng, công dụng:
Theo quan niệm y học cổ truyền [4] khương hoạt được xếp vào nhóm
thuốc tân ôn giải biểu : vị cay , tính ấm , quy kinh bàng quang , can , thận có tác
dụng tán hàn giải biểu , dùng khi cảm mạo phong hàn , sốt không có mồ hôi ,
đau đầu , toàn thân đau mỏi , có tác dụng trừ thấp chỉ thống để điều trị bệnh
phong thấp . Đặc biệt khương hoạt có tác dụng tốt trong các chứng thấp đau nhức
xương c ố t, thần kinh từ lưng trở lên .
Năm 1993 , các tác giả Nhật Bản [16] đã công bố notopterol là thành
phần có tác dụng giảm đau của N. incisum bằng thử nghiệm gây quặn đau bởi

acid acetic trên chuột . Bằng thử nghiệm trên tính thấm thành mạch các tác giả
cũng đã xác định đây là thành phần có tác dụng chống viêm của khương hoạt .
Tác dụng ức chế hoạt động của aminopyrin N - demethylase trên microsom gan
của notopterol cũng đã được xác nhận [15]
Năm 1997 , các tác giả Đức [13] đã công bố tác dụng giảm đau chống viêm của
khương hoạt bằng các thử nghiệm trên 5- lypoxygenase ( 5- LO ) và
6
cyclooxygenase( c o x ) - là các enzym xúc tác chuyển acid arachidonic thành
leucotrien và prostaglandin , các chất có vai trò quan trọng trong quá trình viêm
và đau . Ba họp chất có tác dụng ức chế rõ rệt 5- LO và c o x là : phenethyl
femlate , falcarindiol và (-)- bomyl ferulate . Bằng cách so sánh mối tương quan
giữa nồng độ các thành phần với tác dụng ức chế 5-LO , c o x các tác giả đã
nhận định phenethyl ferulate là chất quyết định tác dụng ức chế của dịch chiết
trên c o x và falcarindiol là chất quyết định tác dụng ức chế của dịch chiết trên 5-
LO . Đồng thời cũng cho thấy notopterol chỉ có tác dụng ức chế yếu 5-LO và
không có tác dụng trên c o x .
Theo một số tác giả Trung Quốc [17] khương hoạt còn được sử dụng như
một thuốc chống loạn nhịp . Tác dụng ngăn chặn sự hình thành các sản phẩm oxy
hoá của dịch chiết methanol thân rễ khương hoạt cũng đã được các tác giả Nhật
Bản ghi nhận [14].
7
PHẦN 2
NGUYÊN LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1 Nguyên liệu :
Vị thuốc khương hoạt mua tại phố Lãn Ông - Hà N ội, rửa sạch , phơi
khô .
2.2 Súc vật thí nghiệm :
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss có trọng lượng 19-22g do Viện vệ sinh
dịch tễ cung cấp
- Chuột cống trắng trọng lượng 180-200 g ,thỏ có trọng lượng l,8-2kg

ếch có trọng lượng 150 - 200 g, chó có trọng lượng 10 - 13 kg do
phòng Giáo tài trường Đại Học Dược cung cấp .
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu :
2.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học :
Chúng tôi đã sử dụng các phương pháp ghi trong tài liệu [1,2,5]
2.3.1.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu bằng phương
pháp cất kéo hơi nước.
2.3.1.2 Xác định độ ẩm dược liệu trên máy Ưltrax - Germany.
2.3.1.3 Định tính một số nhóm chất tự nhiên trong dược liệu bằng
phương pháp hoá học .
2.3.1.4 Chiết tách , phân lập định tính coumarin trong khương hoạt
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng .
2.3.1.5 Phân lập coumarin bằng sắc ký cộ t. Định tính chất phân lập
được bằng các phản ứng hoá học và phương pháp quang phổ :
8
I
- Phổ tử ngoại được đo trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary 1E
varian ( Australia ) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm - Trường Đại học
Dược .
- Phổ hồng ngoại được đo trên máy FIIR- 8110 M ( Shimaclzu) tại
phòng Vật lý - Viện kiểm nghiệm .
2.3.2 Tác dụng dược lý
Chế phẩm thử là cao lỏng 1:1 của khương hoạt chế theo phương pháp
sắc đông y.
Theo phương pháp ghi trong tài liệu [3, 11] chúng tôi đã tiến hành
thử một số tác dụng sinh học của nước sắc khương hoạt
2.3.2.1 Tác dung trên tim ếch cỏ lâp
Cô lập tim ếch theo phương pháp Straube . Xác định biên độ và tần số hoạt
động tim khi nuôi bằng dung dịch Ringer tim và dung dịch Ringer tim có thêm
chế phẩm nghiên cứu .

