Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn

Năm 2011 1 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học là một bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh
phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người. Những thành tựu của
chúng đã làm cho cuộc sống con người an toàn hơn, khỏe mạnh hơn, tạo ra các sản
phẩm cho năng suất cao hơn, đáp ứng nhu cầu của con người.
Tuy ra đời muộn hơn các ngành khoa học khác nhưng công nghệ sinh học
đang trên đà phát triển mạnh mẽ và ngày càng có nhiều đóng góp tích cực vào sự
tiến bộ chung của nhân loại. Là một bộ phận của công nghệ sinh học nên công nghệ
gen cũng nằm trong xu thế phát triển không ngừng đó. Thành công đầu tiên của
công nghệ gen thực vật bậc cao là tái sinh được cây trồng chuyển gen (transgenic
plant) vào đầu thập niên 1980. Bằng các kỹ thuật khác nhau để đưa một đoạn DNA
ngoại lai vào genome của tế bào, đến nay đã có hơn 120 loài thực vật thuộc 35 họ
bao gồm các cây trồng rau quả, nông nhiệp, cây cảnh, cây dược liệu và cây cỏ được
chuyển gen thành công. Trong đó, chuyển gen vào cây trồng với mục đích tạo ra
protein kháng nguyên để sản xuất vaccine dựa vào thực vật phòng bệnh cho người
và động vật đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Đây là
một lĩnh vực mang nhiều hứa hẹn và ý nghĩa cho những nước đang phát triển, nơi
mà việc triển khai tiêm chủng mở rộng bằng các loại vaccine truyền thống còn gặp
nhiều khó khăn vì giá thành thành cao, điều kiện bảo quản khắt khe Nghiên cứu
chuyển gen kháng độc tố bề mặt của Streptococcus mutans (SpaA) vào cây thuốc lá
vào năm 1990 đã đánh dấu sự ra đời của vaccine thực vật. Sau đó là hàng loạt các
công bố về chuyển gen vào cây trồng để phát triển loại vaccine này như vaccine
phòng bệnh viêm gan B, viêm gan C, bệnh tiêu chảy [19, 22, 31, 40].
Hiện nay, bệnh tiêu chảy có tỷ lệ người mắc và tử vong rất cao. Hàng năm,
trên thế giới có hàng tỷ người mắc bệnh và hàng triệu người tử vong do bệnh tiêu
chảy. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, dân cư đông đúc, điều kiện vệ
sinh kém nên bệnh tiêu chảy khá phổ biến. Ở Việt Nam, bệnh tiêu chảy xếp thứ hai
trong 10 bệnh phổ biến nhất sau cúm và xếp thứ tư trong 10 bệnh có tỷ lệ tử vong
cao nhất [6]. Bệnh tiêu chảy thực sự là mối đe dọa nguy hiểm cho con người, là
gánh nặng cho y tế cộng đồng và gây thiệt hại lớn về kinh tế-xã hội. Vì vậy, nghiên

cứu để chuyển gen kháng nguyên vào cây trồng làm cơ sở cho các nghiên cứu
chuyên sâu về vaccine dựa vào thực vật là vấn đề đang được quan tâm.
Có nhiều phương pháp chuyển gen đươc áp dụng cho thực vật như chuyển
gen vào tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen vào tế bào bằng vi đạn,
xung điện, xử lí hóa học bằng PEG… Một trong những phương pháp hữu hiệu hiện
đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trong
nước và trên thế giới là chuyển gen trực tiếp bằng vi đạn. Kỹ thuật này có khả năng
áp dụng đối với hầu hết các đối tượng động thực vật, vi sinh vật. Đặc biệt, nó còn
cho phép chuyển gen ngoại lai vào các cơ quan tử như lục lạp, ty thể…[45].
Rau má (Centella asiatica L.) là loại rau phổ biến trong tự nhiên và thường
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 2 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
mọc ở những nơi ẩm ướt như bờ mương bờ sông, bờ ruộng, từ lâu đã được sử dụng
làm thực phẩm, có giới hạn sinh thái rộng, dễ trồng và có khả năng sinh trưởng rất
mạnh. Chúng thường được làm rau xanh cho mỗi bữa ăn hay dùng dich chiết thô để
chữa một số bệnh như lao, phong, thổ huyết. chữa giãn tĩnh mạch [5].
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi chon đề tài “Khảo sát chuyển
gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn” nhằm
tạo cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu về vaccine dựa vào thực vật sau này.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 3 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chuyển gen ở thực vật
Trong gần hai thế kỷ qua, công nghệ sinh học đã đạt được những thành tựu
to lớn đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ gen. Một trong những thành tựu nỗi bật là
chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật này sang sinh vật khác để tạo ra
cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn. Cây trồng chuyển gen

