Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở đồng bằng sông cửu long (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ



NGUYỄN THỊ HẠNH CHI




XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA
ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC)
GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã ngành: 62 42 01 07
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC





2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ HẠNH CHI




XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA
ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC)
GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã ngành: 62 42 01 07
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Hà Thanh Toàn
PGS.TS. Lý Thị Liên Khai


2015
Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ




Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Thanh Toàn
PGS.TS. Lý Thị Liên Khai

Phản biện 1:……………………………………………………
Phản biện 2:……………………………………………………
Phản biện 3:……………………………………………………




Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường
Họp tại………………………………………………………
Vào……giờ…… , ngày……tháng…… năm……….




Có thể tìm luận án tại:
1. Thư viện Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Cần Thơ

2. Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ

3. Thư viện Quốc gia

1

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN
1.1 Giới thiệu
Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là một trong những nguyên

nhân phổ biến gây bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và sau cai sữa, do 2
yếu tố độc lực chính là kháng nguyên bám dính và độc tố ruột (Nagy and
Fekete, 1999, Gyles and Fairbrother, 2010). Phần lớn những nghiên cứu về
E. coli ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ dừng ở việc thực
hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên O và kháng
nguyên F, hoặc một số loại độc tố. Trong khi các nghiên cứu trong và ngoài
nước trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây
bệnh nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo từng vùng địa lý, thời
gian lấy mẫu và trên những đàn khác nhau. Bên cạnh đó, người chăn nuôi
sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi đã tạo nên
những chủng đa kháng với kháng sinh. Những chủng này không những gây
ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng, mà còn ảnh hưởng đến quá
trình điều trị bệnh sau này. Vì vậy, nghiên cứu này giúp phát hiện các
chủng ETEC gây bệnh trên heo con, sự đề kháng và khả năng mang gene
kháng kháng sinh của chúng, nhằm bảo vệ vật nuôi, nâng cao năng suất và
chất lượng thịt theo yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về súc sản
phẩm như là thịt sạch, an toàn và chất lượng để bảo vệ sức khỏe cho con
người.
Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu “Xác định một số yếu tố
độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo
con ở Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành.
1.2 Mục tiêu
Xác định sự phân bố của các yếu tố độc lực, đặc tính kháng kháng
sinh của các chủng ETEC phân lập từ heo con ở một số tỉnh/thành thuộc
ĐBSCL; phân tích một số đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các
chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18.
1.3 Ý nghĩa của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu một cách có hệ thống về một số
gene độc lực của các chủng ETEC từ heo khỏe, heo tiêu chảy, môi trường
chăn nuôi, đánh giá sự phân bố của các gene mã hóa độc lực theo địa

phương, theo nhóm tuổi của heo con.
Kết quả đề kháng và nhạy cảm với kháng sinh của các chủng ETEC
để giúp cán bộ thú y chọn những loại kháng sinh điều trị có hiệu lực cao
cho từng địa phương.
2

Kết quả nghiên cứu này là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp
theo về các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 và F18 để chọn những
chủng ETEC mang kháng nguyên thích hợp cho việc sản xuất vaccine
phòng bệnh do ETEC gây ra ở heo con tại khu vực ĐBSCL, đồng thời có
giá trị góp phần bổ sung kiến thức thực tế, tư liệu khoa học dùng cho
nghiên cứu và giảng dạy môn Vi sinh vật học Thú y, Bệnh truyền nhiễm,
Miễn dịch học trong các trường Đại học Nông nghiệp.
1.4 Những điểm mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định
chính xác sự hiện diện của các gene mã hóa kháng nguyên bám dính (F4,
F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I), độc tố ruột (LT, STa, STb, EAST1) và gene
mã hóa khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu
chảy heo con theo mẹ và heo sau cai sữa ở khu vực ĐBSCL. Vì vậy, kết
quả nghiên cứu này làm cơ sở để xác định vai trò của ETEC gây tiêu chảy
ở heo con và hiệu quả phòng chống bệnh tại khu vực này.
Kết quả của luận án cung cấp thông tin khoa học về sự phân bố
những gene liên quan đến các độc lực và đề kháng kháng sinh của các
chủng ETEC phân lập từ các trại chăn nuôi heo ở khu vực ĐBSCL.
Phân tích mức độ tương đồng gene faeG, fedA và quan hệ di truyền
của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo ở ĐBSCL.
Bố cục của luận án
Luận án gồm 147 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần
như sau: Chương 1: Tổng quan về luận án (3 trang); Chương 2: Tổng quan
tài liệu (32 trang); Chương 3: Nội dung và và phương pháp nghiên cứu (20

trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (76 trang); Chương 5: Kết luận và
đề xuất (2 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang). Luận án có 40 bảng, 45
hình. Tổng tài liệu tham khảo là 182, gồm 25 tài liệu tiếng Việt, 153 tài liệu
tiếng Anh và 4 tài liệu tham khảo từ trang Web.

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli được Theodore Escherich - người Đức mô tả lần
đầu tiên vào năm 1885 và sau đó được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu
chảy ở người và động vật (Levine, 1987). Đây là vi khuẩn thường trú trong
đường tiêu hóa của động vật và người. Vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh
cho gia súc mọi lứa tuổi, đặc biệt là gia súc sơ sinh (Hirsh, 2004).
2.1.1 Đặc điểm hình thái
3

E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình
que nhỏ, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường
kính khoảng 1 µm. Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông
quanh cơ thể. Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát triển hoàn toàn sau 1
ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có nhiều dạng khác nhau từ nhẵn, nhăn nheo có
bìa tròn, hoặc nhăn nheo hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung
huyết (Fairbrother and Gyles, 2006).
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
E. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ
thích hợp cho chúng phát triển là 37
o
C, pH thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc
dễ dàng trong MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB), có khả
năng sản sinh dung huyết α và β (Quinn et al., 2004).
2.1.3 Đặc tính sinh hóa

Kết quả kiểm tra Indole và Methyl Red (MR) của E. coli là dương tính,
nhưng Voges Proskauer (VP) và Citrate thì âm tính, hoàn nguyên nitrate thành
nitrite, không sử dụng ure. Trên môi trường Kligler Iron Agar (KIA): E. coli
lên men đường glucose và lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều
chuyển sang màu vàng, làm nứt thạch; ngoài ra không sinh H
2
S, (Quinn et al.,
2004).
2.2 Phân loại vi khuẩn E. coli gây bệnh
Vi khuẩn E. coli thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae,
giống Escherichia (Hirsh, 2004). E. coli gây bệnh được chia hai nhóm: E.
coli gây bệnh đường ruột và E. coli gây bệnh ngoài đường ruột. Trước đây,
E. coli gây bệnh đường ruột được chia thành 6 phân nhóm dựa trên khả
năng gây bệnh của chúng: Enteropathogenic E. coli (EPEC),
enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC),
enteroaggregative E. coli (EAEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC) và
diffusely adherent E. coli (DAEC) (Kaper et al., 2004). Gần đây, đã xuất
hiện thêm hai phân nhóm mới, đó là adherent invasive E. coli (AIEC) được
cho là có liên quan với bệnh Crohn, nhưng không gây ra tiêu chảy và shiga
toxin (Stx) producing enteroaggregative E. coli (STEC) gây ổ dịch E. coli ở
Đức vào năm 2011 (Clements et al., 2012).
2.3 Giới thiệu về ETEC ở heo
ETEC xâm nhập vào động vật bằng đường tiêu hóa, và khi hiện diện
đủ số lượng, bám vào các thụ thể trên biểu mô ruột non hoặc trong lớp biểu
mô phủ chất nhầy, sau đó phát triển nhanh chóng để đạt được số lượng lớn
khoảng 10
9
vi khuẩn/ gram trong đoạn giữa không tràng đến hồi tràng.
ETEC bám chặt với các biểu mô sản xuất độc tố ruột, kích thích sự bài xuất
4

