SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
GVHD: GS-TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG
SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
1. Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion
2. Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion
4. Một số áp dụng của sắc ký trao đổi ion
3. Sắc ký trao đổi ion sử dụng cột hoặc becher
Tổng quan về sắc ký trao đổi ion.
Sắc ký trao đổi ion là một trong những phương pháp sắc lý dùng để cô lập các hợp chất hữu cơ. Hiện nay,
kỹ thuật này được dùng rộng rãi trong phân tích và cô lập các protein.
Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, yếu tố chính liên quan đến sự lưu giữ và phân tách các chất là sự
tương tác tĩnh điện giữa các hợp chất mang điện tích có trong mẫu với các tâm mang điện tích ngược dấu
của pha tĩnh.
Hình 1. Các giai đoạn trong quá trình trao đổi ion
1. Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion
Nhựa trao đổi ion là những hạt hình cầu, không tan trong nước. Trên bề mặt của chúng có những nhóm chức
mang điện tích; xung quanh các nhóm mang điện tích này luôn có các đối-ion của chúng.
Nếu nhựa trao đổi ion âm gọi là nhụa trao đổi anion.
Nếu nhựa troa đổi ion dương gọi là nhựa trao đổi cation.
Tên nhựa trao đổi ion Tính acid base Nhóm hoạt động Khoảng pH hiệu
quả
Khả năng trao đổi (trên resin
khô)
Nhựa SP Acid mạnh Sulfoxyl (-SO
3
H) 1-14 4 mmol H
+
/g
Nhựa CM Acid yếu Carboxymetyl (-CH
2

-COOH) 5-14 9-10 mmol H
+
/g
Nhựa QAE (quaternary
amino etyl)
Base mạnh (2-hydroxypropyl)-dietyletylamonium(-CH
2
-CH
2
-
N
+
R’R
2
)
1-15 4 mmol OH
-
/g
Nhựa DEAE Base yếu Dietylaminoetyl 1-9 4 mmol OH
-
/g
Bảng 2. Một số đặc trưng của nhựa trao đổi ion
+ Nhựa trao đổi ion tính base mạnh sẽ hấp thu-bắt giữ tất cả các hợp chất có tính acid; nhựa trao đổi ion tính base
yếu chỉ hấp thu-bắt giữ hợp chất có tính acid mạnh.
+ Đối với nhựa trao đổi ion tính acid mạnh sẽ hấp thu-bắt giữ tất cả các hợp chất có tính base; nhựa trao đổi ion tính
acid yếu chỉ hấp thu-bắt giữ hợp chất có tính base mạnh.
1. Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion
1.1. Lý thuyết về sự trao đổi ion.
R: pha tĩnh (resin)
G: nhóm chức mang điện tích cố định trên pha tĩnh; còn gọi là nhóm chức hoạt động của nhựa

C: đối ion của G
S: chất hữu cơ mang điện tích trái dấu với G
1.1. Lý thuyết về sự trao đổi ion.
- Điện tích của các hợp chất hữu cơ có thể điều chỉnh bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch:
+ pH > pKa: các acid hữu cơ mang điện tích âm (RCOO
-
).
+ pH < pKa: các amin mang điện tích dương (RNH
4
+
).
1.1. Lý thuyết về sự trao đổi ion.
So sánh ái lực của một số ion (anion, cation) đấi với chất trao đổi:
1.1. Lý thuyết về sự trao đổi ion.
-
Mỗi loại nhựa trao đổi ion đều được nhà sản xuất xác định khả năng trao đổi ion của nó.
VD: một loại nhựa có khả năng trao đổi 3 mili đượng lương cho mỗi gam (3meq/g), có nghĩa là về mặt lý
thuyết 1 gam nhựa này có khả năng bắt giữ 3 milimol phan tử mang đơn điện tích hoặc 1 milimol phân tử
mang ba điện tích.

1.2. Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.
- Các nguyên liệu được chọn phải đáp ứng một số điều kiện sau: hạt nhựa có độ bền cơ học; dung môi có
thể chảy qua với vận tốc thích hợp.
- Nhựa trao đổi ion có thể có hoặc không có lỗ rỗng.
- Có 3 loại nguyên liệu chính: nhựa polystyren; polymercarbohydrat và silica gel.
1.2. Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.
1.2.1. Nhựa polysytren.
- Nguyên liệu chính thường là polystyren, metacrylat có tính kỵ nước và mang nhiều nhóm chức.
+ Ưu điểm:
- Hạt nhựa rắn chắc, có độ bền cơ học.