(transgenic crops) hay còn gọi là cây trồng biến đổi gen (genetically modified
crops) hiện đang là vấn đề được cả thế giới tranh luận. Song không thể phủ nhận
hiệu quả của nó trong sản xuất cùng lợi ích kinh tế rất lớn do nó mang lại. Cây trồng
chuyển gen với năng suất và chất lượng cao đã đem lại lợi ích khổng lồ cho những
quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến. Đồng thời giảm được việc sử dụng
thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài nguyên thiên nhiên và phá vỡ
cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàn cầu [6].
Chuyển gen là kỹ thuật đưa một gen mong muốn vào tế bào, gen này có thể
có nguồn gốc từ vi sinh vật, động vật, thực vật hay được tổng hợp nhân tạo. Điểm
mấu chốt của thao tác di truyền là việc phân lập một đoạn DNA riêng biệt từ hệ gen,
đó là bản chất của tạo dòng gen. Tạo dòng gen là quá trình gồm 4 bước: tạo ra các
đoạn DNA, gắn chúng vào vector, đưa cấu trúc tái tổ hợp vào tế bào vật chủ để
nhân lên, chọn lọc trình tự quan tâm. Và sau cùng là tiến hành chuyển gen mong
muốn đó vào tế bào thực vật [13]. Có nhiều phương pháp chuyển gen, tuy nhiên có
2 phương pháp chính là chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens và chuyển gen trực
tiếp như kỹ thuật xung điện, vi tiêm, vi đạn… Lựa chọn phương pháp nào để đạt
được mục đích phụ thuộc nhiều yếu tố như vật chủ cần chuyển gen, mục đích của
thí nghiêm và các thiết bị cho quá trình chuyển gen. Đa số kỹ thuật chuyển gen yêu
cầu các loại mô có khả năng tái sinh cao và điều này góp phần quyết định sự lựa
chọn phương pháp chuyển gen thích hợp [45].
Chuyển gen giáp tiếp thông qua A. tumefaciens được sử dụng phổ biến do có
nhiều ưu điểm như kỹ thuật hoàn chỉnh, khả năng chuyển một hay một số ít bản sao,
hiệu quả cao, chuyển được đoạn DNA lơn, ổn định, ít bị sắp xếp lại và hạn chế các
thể khảm. Tuy nhiên, trở ngoại lớn nhất trong phương pháp này là tính đặc trưng vật
chủ của A. tumefaciens và hiệu suất biến nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Thay vào
đó, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bởi những thuận lợi như kỹ thuật
đơn giản, áp dụng đối với hầu hết các đối tượng thực vật, động vật và vi sinh vật.
Đặc biệt nó còn cho phép chuyển gen ngoại lai vào các cơ quen tử như lục lạp, ty
thể [10, 32, 45].
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ

thuật vi đạn
Năm 2011 4 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
1.2. Chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn
1.2.1. Khái quát chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn
Chuyển gen bằng vi đạn là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến
tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới.
Đây là phương pháp thường hay được sử dụng để đưa gen ngoại lai vào cây trồng
hay những cơ thể khác. Hàng triệu hạt vi đạn kim loại bọc DNA được bắn vào tế
bào đích hay mô đích bằng hệ thống dội bom hay súng bắn gen. DNA sẽ tách khỏi
vi đạn và đi vào trong tế bào, một phần DNA có thể hợp nhất trong NST tế bào vật
chủ khi DNA ngoại lai vào đến nhân [32].
Thiết bị chuyển gen dùng để đưa DNA vào tế bào và mô nguyên vẹn nhờ
dùng đạn có kích thước hiển vi, có gia tốc cao mang DNA hay những vật chất di
truyền khác xuyên qua thành và màng tế bào [44]. DNA được phủ lên bề mặt viên
đạn có kích thước hiển vi làm bằng vàng hay tungsten bằng cách cho kết tủa với
calcium chloride và spermiline. Một khi DNA vào đến nhân tế bào đích, DNA sẽ có
khả năng hợp nhất ổn định trong vật chất di truyền của tế bào đích [16, 32].
Thiết bị chuyển gen được sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào,
được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Đại học Cornell
(New York, USA). Tên chính xác và đầy đủ của thiết bị chuyển gen là hệ thống
phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường
được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology
(sinh học) và ballistics (sự bắn tung). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau
nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí
helium để gia tốc các hạt. Thiết bị được sử dụng rỗng rãi nhất hiện nay là Biolistic
PDS
R
-1000/He Particle Delivery Sytem (Biorad). Hệ thống sử dụng khí helium tạo
ra áp suất cao ép vào một đĩa chắn khí (rupsture disk). Khí áp lực khi vượt qua giới
hạn chịu đựng của đĩa chắn sẽ làm cho đĩa này vỡ ra, đẩy nhanh viên đạn lớn