quá mức nước và chất điện giải vào trong lòng ruột. Kết quả dẫn đến tiêu chảy
nếu các chất lỏng dư thừa từ ruột non xuống không được hấp thụ lại trong ruột
già. ETEC là nguyên nhân tiêu chảy nghiêm trọng, có thể dẫn đến mất nước,
mệt mỏi, chuyển hóa nhiễm acid, và có thể gây chết (Gyles and Fairbrother,
2010).
2.4 Các yếu tố độc lực của ETEC
Những nghiên cứu gần đây cho rằng các yếu tố bám dính do ETEC
sinh ra ở heo là K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F41 và F18. Ngoài ra các
nhà khoa học còn phát hiện thêm một loại bám dính khác (AIDA-I) trong
các chủng ETEC hoặc VTEC có mang kháng nguyên bám dính F18 (Mainil
et al., 2002, Ngeleka et al., 2003). Sau khi bám vào các thụ thể trên tế bào
biểu mô ruột, các chủng ETEC sản xuất độc tố đường ruột, có thể là độc tố
chịu nhiệt (STa, STb hoặc EAST1) hoặc độc tố kém chịu nhiệt (LT). (Gyles
and Fairbrother, 2010).
Những chủng ETEC dương tính với F4 là chủng phổ biến nhất ở heo
con theo mẹ bị tiêu chảy, chúng sản xuất độc tố ruột LT và STb, những
chủng dương tính với F5, F6 hoặc F41 sản xuất chủ yếu STa, và một vài
chủng sản sinh STb, những chủng này gây bệnh tiêu chảy chủ yếu trên heo
từ 0 - 6 ngày tuổi, ở heo lớn hơn chiếm tỷ lệ thấp (Fairbrother and Gyles,
2006). Ngoài ra các chủng ETEC phân lập từ heo sơ sinh hoặc cai sữa bị
tiêu chảy có chứa độc tố STb hay STb: EAST1 cũng có thể dương tính với
AIDA-I (Ngeleka et al., 2003). Kháng nguyên bám dính F4 và F18 chiếm
tỷ lệ cao nhất và đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở
heo con (Frydendahl, 2002; Zhang et al., 2007).
2.5 Tính kháng kháng sinh
E. coli có khả năng kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh, đặc
biệt đối với các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn
nuôi và điều trị bệnh gia súc (Ahmed et al., 2009). Gần đây, những chủng
E. coli có tính đa kháng với nhiều loại kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt

với những kháng sinh thường sử dụng hiện nay thuộc họ β-lactam,
cephalosporin và các quinolones thế hệ mới (Văn Bích và ctv., 2009).
Sự kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu là do gene nằm trên plasmid
qui định. Nhờ các gene kháng thuốc này mà vi khuẩn có khả năng chống lại
tác dụng của kháng sinh. Sự đề kháng rất bền vững và được truyền sang thế
hệ sau qua quá trình di truyền (Kenneth, 2012).
2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ETEC
gây bệnh tiêu chảy trên heo con
5

Các nghiên cứu trong nước như Cù Hữu Phú và ctv. (2003), Hồ Soái
và Đinh Thị Bích Lân (2005), Trương Quang (2005), Trịnh Quang Tuyên
(2006), Đỗ Ngọc Thúy và ctv. (2008) Võ Thành Thìn (2012) và ngoài nước
như Frydendahl (2002), Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003), Wang et al.
(2006), Zhang et al. (2007), Lee et al. (2008) và Chae et al. (2012) trong
thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh đường
ruột nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo thời gian và vùng địa
lý. Sự thay đổi này có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của các biện pháp
phòng chống bệnh cho đàn heo ở các vùng địa lý-kinh tế khác nhau. Riêng
ở khu vực ĐBSCL, E. coli được xác định là một trong số các nguyên nhân
gây bệnh tiêu chảy thường xảy ra trên heo con theo mẹ và sau cai sữa (Lý
Thị Liên Khai, 2001). Chỉ có 3 nghiên cứu chuyên sâu về E. coli gây bệnh
trên heo con ở ĐBSCL của Nguyễn Khả Ngự và Lê Văn Tạo (1996); Lý
Thị Liên Khai (2001), Bùi Trung Trực và ctv. (2004) là rất ít ỏi so với các
khu vực chăn nuôi heo khác ở trong nước.

Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe,
heo tiêu chảy và môi trường

Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo khỏe, heo tiêu
chảy và môi trường.
Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên
phiến kính.
3.1.2 Xác định các yếu tố độc lực của ETEC
Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4, F5,
F6, F18, Intimin và AIDA-I.
Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa độc tố STa, STb, LT và EAST1.
Thí nghiệm trên động vật thí nghiệm trên chuột và trên heo sau cai sữa.
3.1.3 Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của ETEC
Xác định sự kháng kháng sinh của ETEC
Xác định gene kháng kháng sinh
3.1.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của một số
chủng ETEC
Phân tích trình tự nucleotide gene faeG và fedA mã hóa tiểu phân tử
FaeG, FedA của kháng nguyên bám dính F4 và F18
Xác định quan hệ di truyền của các chủng F4 và F18 của ETEC
6

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm lấy mẫu: các nông hộ/ trang trại ở 6 tỉnh/ thành thuộc
ĐBSCL (An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long và Thành
phố Cần Thơ).
Phòng thí nghiệm: (1) phòng thí nghiệm Vi khuẩn học, Bộ môn Thú
y, Đại học Nông nghiệp và Kỹ thuật Tokyo, Nhật Bản; (2) Phòng thí
nghiệm Vệ sinh Thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh
học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; (3) Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ; (4)
Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
Thời gian nghiên cứu: 12/2011 – 7/2014