2.3.2.2 Tác dung trẽn tim ếch tai chỗ
Xác định nhịp tim ếch khi nhỏ vào xoang tĩnh mạch 1 giọt dung dịch
Ringer tim và dung dịch Ringer tim có thêm chế phẩm nghiên cứu .
2.3.2.3 Tác dung chống viêm cấp
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng . Sau khi cho chuột uống
chế phẩm , gây viêm bằng cách tiêm dưói da gan bàn chân chuột chất gây viêm
là carrageenin 1% . Đo thể tích bàn chân chuột trước và sau khi gây viêm . So
sánh với tác dụng chống viêm của aspirin .
2.3.2.4 Tác dung chống viêm mãn
Gây viêm mãn bằng cách tạo các u hạt theo phương pháp Donot Joulon .
Thí nghiệm tiến hành trên chuột cống trắng . Cấy vào mỗi bên gáy chuột 1 viên
amian đã nhúng carrageenin 1 % . Cho chuột uống thuốc liên tục trong 5 ngày .
Sau đó bóc tách u h ạt. So sánh trọng lượng u hạt giữa nhóm chứng và nhóm thử.
2.3.2.5 Tác dung giảm đau
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng theo hai phương pháp
- Phương pháp mâm nóng : Theo dõi thời gian chuột phản ứng với nhiệt độ
trước và sau khi uống thuốc .
- Phương pháp Koster : Phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic 1 %
Sau khi cho chuột uống thuốc tiêm màng bụng acid acetic 1% . Đếm cơn đau
quặn của chuột. So sánh với nhóm chứng .
2.3.2.6 Tác dung trẽn huyết áp
Ghi huyết áp chó bằng phương pháp đo huyết áp trực tiếp . So sánh hình
ảnh và chỉ số huyết áp trước và sau khi cho uống chế phẩm. Đổng thời so sánh
tác dụng đối kháng của thuốc với adrenalin .
23.2.1 Tác dung chống loan nhip
Thí nghiệm được tiến hành trên thỏ . 1 giờ sau khi cho thỏ uống thuốc gây
loạn nhịp tim cho thỏ bằng cách tiêm tĩnh mạch tai thỏ dung dịch BaCl2 2%.
Theo dõi trên ba chuyển đạo Dj, D2, D3 cho đến khi nhịp tim trở lại bình thường .
Ghi số thời gian loạn nhịp . So sánh thời gian loạn nhịp tim giữa nhóm thử và
nhóm chứng .

10
PHẦN 3
THỰC NGHIỆM - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Sơ bộ định tên khoa học yị thuốc
Vị thuốc khương hoạt được thu mua tại phố Lãn Ông - Hà Nội (Ảnh 3) có
các đặc điểm bên ngoài như sau : hình trụ hơi cong , dài 4 -1 0 cm . Đoạn đầu
còn dấu vết của thân và lá . Một số chia nhánh . Bề mặt màu nâu đen , phần bị
tróc vỏ có màu vàng nâu . Đốt ngắn , dày đặc , nổi gồ, kết thành vòng . Nhẹ ,
giòn ,dễ gãy . Mặt gãy có vân hình hoa cúc và khe hở, phần vỏ màu nâu hơi
vàng với những điểm dầu màu nâu , phẩn lõi màu vàng nâu . Vị thuốc có mùi
thơm đặc biệt.
ẢNH 3 : Vị thuốc khương hoạt trên thị trường Việt nam
Căn cứ vào đặc điểm của vị thuốc đã được mô tả trong các tài liệu [10,12]
chúng tôi sơ bộ xác định : vị thuốc khương hoạt có trên thị trường Việt nam hiện
nay được chế biến từ rễ và thân rễ của cây khương hoạt Notopterygium incisum
Ting ex . T. Chang họ Hoa tán Apiaceae .
3.2 Thành phần hoá học
3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong khương hoạt
Bằng cảm quan thấy khương hoạt có mùi thơm hắc đặc biệt, đổng thời căn
cứ vào các tài liệu đã công bố khương hoạt có tinh dầu , do đó chúng tôi đã tiến
hành định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước [2]
Các bước tiến hành :
■ Cân 20 g dược liệu , thái lát mỏng
■ Cho vào một bình cầu có sẵn 100 ml nước
■ Cất trong 3 giờ kể từ lúc sôi
■ Đọc thể tích tinh dầu và tính kết quả theo công thức :
x% = — . 100 =