- Nhựa polystyren chịu được pH : 1-14.
- Nhựa Metacrylat chịu được pH: 2-10.
+ Nhược điểm:
- Nhựa có độ tạo mạng ngang cao có thời gian cân bằng chậm.
- Có thể xảy ra sự tương tác giữa chất tan cần tách và chất nền của pha tĩnh; khiến cho sau quá trình
sắc ký không đuổi hết các chất cần tách ra khỏi cột nhựa, gây khó khăn chó quá trình tái tạo nhựa.
+ Phương pháp tổng hợp để có các nhóm chức hoạt động của nhựa trao đổi ion
Nhựa loại acid mạnh
Nhựa loại acid yếu
Nhựa loại base mạnh
Nhựa loại base yếu
1.2. Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.
1.2.1. Nhựa polysytren.
1.2.2. Silica gel
Gần đây có loại silica gel chế hóa bằng cách cho các nhóm chức silanol tác dụng với các hợp chất khác để
tạo thành loại chất hấp thu mới với các đặc tính vật lý mới, được gọi là silica gel tạo nối
+ Ưu điểm:
- Hạt silica gel không trương nở trong dung môi.
- Hạt có kích cỡ nhỏ (5-50µm) nên thời gian cân bằng nhanh.
- Chịu được pH cao (trong khoảng thời gian ngắn).
+ Nhược điểm:
- Cần pH ổn định; khoảng pH: 2-7.5.
1.2. Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.
1.2.1. Nhựa polysytren.
1.2.2. Silica gel.
1.2.3. Polymer carbohydrat.
Gồm nhựa Sepharose (agarose tạo mạng ngang) và cellulose; nhưng thông dụng nhất là nhựa Sephadex, là
loại dextran nối mạng ngang.
+ Ưu điểm:

- Do tính ái nước nên ít xảy ra tương tác giữa chất tan và mạng ngang của pha tĩnh.
- Hạt nhựa dễ trương nở trong nước nên dễ nạp cột và tốc độ dung môi giải ly tốt.
+ Nhược điểm:
- Không bền trong dung dịch có pH thấp, nhiệt độ cao, những sản phẩm có tính oxi hóa.
2. Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion.
2.1. Chọn loại nhựa trao đổi ion phù hợp.
2.1.1. Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy thuộc vào độ bền của chất khảo sát.
- Những hợp chất dễ hư hỏng cần thực hiện với nhựa trao đổi ion yếu: DEAE hoặc CM.

2.1.2. Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy theo tính acid/base mạnh hay yếu của chất khảo sát.
- Nhựa trao đổi anion mạnh QAE được sử dụng để sắc ký với hợp chất có tính acid yếu, cần pH nhỏ để
biến hợp chất khảo sát về dạng ion.
- Nhựa trao đổi cation mạnh SP được sử dụng để sắc ký với hợp chất có tính base yếu, cần pH lớn để biến
hợp chất khảo sát về dạng ion.
2.1.3. Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy thuộc vào điện tích toàn phần của hợp chất khảo sát.
Điện tích toàn
phần
Điểm đẳng điện
pH protein gắn vào nhựa trao đổi
anion
pH protein gắn vào nhựa trao đổi
cation
Vùng bền của protein
- Nếu protein không bị hư hỏng ở giá trị pH > pI, có thể sử dụng nhựa DEAE hoặc QAE.
- Nếu protein không bị hư hỏng ở giá trị pH < pI, có thể sử dụng nhựa CM hoặc SP.
2.1.4. Cách thực hiện
- Lấy 50mg nhựa vào mỗi ống nghiệm và cân bằng với loại dung dịch đệm thích hợp.
- Cho vào mối ống 1 lượng nhất định của dung dịch cần khảo sát. Khuấy đều, để yên cho nhựa lắng xuống, hút lấy phần
dung dịch nổi lên trên.
- Đo mức hấp thu quang của dung dịch nổi ở trên.

- Đo mức hấp thu quang của dung dịch mẫu E.
So sánh mức hấp thu quang sẽ chọn được loại nhựa trao đổi ion cần dùng.
A B C
D
E
DEAE; pH 8
QAE; pH 8
CM; pH 5
SP; pH 5
Dung dịch chuẩn
5. Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion.
5.1. Chọn loại nhựa trao đổi ion phù hợp.
2.2. Chọn số lượng nhựa trao đổi ion phù hợp số lượng chất khảo sát.
- Cân bằng nhựa trong dung dịch đệm.
- Cho vào mỗi ống một lượng biết trước dung dịch cần khảo sát; khuấy nhẹ, hút lấy phần dung dịch ở trên .
- Đo mức hấp thu quang của dung dịch vừa hút.
- Đo mức hấp thu quang của dung dịch mẫu.
So sánh mức hấp thu quang của các dung dịch để tính toán lượng nhựa cần dùng.
Chú ý: để đảm bảo kết quả thí nghiệm, không nên sử dụng vượt quá 10-20% khả năng của nhựa.
50 mg nhựa CM-25
25 mg nhựa CM-50
Dung dịch mẫu, 1mg/ml
A1
A2
A3 A4
B1 B2 B3
B4
2.3. CHỌN LOẠI DUNG DỊCH ĐỆM

Nguyên tắc:

Dung dịch đệm cation sử dụng cho nhựa trao đổi cation, dung dịch đệm anion sử dụng cho nhựa
trao đổi anion. Thí dụ: dung dịch đệm anion CH
3
COO
-
NH
4
+
sử dụng cho nhựa trao đổi cation –
COO
-
.
Nên sử dụng dung dịch đệm ở 0.1M.
Đôi khi có thể thêm vào dung dịch đệm một số hợp chất: alcol, dimetylformamid, 7M urea, triton
X-100… để giúp cho dung dịch đệm hòa tan tốt hơn.
•
Lựa chọn pH:

Dung dịch đệm phải có pH lớn hơn một đơn vị so với điểm đẳng điện của nhựa trao đổi anion và pH nhỏ
hơn một đơn vị so với điểm đẳng điện của nhựa trao đổi cation.

Các hợp chất bắt đầu tách rời khỏi nhựa ở khoảng 0.5 đơn vị pH so với điểm đẳng điện của nhựa trao đổi.