3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe,
heo con tiêu chảy và môi trường
3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Từ tháng 11/2011 đến 12/ 2013, mẫu
phân được thu thập từ heo theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh tiêu chảy, mẫu
phân heo khỏe và mẫu môi trường.
3.3.1.2 Phương pháp
a) Điều tra về hiện trạng nuôi và tình hình bệnh trên heo con
Các nội dung cần thu thập khi điều tra được ghi nhận theo phiếu điều tra.
b) Lấy mẫu
Tổng số mẫu phân thu thập là 2.011, trong đó có 1.272 mẫu từ heo
tiêu chảy, 199 mẫu heo khỏe và 540 mẫu môi trường.
Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng xoay nhẹ hướng về biểu mô
niêm mạc trực tràng heo bị tiêu chảy nghi do E. coli, cho tăm bông có mẫu
phân vào lọ vô trùng có chứa môi trường vận chuyển là cary-blair, bảo
quản lạnh vận chuyển về phòng thí nghiệm. Số mẫu từ phân tiêu chảy được
tiến hành lấy 2-3 mẫu/ đàn và mỗi trại lấy 3-5 đàn. Riêng mẫu phân heo
khỏe chỉ lấy 1 mẫu đại diện/ trại.
Mẫu môi trường
Mẫu nước uống: ở mỗi trại/ hộ dân có heo con tiêu chảy, rửa sạch
núm uống và bỏ những giọt nước đầu tiên đi, dùng bọc nilon vô trùng lấy
1.000 ml, bảo quản lạnh 4-8
o
C đem về phòng thí nghiệm phân lập trong
ngày.
Mẫu nền ổ úm/ sàn chuồng: dùng tăm bông vô trùng quét nhẹ lên nền
chuồng, chổ khô ráo, không dính phân, cho tăm bông vào môi trường
chuyên chở, bảo quản lạnh.
7

c) Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn E. coli
Nuôi cấy và phân lập E. coli dựa theo quy trình của Barrow and
Feltham (2003). Đặc tính sinh hóa của E. coli trên môi trường KIA và các
xét nghiệm IMViC (Quin et al., 2004; Gyles and Fairbrother, 2010).
d) Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng huyết thanh học
Chọn 1.141 chủng phân lập được từ 1.141 mẫu phân heo tiêu chảy;
197 chủng từ phân heo khỏe và 220 chủng từ môi trường.
Phản ứng ngưng kết tìm chủng F4 (K88), F5 (K99) và F6 (987P)
theo Moon et al. (1976) và Moon et al. (1977).
3.3.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của ETEC
3.3.2.1 Xác định các gene mã hóa một số kháng nguyên bám dính
(F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I) và độc tố ruột (STa, STb, LT, EAST1)
của vi khuẩn ETEC
390 chủng ETEC dương tính với phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến
kính được chọn để tiến hành phản ứng PCR, gồm có 330 chủng từ phân heo con
tiêu chảy, 14 chủng từ heo khỏe và 46 chủng từ môi trường được thu thập từ 6
tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL.
Ly trích DNA mẫu bằng phương pháp đun sôi (Costa et al., 2010). Gene
mã hóa cho các loại kháng nguyên bám dính và độc tố của vi khuẩn ETEC
được xác định bằng phản ứng PCR. PCR phát hiện gene faeG, fanA, fasA,
fedA, eaeA, aidA-I mã hóa kháng nguyên bám dính lần lượt là F4, F5, F6, F18,
Intimin và AIDA-I; các độc tố LT, STa, STb và EAST1 được mã hóa bởi các
gene elt, estA, estB và astA. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các yếu tố
bám dính và độc tố của ETEC dựa theo Boerlin et al. (2005), Ojeniyi et al.
(1994), Frank et al. (1998); Fagan et al. (1999) và Vu-Khac et al. (2007). Tổng
thể tích các thành phần trong phản ứng PCR là 25 µl, các hóa chất được sử
dụng do công ty Promega (Mỹ) sản xuất.
3.3.2.2 Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm
a) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC trên chuột bạch theo
phương pháp của Picard et al. (1999).

b) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền cho heo
Sử dụng những chủng F4 và F18 gây bệnh trên chuột để kiểm tra độc
lực trên heo sau cai sữa, những heo này được kiểm tra không mang kháng
thể kháng F4 và F18 bằng phương pháp ELISA gián tiếp theo Verdonck et
al. (2002). Tiêm truyền và theo dõi heo thí nghiệm được thực hiện theo
phương pháp của Verdonck et al. (2002)
3.3.3 Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC
8


3.3.3.1 Xác định khả năng kháng kháng sinh của ETEC
Khả năng nhạy cảm và kháng kháng sinh của 215 chủng vi khuẩn
ETEC được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch như mô
tả của Bauer et al. (1966). Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn của
Clinical and Laboratory Standards Institude (CLSI, 2012).
3.3.3.2 Phát hiện sự hiện diện các gene kháng thuốc của các
chủng ETEC bằng phương pháp PCR
Quy trình ly trích DNA mẫu, bộ Kit sử dụng trong phản ứng PCR và
phân tích sản phẩm PCR được thực hiện như mô tả ở mục 3.3.2.1. Đoạn
mồi dựa theo Maynard et al., 2003; Boerlin et al., 2005; Robicsek et al.,
2006; Amed et al., 2007
b
và

Võ Thành Thìn, 2012. Những chủng ETEC đề
kháng với các kháng sinh nhóm β. lactam được xác định qua phát hiện các
gene bla
TEM
,

bla
SHV
,

bla
CMY
;

nhóm aminoglycosid là gene aph(3′)-Ia
(aphA1), aph(3′)-IIa (aphA2), aac(3)-IV và aadA; nhóm tetracycline là
gene tetA, tetB và, tetC; nhóm phenicol là gene floR; nhóm sulfonamides là
gene sulII; nhóm trimethoprim dhfrV; nhóm quinolones là gene qnrA, qnrB
và qnrS.
3.3.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC
Sử dụng phương pháp BLAST N để tìm sự tương đồng giữa các
trình tự 16S rRNA của các chủng vi khuẩn phân lập được với trình tự 16S
rRNA đã được đăng tải trên GenBank. Tất cả các trình tự 16S rRNA của
các dòng vi khuẩn phân lập cũng như các trình tự 16S rRNA tham khảo từ
GenBank sẽ được so sánh cặp với nhau (multi-aligned) bằng CLUSTALW
1.6. Cây phát sinh loài (No Bootstrap NJ tree) được xây dựng dựa trên
khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA5 (Molecular
Evolutionary Gentics Analysis, Tamura et al., 2011).
3.4. Thống kê và xử lý số liệu
Các số liệu thu thập sẽ được nhập và xử lý bằng phần mềm Excel.
Xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0 và phần mềm Microsoft
office Excel 2003.

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli
4.1.1 Phân lập

4.1.1.1 Phân lập vi khuẩn E. coli
9

Ở mỗi mẫu khảo sát được nuôi cấy trên môi trường MC và EMB,
tiến hành chọn 3-10 khuẩn lạc E. coli đặc trưng
Bảng 4.1: Số khuẩn lạc E. coli phân lập được trong phân và môi trường
Địa
điểm
Phân heo tiêu chảy Phân heo khỏe Môi trường Tổng
SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL
AG 215 1.030 32 168 82 189 329 1.387
BT 216 1.048 34 171 80 141 330 1.360
CT 211 1.033 29 129 85 184 325 1.346
ĐT 215 1.045 49 243 126 234 390 1.522
ST 203 1.003 23 110 87 140 313 1.253
VL 212 1.036 32 160 80 83 324 1.279
Tổng 1.272 6.195 199 981 540 971 2.011 8.147
SMKS: số mẫu khảo sát; SKLPL: số khuẩn lạc E. coli phân lập được; AG: An Giang; BT: Bến Tre; CT:
Cần Thơ; ĐT: Đồng Tháp; ST: Sóc Trăng; VL: Vĩnh Long
8.147 khuẩn lạc E. coli được phân lập từ 2.011 mẫu phân heo tiêu
chảy, heo khỏe và môi trường chăn nuôi tại 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL.
Kết quả tương tự kết quả nghiên cứu trước đây như Zinnah et al.
(2007), tất cả khuẩn lạc đều có màu hồng tươi trên môi trường MC và màu
tím ánh kim trên môi trường EMB. Trong nghiên cứu này, phần lớn các
khuẩn lạc E. coli hơi bóng, không có nhày, chỉ có tỷ lệ rất thấp khuẩn lạc E.
coli có độ nhày (bóng), kết quả này phù hợp với nhận định của Quinn et al.
(2004).
Đường kính của các khuẩn lạc E. coli phân lập được đều dao động
trong khoảng 1-2 mm. Hầu hết các khuẩn lạc E. coli có dạng bìa nguyên
(89,74%), có rất ít khuẩn lạc có dạng bìa răng cưa. Trên môi trường MC,