—

. 10000
a 2000 - 20 m
Trong đó X : hàm lượng tinh dầu trong dược liệu (%)
V : thể tích tinh dầu (ml)
a : khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)
m : hàm ẩm dược liệu (= 12%)
Kết quả được ghi trong bảng 1
Bảng 1 : Hàm lượng tinh dầu trong khương hoạt
Mâu 1
Mẫu 2
Mâu 3
Lượng dược liệu (g)
20 20
20
Lượng tinh dầu (ml)
0,46
0,44 0,44
Hàm lượng (%)
2,61
2,5
2,5
Hàm lượng trung bình (%)
2,54
12
3.2.2 Định tính một số nhóm chất tự nhiên trong dược liệu bằng các
phản ứng hoá học
3.2.2.1 Đinh tính Phytosterol
Cho vào ống nghiệm to 0,5 g bột dược liệu , thêm 10 ml cloroform ,
ngâm ở nhiệt độ phòng trong 60 phút . Lọc lấy dịch chiết , bay hơi dung môi .
Hoà tan cắn bằng 0,5 ml anhydrit acetic , lắc đều . Đặt nghiêng ống 45° , cho

thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm . Mặt phân cách giữa
hai lớp chất lỏng có màu nâu đỏ ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Phytosterol
3.2.2.2 Đinh tính glycosid tim
Cho 10 g dược liệu vào một bình nón có dung tích 100 ml , thêm 80
ml cồn 25° . Ngâm trong 24 giờ , gạn dịch chiết vào một cốc có mỏ , loại tạp
bằng dung dịch chì acetat 30% . Lọc bỏ tủa . Dịch lọc sau khi bay hơi hết cồn
chọ vào bình gạn , lắc kỹ 3 lần với cloroform , mỗi lần 15 ml . Gạn dịch
cloroform vào một cốc có mỏ . Bay hơi dung m ô i. hoà tan cắn bằng 10 ml dung
dịch cồn 90 0. Dịch cồn làm các phản ứng định tính :
■ Phản ứng Liberman - Bouchardt:
Lấy lml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm sạch , khô , cô cạn trên nồi
cách thuỷ , cắn được hoà tan trong lml anhydrit acetic . Đặt nghiêng ống 45° ,
cho thêm từ từ lml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm, không thấy xuất
hiện màu đỏ nâu ở mặt phân cách ( Phản ứng âm tính )
■ Phản ứng Baliet:
13
Lấy 1 ml dịch chiết cồn , thêm 0.5 ml thuốc thử Baljet ( 1 phần dung
dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch Natri hydroxyd 10%) .Không thấy xuất
hiện màu đỏ cam ( Phản ứng âm tính ).
■ Phản ứng Legal:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn , thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprussiat 1%
và thêm từ từ vài giọt dung dịch Natri hydroxyd 10% ( đảm bảo kiềm dư) .
Không thấy xuất hiện màu đỏ ( Phản ứng âm tính ).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có glycosid tim
3.2.2.3 Đinh tính Alcaloid
Cân 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml . Thêm 50 ml
dung dịch acid sulfuric IN . Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút . Đun cách
thuỷ trong 30 phút . Dịch chiết lọc qua giấy lọc vào một bình gạn. Kiềm hoá
bằng dung dịch Amoniac đặc . Lắc kỹ 3 lần với cloroform , mỗi lần 15 ml . Gạn