khuẩn lạc vi khuẩn hơi lồi chiếm tỷ lệ cao và khuẩn lạc hơi dẹt chiếm tỷ lệ
rất thấp. Bên cạnh đó, tất cả những khuẩn lạc này mọc trên môi trường
EMB đều hơi dẹt. Những đặc điểm này rất giống với mô tả của Quinn et al.
(2004).
Tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều có khả năng lên men đường
lactose và đường glucose trên môi trường KIA, không sinh H
2
S; dương tính
khi kiểm tra indole và methyl red; âm tính với voges proskauer và citrate.
Như vậy, 8.147 chủng vi khuẩn kiểm tra này đều là vi khuẩn E. coli. Tương
tự kết quả nghiên cứu của Zinnah et al. (2007), tất cả các vi khuẩn E. coli
bắt màu hồng khi nhuộm với Safranin, vì vậy chúng đều là vi khuẩn Gram
âm. 100% các chủng vi khuẩn ETEC có hình que ngắn đứng riêng lẻ, có rất
ít vi khuẩn đứng từng cặp, có kích thước của E. coli là 1,1-1,5 µm x 2-6
µm. 100% các chủng vi khuẩn này đều có khả năng di động
.
4.1.1.2 Tỷ lệ vi khuẩn E. coli từ phân và môi trường
10

Bảng 4.2: Tỷ lệ phân lập E. coli trong phân và môi trường
Địa điểm
Heo con tiêu chảy Heo khỏe Môi trường
SMPL

SMDT Tỷ lệ (%) SMPL

SMDT

Tỷ lệ (%) SMPL

SMDT Tỷ lệ (%)
An Giang 215

210

97,67

32

31

96,88

82

43

52,44

Bến Tre 216

216

100,00

34

34

100,00

80

34

42,50

Cần Thơ 211

211

100,00

29

29

100,00

85

46

54,12

Đồng Tháp 215

215

100,00

49

49

100,00

126

52

41,27

Sóc Trăng 203

201

99,01

23

22

95,65

87

28

32,18

Vĩnh Long 212

212

100,00

32

32

100,00

80

17

21,25

p<0,001

Tổng 1.272

1.265

99,45
a

199

197

98,99
a

540

220

40,74
b

SMPL: Số mẫu phân lập; SMDT: Số mẫu dương tính. Các giá trị trong cùng 1 hàng với những chữ số
mũ khác nhau thì khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (p<0,001)
Bảng 4.2 cho thấy không có sự khác biệt giữa tỷ lệ phân lập vi khuẩn
E. coli trong mẫu phân heo con mắc bệnh tiêu chảy (99,45%) và mẫu phân
heo khỏe (98,99%) (p>0,05). Như vậy, E. coli hiện diện ở hầu hết các mẫu
phân heo tiêu chảy và heo khỏe ở 6 tỉnh/ thành. Kết quả này đúng như các
tài liệu công bố trước đây cho rằng E. coli là loài vi khuẩn thường trú trong
đường tiêu hóa của người và động vật, chúng là loài vi khuẩn phổ biến
nhất, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí trong ruột động vật khỏe.
Tỷ lệ nhiễm E. coli trong mẫu môi trường là 40,74%, tỷ lệ này thấp
hơn so với tỷ lệ phân lập từ phân heo con khỏe và heo tiêu chảy, với
p<0,001. Trong mẫu môi trường, vi khuẩn E. coli hiện diện trong mẫu nền
chuồng (64,75%) cao hơn rất nhiều so với mẫu nước uống (11,84%). Sự
hiện diện của E. coli trên nền chuồng và nước uống có thể có mối quan hệ
mật thiết với sự hiện diện của vi khuẩn E. coli trong phân heo khỏe và heo
tiêu chảy ở khu vực ĐBSCL.
Sự hiện diện của vi khuẩn E. coli trong nghiên cứu này khác nhau
không có ý nghĩa thống kê giữa heo con theo mẹ và heo sau cai sữa, giữa

mùa mưa và mùa nắng, giữa vùng nước ngọt và nước lợ.


4.1.2 Phân bố các chủng ETEC F4 (K88), F5 (K99) và F6 (987P)
trong phân heo và môi trường
4.1.2.1 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 từ phân heo và môi
trường
Kết quả cho thấy các chủng mang kháng nguyên F4 hiện diện trong
phân heo con tiêu chảy chiếm tỷ lệ cao nhất, kế đến là F5 và F6. Nghiên cứu
này đã xác định F4 là yếu tố bám dính chính, định vị trên bề mặt của ruột
non và gây bệnh tiêu chảy cho heo con giống như nhận định của Nagy and
Fekete (2005).
11

Bảng 4.3: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo và môi trường
Kháng
nguyên bám
dính
Heo con tiêu chảy
(n=1.141)
Heo con khỏe
(n=197)
Môi trường
(n=220)
Thống kê
SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ

(%)

SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ

(%)

SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ

(%)

F4 (K88) 233

20,42

8

4,06

20

9,09

p<0,001

F5 (K99) 96

8,41

6

3,05

14

6,36

p<0,001

F6 (987P) 66

5,78

5

2,54

12

5,45

p>0,05

p<0,001


p>0,05


p>0,05


SMDT: Số mẫu dương tính

Các chủng F4, F5 và F6 hiện diện trong phân heo khỏe và môi trường
chiếm tỷ lệ thấp và khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, F4, F5 và
F6 là các kháng nguyên bám dính phổ biến trong các chủng ETEC phân lập
phân heo tiêu chảy, heo khỏe và môi trường chăn nuôi ở ĐBSCL. Các
chủng ETEC phân lập được có thể là tác nhân gây bệnh tiêu chảy trên heo
con, và cũng là nguồn vấy nhiễm ETEC lên nền chuồng, nước uống và
ngược lại.
4.1.2.2 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy
theo tuổi
Bảng 4.4: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy theo tuổi
Địa điểm SMĐD
F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P)
SMDT

Tỷ lệ (%)

SMDT

Tỷ lệ (%)

SMDT

Tỷ lệ (%)

Heo con theo mẹ 585

119

20,34
a

55

9,40
b

44

7,52
c

Heo sau cai sữa 556

114

20,50
a

41

7,37
b

22

3,96
d

SMĐD: Số mẫu định danh. SMDT: Số mẫu dương tính. Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ số
mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Heo ở 2 nhóm tuổi nhiễm ETEC mang kháng nguyên bám dính F4,
F5 và F6. Sự lưu hành của các chủng ETEC F4 ở cả 2 nhóm tuổi có tỷ lệ
cao nhất, tiếp đến F5 và F6. Không có sự khác biệt các chủng ETEC mang
kháng nguyên F4 được phân lập ở heo con theo mẹ (20,34%) và heo sau cai
sữa (20,50%) (với p>0,05). Kháng nguyên F5 chiếm tỷ lệ thấp hơn và
không khác biệt thông kê giữa 2 nhóm tuổi. Riêng F6 hiện diện ở heo con
theo mẹ cao hơn heo sau cai sữa, với p<0,05. Kết quả này có thể giải thích
rằng F4 đóng vai trò rất quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy trên heo con ở
heo con theo mẹ và heo sau cai sữa, và đôi khi gặp ở heo thịt. Riêng F5 và
F6 được tìm thấy chủ yếu có ở heo theo mẹ (Gyles and Fairbrother, 2010).
4.1.2.3 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo
con tiêu chảy theo vùng sinh thái
Các chủng ETEC mang kháng nguyên bám dính F4, F5 và F6 giữa
hai vùng sinh thái nước lợ và nước ngọt là không có sự khác biệt thống kê
(p>0,05). Như vậy pH môi trường giữa 2 vùng sinh thái không ảnh hưởng
đến sự sinh tồn của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo con ở ĐBSCL.
12

Bảng 4.5: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy

theo vùng sinh thái
Vùng
sinh
thái
Số lượng (%) mẫu dương tính với các chủng ETEC
Heo con theo mẹ Heo sau cai sữa
SMĐD

F4 (K88)

F5 (K99)

F6 (987P)

SMĐD

F4 (K88)

F5 (K99)

F6 (987P)

NL 189

31 (16,40)

14 (7,41)

14 (7,41)

185

44 (23,78)

8 (4,32)

5 (2,70)

NN 396

88 (22,22)

41 (10,35)

30 (7,58)

371

70 (18,87)

33 (8,89)

17 (4,58)



p>0,05

p>0,05

p>0,05


p>0,05

p>0,05

p>0,05

NL: nước lợ; NN: nước ngọt; SMĐD: Số mẫu định danh
4.1.2.4. Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo
tiêu chảy theo quy mô đàn
Bảng 4.6: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 (K99), F6 (K99) trên heo con
tiêu chảy theo quy mô đàn
Quy mô
đàn
SMĐD F4 (K88) F5 (K99) F6 (K99)
SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%)
Nhỏ * 542

98

18,08 42 7,75 31 5,72
Vừa** 310

71

22,90 29 9,35 23 7,42
Lớn*** 289

64

22,15 25 8,65 12 4,15



p>0,05 p>0,05 p>0,05
*: (<50 nái), **: (50-100 nái), ***: (>100 nái), SMĐD: Số mẫu định danh.
Sự phân bố của các chủng ETEC mang kháng nguyên F4, F5 và F6 ở
heo con tiêu chảy được nuôi quy mô nhỏ và nông hộ hoặc quy mô vừa hay
quy mô lớn khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy sự phân bố của
các chủng ETEC liên quan tới quy trình chăn nuôi và điều kiện vệ sinh môi
trường hơn là quy mô chuồng trại.
4.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của các chủng ETEC
Bảng 4.7: Phân bố gene mã hóa độc lực của các chủng ETEC trong phân
heo và môi trường

Gen độc
lực mã hóa
Heo con tiêu chảy
(n=330 )
Heo khỏe
(n=14 )
Môi trường
(n=46 )

SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ (%)

SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ (%)

SMDT
(mẫu)

Tỷ lệ (%)

Kháng nguyên bám
dính
F4 90 27,27 2 14,29 11 23,91
F5 22 6,67 1 7,14 2 4,35
F6 33 10,00 1 7,14 7 15,22
F18 66 20,00 2 14,29 4 8,70
F41 9 2,73 0 0,00 2 4,35
Intimin 23 6,97 2 14,29 2 4,35
AIDA - I 12 3,64 1 7,14 1 2,17

p<0,001 p>0,05 p<0,05
Độc tố
STa 53 16,06 1 7,14 5 10,87
STb 107 32,42 3 21,43 11 23,91
LT 31 9,39 0 0,00 4 8,70
EAST1 184 55,76 5 35,71 26 56,52
p<0,001 p>0,05 p<0,001
13

SMDT: Số mẫu dương tính
Kết quả cho thấy, heo con tiêu chảy, khỏe và môi trường đều luôn
tìm thấy các gene mã hóa các loại kháng nguyên bám dính. Trong đó, F4
luôn chiếm ưu thế trên tất cả loại mẫu phân tích, F18 phổ biến trong phân
heo bệnh, heo khỏe. Và F6 phổ biến trên môi trường chăn nuôi. So sánh
từng loại độc tố (STa, STb, LT và EAST1) ở cả 3 đối tượng là heo bệnh,
heo khỏe và môi trường thì không khác nhau, trừ các chủng phân lập từ heo
khỏe không tìm thấy độc tố LT. Tóm lại, những chủng ETEC được phân
lập từ heo bệnh hay heo khoẻ và môi trường đều mang gene mã hóa độc lực.
4.2.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC
4.2.1.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các
chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương
Bảng 4.8: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương (n=55)
Địa điểm
Số mẫu (Tỷ lệ %) dương tính với các chủng ETEC
F4

F5

F6

F18

F41

Intimin

AIDA-I

An Giang 14 (25,45)

4 (7,27)

2 (3,64)

11 (20,00)

1 (1,82)

3 (5,45)

0 (0,00)

Bến Tre 15 (27,27)

3 (5,45)

3 (5,45)

11 (20,00)

2 (3,64)

2 (3,64)

2 (3,64)

Cần Thơ 14 (25,45)

5 (9,09)

7 (12,73)

11 (20,00)

1 (1,82)

8 (14,55)

1 (1,82)

Đồng Tháp 22 (40,00)

2 (3,64)

8 (14,55)

10 (18,18)

2 (3,64)

2 (3,64)

0 (0,00)

Sóc Trăng 11 (20,00)

3 (5,45)

7 (12,73)

13 (23,64)

2 (3,64)

6 (10,91)

6 (10,91)

Vĩnh Long 14 (25,45)

5 (9,09)

6 (10,91)

10 (18,18)

1 (1,82)

2 (3,64)

3 (5,45)

p>0,05

p>0,05

p>0,05

p>0,05

p>0,05

p>0,05

p>0,05

Sự phân bố các gene mã hóa những kháng nguyên bám dính ở các
chủng ETEC phân lập từ 6 tỉnh/ thành có sự khác biệt không có ý nghĩa
thống kê. Nhưng gene mã hóa kháng nguyên AIDA-I chiếm tỷ lệ thấp, đặc
biệt không tìm thấy ở tỉnh An Giang và Đồng Tháp. Các số liệu cũng cho
thấy các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18 xuất hiện nhiều nhất
trong phân heo con tiêu chảy ở cả 6 tỉnh/thành thuộc ĐBSCL. Kết quả này
giống với kết quả nghiên cứu của Võ Thành Thìn (2012) và Nguyen Thi
Lan et al. (2009), họ cho thấy các chủng ETEC mang gene qui định F4 và
F18 luôn chiếm tỷ lệ cao.
4.2.1.2 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các
chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi
Kết quả cho thấy các chủng ETEC phân lập từ heo con theo mẹ tiêu
chảy mang gene mã hóa F4 được tìm thấy với tỷ lệ cao nhất. Kết quả này
tương tự với báo cáo của Lý Thị Liên Khai (2001), Vũ Khắc Hùng và ctv
14