lấy lớp cloroform , acid hoá bằng dung dịch acid sulfuric IN . Gạn lấy lóp nước
tiến hành các phản ứng định tính :
■ Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho vào Ống nghiệm 1 ml dịch acid , thêm vài giọt thuốc thử
Dragendorff. Không thấy xuất hiện tủa màu da cam ( Phản ứng âm tính ).
■ Phản ứng vái thuốc thử Mayer :
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch acid, thêm vài giọt thuốc thử Mayer .
Không thấy xuất hiện tủa trắng hơi vàng ( Phản ứng âm tính ).
■ Phản ứng vđi thuốc thử Bouchardat:
Cho vào Ống nghiệm 1 ml dịch acid, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat
Không thấy xuất hiện tủa màu nâu ( Phản ứng âm tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Alcaloid .
14
3.2.2.4 Đinh tính Tanin , dường khử và acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm to 2 g dược liệu , thêm 15 ml nước cất , đun
sôi trực tiếp trên bếp điện 5 phút , lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp . Dịch lọc để
làm các phản ứng định tính :
■ Phản ứng vđi thuốc thử sắt ( III) clorid 5%
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc , thêm vài giọt thuốc thử thấy
xuất hiện màu xanh rêu ( Phản ứng dương tính )
■ Phản ứng vđi thuốc thử gelatin 1 %
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc , thêm vài giọt thuốc thử không
thấy xuất hiện tủa bông trắng ( Phản ứng âm tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Tanin
■ Đinh tính acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm , thêm ít bột natri carbonat thấy
xuất hiện bọt khí ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có acid hữu cơ
■ Đinh tính đường khử tư do
Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm , thêm 2 giọt thuốc thử Fehling A , 2

giọt thuốc thử Fehling B , đun cách thuỷ thấy xuất hiện màu đỏ gạch ( Phản ứiig
dương tính)
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có đường khử tự do
3.2.2.5 Đinh tính Saponin
Cho vào ống nghiệm to 1 g dược liệu , thêm 5 ml cồn 70°, đun cách thuỷ
5 phút, lọc nóng qua giấy lọc . Dịch lọc để làm các phản ứng định tính :
■ Lấy lml dịch lọc cho vào một ống nghiệm , thêm 5 ml nước cất .
Lắc kỹ trong 5 phút, thấy có ít bọt và không bền
15
■ Phản ứng Salkovki
Lấy 1 ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm , thêm 1 ml acid sulfuric
đặc từ từ theo thành ống nghiệm , không thấy xuất hiện một vòng nâu đỏ ồ giữa
hai lớp chất lỏng và dịch chiết ồ phía trên không có màu xanh (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Saponin
3.2.2.6 Đinh tính chất béo và caroten
Cho vào một bình cầu 5 g dược liệu , thêm 20 ml ether dầu hoả , đun
hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp . Bay hơi dung môi .
Cắn thu được dùng làm các phản ứng định tính
* Đinh tính chất béo
Hoà tan cắn bằng 2 ml cloroform , nhỏ hai giọt lên tờ giấy lọc , hơ
nóng nhẹ đến khô thấy có vết dầu mỡ ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có chất béo
■ Đinh tính caroten
Cho vào cắn 2 giọt acid sulfuric đặc , không thấy xuất hiện màu
xanh nâu ( Phản ứng âm tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có caroten
3.2.2.1 Đinh tính acid amin
Cho vào một ống nghiệm to 1 g dược liệu , thêm 5 ml cồn 50° , đun
cách thuỷ trong 5 phút . Lọc qua giấy lọc gấp nếp . Lấy 2 ml dịch lọc cho vào
ống nghiệm , thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 2% trong aceton thấy xuất hiện

màu tím sẫm ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có acid amin
16
3.2.2.8 Đinh tính Coumarin
Cho vào một bình nón 5 g bột dược liệu , thêm 30 ml ethanol 90° ,
lắc đều . Để yên qua đêm , lọc qua giấy lọc . Dịch lọc tiến hành các phản ứng
định tính
■ Phản ứng mở và đổng vòng lacton
Lấy 2 Ống nghiệm , cho vào mỗi ống 1 ml dịch lọc . ống 1 thêm 5 ml
nước c ất, ống 2 thêm vài giọt natri hydroxyd 10% và 5 ml nước c ấ t, thấy dung
dịch ở ống 2 trong hơn ống 1 . Thêm vài giọt dung dịch acid clohydric thấy dung
dịch ở ống 2 vẩn đục ( Phản ứng dương tính )
■ Phản ứng vđi thuốc thử Diazo
Cho vào một ống nghiệm 1 ml dịch lọc , thêm vài giọt natri hydroxyd
10% . Sau đó cho vào ống nghiệm 2 giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ
sẫm ( Phản ứng dương tính )
■ Huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoai tăng lẽn ở mỏi trường kiềm
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên một miếng giấy lọc , nhỏ tiếp lên đó 1 giọt
natri hydroxyd 10 % , sấy nhẹ . Che nửa vết bằng đồng xu rồi soi dưới tia tử
ngoại trong vài phút , bỏ đồng xu ra thấy nửa không che sáng hơn nửa bị che .
Tiếp tục soi thấy nửa bị che sáng dần lên
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có coumarin
3.2.2.9 Đinh tính flavonoid
Cho 2 g dược liệu vào một ống nghiệm to . Thêm 5 ml cồn 90° .
Đun cách thuỷ trong 10 phút, lọc . Dịch lọc thu được tiến hành các phản ứng
■ Phản ứng với kiềm
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc , để khô, hơ lên miệng lọ đựng
amoniac đặc thấy màu vàng có tăng lên .
■ Phản ứng với sắt (III) clorid
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm , thêm vài giọt dung dịch sắt

(III) clorid thấy xuất hiện màu xanh rêu
■ Phản ứng Cyanidin
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm , thêm vài giọt dung dịch acid
hydroclorid đặc và bột Magie kim loại, đun cách thuỷ vài phút không thấy dung
dịch chuyển màu '
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có flavonoid
*Nhận xét và sơ bộ kết luận
Các phản ứng với dung dịch sắt (DI) clorid trong định tính flavonoid và tanin ;
với kiềm trong định tính flavonoid đều dương tính , song chúng tôi vẫn sơ bộ kết
luận không có những hợp chất này trong dược liệu vì những phản ứng đặc trưng
của chúng đều âm tính .
Như vậy qua kết quả của các phản ứng hoá học trên , chúng tôi sơ bộ kết luận
trong mẫu khương hoạt nghiên cứu có Phytosterol, Acid hữu cơ , Chất béo,
Đường khử, Acid amin và Coumarin , trong đó các phản ứng định tính
coumarin là rõ hơn cả , chứng tỏ thành phần hoá học chính trong khương hoạt
ngoài tinh dầu ra còn có coumarin ; không có Glycosid tim, Alcaloid, Tanin,
Saponin, Caroten và Flavonoid .
Kết quả được ghi trong ở bảng 2
Bảng 2 : Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên trong khương hoạt
Hợp chất
Các phản ứng định tính
Kết
quả
Kết luân
Phytosterol
Phản ứng với anhydric acetic và
H?S04 đặc
+ Có
Glycosid tim
Phản ứng Liberman — Bouchardt

-
Không có
Phản ứng Baljet
-
Phản ứng Legal
-
Alcaloid
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
-
Không có
Phản ứng với thuốc thử Mayer
-
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
-
Tanin Phản ứng với thuốc thử FeCl3
5%
++ Không có
Phản ứng với dung dịch gelatin 1 %
-
Acid hữu cơ Phản ứng với Na9CO,
+
Có
Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling
+
Có
Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
-
Không có
Phản ứng Salkovki