(2005
a
) và Võ Thành Thìn (2012), các tác giả này cho rằng F4 đóng vai trò
gây bệnh quan trọng nhất ở heo con theo mẹ.
Bảng 4.9: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng

ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi
Gene mã hóa KNBD
Các chủng mang các gene mã hóa yếu tố bám dính
Thống
kê
Heo con theo mẹ (n=162) Heo con sau cai sữa (n=168)
SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%)
F4 56 34,57
a
34 20,24
a
p<0,05
F5 16 9,88
b
6 3,57
c
p<0,05
F6 17 10,49
b
16 9,52
b
p>0,05
F18 20 12,35
b
46 27,38
a
p<0,01
F41 5 3,09
c
4 2,38

c
p>0,05
Intimin 11 6,79
b
12 7,14
b
p>0,05
AIDA-I 3 1,85
c
9 5,36
b,c
p>0,05
Ít nhất 1 gene KNBD 116 71,60 105 62,50
KNBD: kháng nguyên bám dính; SMDT: số mẫu dương tính. Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ
số mũ khác nhau thì khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (p<0,001)
Tỷ lệ các chủng ETEC phân lập từ phân heo sau cai sữa bị tiêu chảy
mang gene mã hóa kháng nguyên bám dính F18 cao nhất, kế đến là F4. Tuy
nhiên sự khác nhau của chúng không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, kháng
nguyên F4 và F18 hiện diện phổ biến trong các chủng phân lập từ heo sau
cai sữa. Tỷ lệ các chủng ETEC mang gene mã hóa kháng nguyên F18 phân
lập từ heo sau cai sữa cao hơn ở heo theo mẹ. Kết quả này đã chứng tỏ F18
là kháng nguyên bám dính chính của các chủng ETEC phân lập từ heo sau
cai sữa. Ngược lại, sự hiện diện của các gene mã hóa kháng nguyên F4 ở
heo theo mẹ cao hơn heo sau cai sữa. Kháng nguyên F5 cũng giảm dần theo
lứa tuổi của heo. Kháng nguyên F6 chiếm tỷ lệ thấp và không thấy có sự
khác biệt thống kê giữa 2 nhóm tuổi này. Kết quả này rất phù hợp với nhận
định của Nagy and Fekete (1999); Gyles and Fairbrother (2010) về hoạt động
của các thụ thể, nơi các loại kháng nguyên này bám vào.
4.2.2 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC
trong phân heo tiêu chảy

4.2.2.1 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong
phân heo tiêu chảy theo địa phương
Sự phân bố từng loại gene độc tố ruột EAST1, STb, STa của các
chủng ETEC ở các tỉnh/thành không giống nhau; ngoại trừ độc tố LT hiện
diện ở các tỉnh tương đương nhau, ít phổ biến chỉ chiếm tỷ lệ từ 5,45% -
16,36%. Như vậy, các gene mã hóa độc tố ruột STb, EAST1 là các gene
phổ biến trong các chủng ETEC gây tiêu chảy cho heo con. Tỷ lệ phân bố
STa, STb và EAST1 khác nhau ở các chủng ETEC phân lập từ các
tỉnh/thành khác nhau và chúng là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cho heo con.
15

Bảng 4.10: Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong
phân heo tiêu chảy theo địa phương (n= 55)
Địa điểm
Số lượng các chủng ETEC mang các gene mã hóa đ
ộc tố ruột (%)
STa

STb

LT

EAST1

An Giang 7 (12,73) 14 (25,45) 4 (7,27) 21 (38,18)
Bến Tre 4 (7,27) 15 (27,27) 5 (9,09)

27 (49,09)

Cần Thơ 7 (12,73)

21 (38,18)

6 (10,91)

37 (67,27)

Đồng Tháp

6 (10,91)

8 (14,55) 3 (5,45)

35 (63,64)

Sóc Trăng 15 (27,27) 25 (45,45)

9 (16,36)

31 (56,36)

Vĩnh Long

14 (25,45)

23 (41,82) 4 (7,27) 33 (60,00)

p<0,05 p<0,01 p>0,05 p<0,05
4.2.2.2 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC
trong phân heo tiêu chảy theo tuổi

Bảng 4.11: Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong
phân heo tiêu chảy theo tuổi
Gene mã hóa độc tố ruột

Các chủng mang các gene mã hóa độc tố ruột
Thống kê

Heo con theo mẹ (n=162) Heo con sau cai sữa (n=168)
Số chủng +

Tỷ lệ (%)

Số chủng +

Tỷ lệ (%)

STa 25 15,43
c
28 16,67
c,d
p>0,05
STb 46 28,40
b
60 35,71
b
p>0,05
LT 11 6,79
d
20 11,90
d

p>0,05
EAST1 90 55,56
a
94 55,95
a
p>0,05
Ít nhất 1 gene độc tố 110 67,90 106 63,10
Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ số mũ khác nhau thì khác nhau rất có ý nghĩa thống kê
(p<0,001)
Ở cả hai nhóm tuổi đều cho thấy các chủng ETEC chứa độc tố
EAST1 và STb chiếm tỷ lệ cao. Chúng có vai trò rất quan trọng trong gây
tiêu chảy ở heo con thuộc khu vực ĐBSCL.
Thông qua khảo sát thực tế cho thấy vaccine chứa chủ yếu 4 loại
kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F41 và độc tố LT đã, đang sử dụng ở
một số trang trại và nông hộ ở ĐBSCL. Trong kết quả nghiên cứu này cho
thấy các chủng ETEC không chỉ mang các gene mã hóa kháng nguyên bám
dính F4, F5, F6, F41 mà còn mang các gene mã hóa F18, STa, STb và
EAST1 hiện diện ở tỷ lệ cao, nhưng chưa được tổ hợp vào thành phần kháng
nguyên của các loại vaccine đang được sử dụng tại các địa phương khảo sát.
Có 67 kiểu tổ hợp gene mã hóa kháng nguyên bám dính và độc tố
đường ruột được phát hiện từ các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo
con ở vùng ĐBSCL. Các tổ hợp gene phổ biến ở vùng này là F4/EAST1,
F4/STb/EAST1, F18/EAST1 và F18/STb/EAST1.
4.2.3 Độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền động vật thí nghiệm
4.2.3.1 Độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền chuột bạch
16