-
Chất béo
Vết dầu để lại trên giấy lọc
++
Có
Caroten
Phản ứng với H,S04 đặc
-
Không có
Acid amin
Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin
++ Có
Flavonoid Phản ứng với kiềm
+ Không có
Phản ứng với FeCl3 5%
++
Phản ứng Cyanidin
-
Coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng lacton
+++
Có
Phản ứng với thuốc thử Diazo
+++
Hiện tượng huỳnh quang tăng lên ở
môi trường kiềm
+++
Ký hiệu + : có phản ứng nhưng không rõ
++ : phản ứng lên rõ
+++ : phản ứng lên rất rõ

19
3.2.3 Chiết tách , phân lập định tính coumarin trong khương hoạt
3.2.3.1 Chiết tách và phân lâp coumarin
Lấy khoảng 1 kg dược liệu thái lát mỏng cho vào bình thuỷ tinh ,
thêm dung môi (cồn 90° ) ngập dược liệu, ngâm ở nhiệt độ phòng . Sau 10
ngày rút dịch chiết và lọc qua giấy lọc . Bã dược liệu còn lại thêm cồn 90°
chiết tiếp lần 2 và 3 . Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất
quay thu được dịch chiết đậm đặc , cô cách thuỷ đến dạng cao mềm . Hoà cao
bằng nước nóng trên nồi cách thuỷ sô i, lọc nóng qua giấy lọc vào bình gạn ,
lắc nhiều lần với cloroform cho đến khi lớp cloroform không còn phản ứng
với thuốc thử Diazo . Gộp dịch chiết cloroform, rửa lại bằng nước c ấ t, cất thu
hồi dung môi thu được phần coumarin thô ( Phân đoạn I ). Phần nước còn lại
sau khi đã lắc kỹ với cloroform vẫn cho màu với thuốc thử Diazo và dung dịch
FeCl3, chứng tỏ vẫn còn coumarin hoặc một số hợp chất polyphenol khác tan
trong nước . Chúng tôi đã tiến hành lọc , bốc hơi cách thuỷ đến dạng cao mềm
( Phân đoạn II) để định tính và phân lập tiếp
Quy trình chiết xuất và phân lập coumarin từ dược liệu được tóm tắt trong
sơ đồ 1 :
20
I
Sơ đồ 1 : Sơ đồ chiết xuất coumarin trong khương hoạt
21
3.2.3.2 Đinh tính coumarin trong phân đoan I và n bằng sắc ký lởp mỏng
Hoà tan cao mềm bằng Cloroform ( đối với phân đoạn I ) và ethanol 90°
( đối với phân đoạn I I) để chấm sắc ký .
Chúng tôi sử dụng bản mỏng silicagel G60 F254 tráng sẵn . sắc ký được khai
triển trong 5 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau :
Hệ 1 : cyclohexan- ethyl acetat- methanol ( 6:4:2)
Hệ 2 : cloroform - ethyl acetat (1:1)
Hệ 3 : cloroform -methanol (9:1)

Hệ 4 : hexan- ethyl acetat (3:1)
Hệ 5 : ethyl acetat - methanol - nước ( 70:15:15 )
Sau khi triển khai , các bản sắc ký được để ngoài không khí cho bay hết
dung môi , quan sát các vết trên sắc ký bằng huỳnh quang dưới ánh sáng tử
ngoại ở hai bước sóng X = 254 nm và X = 366 nm, hiện màu bằng thuốc thử
Diazo và hơi iod .
Kết quả cho thấy hệ dung môi cloroform - ethyl acetat (1:1) có khả năng
tách rõ nhất đối với các chất trong phân đoạn I và hệ ethyl acetat - methanol -
nước (70:15:15) đối với các chất trong phân đoạn I I .
Trên sắc ký lóp mỏng :
- Phân đoạn I cho 9 vết chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại , 7 vết
cho màu với thuốc thử Diazo , còn với hơi iod bão hòa có 6 vết chất ( Hình I ,
bảng 3).
- Phân đoạn II có 3 vết chất cho huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại
ở
bước
sóng X = 366 nm và cho màu với thuốc thử Diazo , với hơi iod bão hoà vết số
3 không màu ( Hình n, bảng 4 ).
Với kết quả sắc ký lớp mỏng trên đây , chúng tôi không nghĩ rằng tất cả
các vết chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại đều là coumarin và những
22