Sau khi tiêm 17 chủng vi khuẩn ETEC được phân lập từ phân heo
con tiêu chảy vào xoang bụng 68 chuột, kết quả phát hiện 60 chuột chết
trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc, chiếm 88,24%. Trong đó có 13

chủng gây chết 100% chuột và 4 chủng gây chết 50%. Các kết quả này
chứng minh các chủng được kiểm tra có độc lực cao đối với chuột bạch
ddY. Trong khi đó, sau tiêm truyền 3 chủng ETEC cũng mang tổ hợp gene
độc lực tương tự được phân lập từ phân heo con khỏe trên 12 chuột, không
có chuột nào chết.
Mổ khám, kiểm tra bệnh tích chuột chết cho thấy chuột chết đều có
bụng phình to với dạ dày và ruột chứa nhiều bọt khí, có mùi chua thối, phổi
và gan viêm sưng to, xuất huyết hoặc tụ huyết, lách sưng xuất huyết và ruột
xuất huyết nặng. Khi phân lập máu tim, gan, lách, thận của tất cả chuột chết
trên môi trường MC đều có ETEC thuần và những chủng này đều có chứa
gene mã hóa độc lực ban đầu tiêm vào cho chuột. Các kết quả này chứng tỏ
các chủng ETEC được phân lập từ heo con tiêu chảy có mang độc lực mạnh
hơn từ heo khỏe.
4.2.3.2 Độc lực của các chủng ETEC trên heo sau cai sữa
Chọn 4 chủng ETEC có độc lực cao giết chết chuột, mang các gene
mã hóa kháng nguyên bám dính F4 và F18 tổ hợp với các gene mã hóa độc
tố thường gặp để gây nhiễm cho heo sau cai sữa (5 tuần tuổi), những heo
này đã được kiểm tra bằng phương pháp ELISA gián tiếp không mang
kháng thể kháng kháng nguyên F4 và F18.
Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả 4 chủng ETEC đều có khả năng
gây bệnh tiêu chảy cho heo thí nghiệm. Trong đó, chủng E.585j mang tổ
hợp gene F4/LT/STb/EAST1 gây tiêu chảy cho heo thí nghiệm chiếm tỷ lệ
nhiều nhất (80%, 4/5 con nhiễm bệnh) với các triệu chứng như tiêu chảy
nhẹ đến bỏ ăn, tiêu chảy nặng với phân lỏng như nước, còi cọc. Riêng 3
chủng ETEC mang kháng nguyên bám dính F4 hay F18 kết hợp với các
độc tố STa/STb hay STb/ EAST1đều làm heo bỏ ăn, tiêu chảy nặng phân
lỏng như nước ở 2 heo thí nghiệm. Heo xuất hiện triệu chứng tiêu chảy
trong khoảng 24 giờ sau công cường độc, riêng heo ở lô đối chứng vẫn
không xuất hiện bất kỳ triệu chứng nào.
Phân lập và kiểm tra mẫu phân heo ở 4 lô thí nghiệm, kết quả cho

thấy các chủng ETEC thuần mang các độc lực trùng khớp với độc lực ban
đầu gây nhiễm. Như vậy, 4 chủng dù mang kháng nguyên bám dính F4 hay
F18 đều có khả năng gây tiêu chảy cho heo thí nghiệm. Kết quả này đã
chứng tỏ F4, F18 là 2 chủng phổ biến gây bệnh ở heo sau cai sữa.
4.3 Đặc tính đề kháng với kháng sinh của ETEC
17

4.3.1 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh
tiêu chảy trên heo
Bảng 4.12: Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng ETEC gây
bệnh tiêu chảy trên heo (n=215)
Nhóm kháng sinh Tên kháng sinh
Kháng Nhạy trung bình

Nhạy
SCDT

Tỷ lệ (%)

SCDT

Tỷ lệ (%)

SCDT

Tỷ lệ (%)

N1

β-lactam

Ampicillin 185

86,05

14

6,51

16

7,44

Amoxicillin/clavunic
acid 21

9,77

54

25,12

140

65,12

Ceftazidime 6

2,79

25

11,63

184

85,58

N2

Polypeptides
Colistin 110

51,16

100

46,51

5

2,33

Polymyxin B 63

29,30

150

69,77

2

0,93

N3

Aminoglycosides

Kanamycin 89

41,40

39

18,14

87

40,47

Neomycin 132

61,40

63

29,30

20

9,30

Gentamicin 92

42,79

13

6,05

110

51,16

Amikacin 8

3,72

9

4,19

198

92,09

Tetracyclines
Tetracycline 153

71,16

40

18,60

22

10,23

Phenicol
Florfenicol 186

86,51

11

5,12

18

8,37

N4

Sulfonamides
Trimethoprim/
sulphamethoxazole 170

79,07

15

6,98

30

13,95

Quinolones

Nalidixic acid 135

62,79

31

14,42

49

22,79

Norfloxacin 82

38,14

42

19,53

91

42,33

SCDT:

số

chủng

dương tính; N1 (nhóm 1): ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; N2 (Nhóm
2): ức chế chức năng màng tế bào vi khuẩn; N3 (Nhóm 3): ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn;
N4 (Nhóm 4): ức chế tổng hợp acid nucleic;
Kết quả cho thấy các chủng ETEC được phân lập từ heo con tiêu
chảy có khả năng đề kháng với 6/14 loại kháng sinh ở hầu hết các nhóm
như ampicillin (86,05%), florfenicol (86,51%), trimethoprim/
sulphamethoxazole (79,07%), tetracycline (71,16%), neomycin (61,4%),
nalidixic acid (62,79%). Kết quả này góp phần giải thích hiệu quả điều trị
bệnh tiêu chảy ở heo con.Trong khi đó, có 3/14 loại kháng sinh có hiệu lực
đối với các chủng ETEC như là amikacin, ceftazidime và
amoxicillin/clavulanic acid, các cán bộ thú y có thể sử dụng các loại kháng sinh
này để điều trị bệnh tiêu chảy do ETEC ở heo con.
4.3.2 Các gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây
tiêu chảy trên heo
Các chủng ETEC có thể đề kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam
là do chúng sản sinh ra enzyme β-lactamase. Enzyme này sẽ thủy phân
vòng β-lactam và làm mất hoạt tính của kháng sinh. Kết quả Bảng 4.13 cho
thấy ETEC đề kháng với ampicillin và amox/ clavulanic acid chiếm tỷ lệ
18

cao nhất qua sự hiện diện của gene bla
TEM
(87,44%), kế đến là đề kháng với
cefotetan và cefoxitin qua sự hiện diện của gene bla
CMY
(73, 49%) và đề
kháng kém với ceftazidime do gene bla
SHV
(15,35%).
Bảng 4.13: Các gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu
chảy trên heo (n =215)
Nhóm Nhóm kháng sinh Gene SCDT (chủng) Tỷ lệ dương tính (%)
N1 β-lactam
bla TEM
188 87,44

bla SHV 33 15,35
bla CMY 158 73,49
p<0,001
N3 Aminoglycosides aph(3') Ia 137 63,72
aph(3') IIa 5 2,33
aac (3) IV 87 40,47
aadA 205 95,35
p<0,001
Tetracyclines tet A 187 86,98
tet B 54 25,12
tet C 114 53,02
p<0,001
Phenicol floR 199 92,56
N4 Trimethoprim dhfrV 170 79,07

Sulfonamides SulII 174 80,93
Quinolones

qnrA 149 69,30
qnrB 92 42,79
qnrS 190 88,37
p<0,001
Enzyme aminoglycoside adenyltransferase (strA, strB, aadA, aac(3))
giúp vi khuẩn Gram âm đề kháng với kháng sinh nhóm aminoglycosides
như gene aph(3’)-Ia và aph(3’)-IIa mã hóa đề kháng cho kanamycin và
neomycin, aac(3)-IV cho gentamicin và apramycin, aadA cho
streptomycin và spectinomycin, các gene này được tìm thấy với tỷ lệ lần
lượt là 63,72%, 2,23%, 40,47% và 95,35%.
Có hơn 60 gene kháng tetracycline (tet) đã được xác định và giải
trình tự nucleotide. Tuy nhiên, ba trong số những gene thường gặp nhất là
tetA, tetB và tetC (Roberts, 2005). Kết quả nghiên cứu này xác định tỷ lệ các
gene tetA, tetB và tetC của các chủng vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy heo con lần
lượt là 86,98%, 53,02% và 25,12%.
Gene floR mã hóa cho protein màng, protein này hoạt động như cái
bơm để đẩy chloramphenicol và florfenicol từ bên trong tế bào vi khuẩn ra
ngoài, làm cho 2 loại kháng sinh này không đủ lượng để diệt vi khuẩn.
Trong nghiên cứu này tìm thấy gene floR với tỷ lệ rất cao (92,56%).
Sự hiện diện của enzyme khử dihydrofolate (DHFR), đặc biệt là các
loại I, II, hoặc V, là cơ chế kháng trimethoprim phổ biến nhất của vi khuẩn
19

đường ruột. Tỷ lệ gene dhfrV được tìm thấy từ các chủng ETEC gây bệnh
tiêu chảy heo con ở ĐBSCL là 79,07%. Khả năng đề kháng với kháng sinh
nhóm sulfonamides của vi khuẩn ETEC nhờ 3 gene là sulI, sulII và sulIII,
mã hóa cho enzyme dihydropteroate synthase ức chế hoạt tính của

sulfonamide. Gene sulII đã được xác định trên chủng ETEC phân lập từ
heo con tiêu chảy là 80,93%.
3 gene qnrA, qnrB và qnrS đã được xác định là những gene mã hóa
cho protein của pentapeptide, chúng vô hoạt hoạt tính diệt khuẩn của kháng
sinh nhóm quinolones. Nghiên cứu này đã xác định được tỷ lệ các gene
qnrS (88,37%), qnrA (69,30%), và qnrB (42,79%).
Kết quả phân tích kiểu gene và kiểu hình của các chủng ETEC kháng
kháng sinh có sự tương đồng rất cao. Hầu hết các chủng ETEC được phân
lập từ heo con tiêu chảy ở khu vực ĐBSCL đều có mang ít nhất 1 gene
kháng kháng sinh. Vì vậy việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh
phải hết sức cẩn thận và định kỳ kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của
ETEC gây bệnh trên heo tại các địa phương, nhằm chọn các loại kháng sinh có
hiệu quả trong điều trị.
4.4 Đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC
4.4.1 Quan hệ di truyền của các chủng ETEC trong phân heo
tiêu chảy

Hình 4.1: Giản đồ phả hệ thể hiện tương quan giữa 11 chủng ETEC mang gene
faeG với 8 chủng tương đồng di truyền trên GeneBank
20

Mặc dù các chủng ETEC phân bố trên cây phả hệ chia làm 2 nhánh
khác nhau (Hình 4.1), nhưng chúng có mối quan hệ tương đồng di truyền
rất cao so với các chủng so sánh trên ngân hàng gene. Điều này chứng tỏ 11
chủng ETEC mang kháng nguyên F4 ở ĐBSCL, trong đó 8 chủng được
phân lập từ heo con tiêu chảy, 2 chủng phân lập từ nền chuồng và 1 chủng
phân lập từ nguồn nước uống có mối quan hệ di truyền với nhau. Kết quả
này khẳng định các chủng ETEC phân lập từ nguồn nước uống và nền
chuồng là nguồn lây lan mầm bệnh quan trọng trên heo con ở ĐBSCL và
rất phù hợp với dữ liệu trong Bảng 4.3
.

Hình 4.2: Giản đồ phả hệ thể hiện tương quan giữa 9 chủng ETEC mang
gene fedA với 2 chủng tương đồng di truyền
trên GeneBank

Hình 4.2 cho thấy cả 9 chủng mang gene fedA, trong đó có 8 chủng
được phân lập từ phân heo con tiêu chảy (DT13-79, DT13-80, ST60c,
ST65a, ST55c, ST57e, VL28d, VL32a) và 1 chủng được phân lập từ nước
uống (CT13-NU47) có mối quan hệ di truyền rất gần với nhau hình thành
một nhánh trên cây phả hệ; 2 chủng trên ngân hàng gene (GQ325631 và
L26236) hình thành hai nhánh khác trên cây phả hệ. Mặc dù cây phả hệ này
có 2 nhánh lớn nhưng chúng có mối tương đồng cao (95-99%). Kết quả này
chứng tỏ các chủng ETEC F18 được phân lập từ heo con tiêu chảy và nước
uống ở ĐBSCL có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Điều đó cũng phản
ánh vai trò làm lan truyền mầm bệnh của chủng ETEC mang kháng nguyên

21

bám dính F18 phân lập từ heo con tiêu chảy và môi trường (nguồn nước
uống) ở ĐBSCL là rất quan trọng.
4.4.2 Trình tự nucleotide và amino acid của các chủng ETEC
4.4.2.1 So sánh trình tự nucleotide và amino acid trên gene faeG
Trình tự đoạn gene faeG có độ dài khoảng 499 bp. Các kết quả phân tích
các trình tự nucleotide trên gene faeG cho thấy có 9 vị trí sai khác (19, 26,
47, 71, 72, 89, 159, 342 và 390) trong trình tự nucleotide của các chủng vi
khuẩn ETEC phân lập ở 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL so với 2 chủng tham
chiếu trên ngân hàng gene (Hình 4.3). Sự sai khác trình tự nucleotide có thể
là do trong quá trình lưu hành và gây bệnh trên heo con, các chủng này bị
đột biến gene (mất đi, thêm vào hoặc thay đổi nucleotide).


Hình 4.3: Một số vị trí sai khác trong trình tự nucleotide tiểu phân tử FaeG của
các chủng vi khuẩn ETEC mang kháng nguyên bám dính F4
Có 1 điểm sai khác trong trình tự amino acid giữa 11 chủng ETEC
phân lập và 2 chủng tham chiếu trên ngân hàng gene (Hình 4.4). Tại vị trí
amino acid 159, 5/11 chủng mang amino acid lysine (K) giống với 1 chủng
tham chiếu trên ngân hàng gene (DQ307495) và 6/11 chủng mang amino
acid asparagine (N) với chủng khác được tham chiếu trên ngân hàng gene
(CP002730).
22

Hình 4.4: Sai khác trong trình tự amino acid trên gene faeG của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F4
4.4.2.2 So sánh trình tự nucleotide và amino acid trên gene fedA
Trình tự nucleotide trên đoạn gene fedA mã hóa tiểu phân tử FedA

của kháng nguyên bám dính F18 đã được xác định với độ dài khoảng 313
bp. Mặc dù, trình tự nucleotide trên gene fedA có nhiều sai khác giữa các
chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy heo con ở khu vực ĐBSCL và các chủng
tham khảo trên NCBI, nhưng không làm thay đổi thành phần amino acid,
do đó có rất ít sự thay đổi về vị trí amino acid thể hiện ở Hình 4.5.

Hình 4.5: Sai khác trong trình tự amino acid trên gene faeG của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F18