(marcocarrier) mang hàng triệu hạt vi đạn bọc DNA hướng về tế bào đích. Một
màng chắn sẽ ngăn viên đạn lớn lại, chỉ cho viên đạn nhỏ xuyên qua đến tầng đich
và thâm nhập vào tế bào [51].
Phương pháp chuyển gen bằng vi đạn cho phép chuyển DNA vào hầu hết các
loài hay mô. Quá trình tiến hành nhanh, đơn giản và thuận tiện cho chuyển gen trực
tiếp vào những mô toàn năng như phấn hoa, phôi, mô phân sinh hay nuôi cấy tế bào
phôi thai. Ngoài ra, phương pháp chuyển gen bằng vi đạn còn cho phép chuyển gen
vào cơ quan tử như lục lạp, ti thể [2, 51]. John và cs (1988) đã tiến hành biến nạp
thành công vào lục lạp tảo lục đơn bào (Chlamyclomonas reinhardtiib) bằng kỹ
thuật vi đạn [25]. Phương pháp này không chỉ được ứng dụng với đối tượng là thực
vật mà còn thu hiệu quả ở cả vi sinh vật và động vật. Zelnin và cs (1993) đã nghiên
cứu chuyển gen thành công vào mô chuột bằng phương pháp dội bom [59]. Tuy
nhiên cũng như các phương pháp chuyển gen khác, phương pháp dội bom cũng có
những hạn chế như hiệu suất biến nạp thấp hơn so với các phương pháp khác như
chuyển gen nhờ A. tumefaciens, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí cho mỗi lần chuyển
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 5 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
gen tốn kém, việc hợp nhất nhiều bản sao của gen ngoại lai cũng như khả năng hợp
nhất của nó vào vùng hoạt động của genome vật chủ, có thể làm gen không hoạt
động (gene silencing) và sự không ổn định của gen ngoại lai [36, 51, 54].
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen bằng vi đạn
1.2.2.1.Mức độ chân không trong buồng bắn
Mức độ chân không trong buồng bắn là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng
đến đường đi của vi đạn. Môi trường chân không trong buồng bắn có tác dụng làm
giảm lực ma sát trượt khi các hạt vi đạn di chuyển hướng về tế bào đích. Nhờ vậy
mà đạn di chuyễn đúng hướng và không bị thay đổi vận tốc. Mức độ chân không
trong buồng bắn tối ưu là 28-29 inHg và sẽ thay đổi tùy vào mục đích thí nghiệm
như tiến hành dội bom với mẫu da chuột in situ, mức độ chân không yêu cầu thấp
hơn khoảng 20 inHg. Nếu mức độ chân không trong buồng bắn không thích hợp thì

sẽ gây áp lực lên mô phá hủy tế bào, làm giảm mức độ biểu hiện của tế bào [50].
Có thể làm tăng hiệu quả biến nạp bằng cách bơm khi helium vào buồng bắn
trước khi hút chân không. Nhờ vậy, khí helium sẽ thay thế cho không khí. Cách này
đặc biệt hiệu quả với vi sinh vật, làm tăng hiệu quả biến nạp ở vi khuẩn lên 5-6 lần,
nấm men lên 4 lần. Helium là loại khí có trọng lượng phân tử thấp nhất sẽ là giảm
tối thiểu sự giảm tốc của vi đạn khi chúng di chuyển trong dòng khí và giúp giảm
lực tác động khi dòng khi va chạm lên tế bào đích [50].
1.2.2.2. Áp suất khi Helium
Áp suất khí helium ảnh hưởng đến vận tốc vi đạn. Áp suất thích hợp cho quá
trình dội bom từ 600-2.400 psi. Nhưng với các loại mô khác nhau thì áp suất thích
hợp cũng khác nhau. Các tế bào vi khuẩn, động vật, thực vật thường sử dụng áp
suất 1100 psi trong khi tế bào nấm và nấm mem thường sử dụng áp suất 1300 psi.
Khi áp suất tăng, sẽ làm tăng sự thâm nhập của vi đạn bọc DNA đi sâu vào tế bào,
mô đích nhưng lại làm tổn thương đến tế bào và mô đích [50].
1.2.2.3. Đường kính và loại đạn
Việc lựa chọn loại đạn và đường kính đạn cũng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu
suất biến nạp. Kim loại làm vi đạn phải có khối lượng riêng đủ lớn để có đủ động
lượng xuyên qua mô, thành tế bào đích. Các kim loại thường được sử dụng là vàng,
tungsten, palladium. rhodium, platinium, và iridium. Chúng phải trơ về mặt hóa
học để tránh phản ứng với DNA hay các thành phần trong tế bào. Đồng thời hình
dạng, bề mặt của vi đạn phải đầy đủ các tính chất để đảm bảo chúng có thể gắn với
DNA hay tách khỏi DNA một cách dễ dàng [50].
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 6 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Đạn tungsten có khá nhiều đường kính khác nhau, từ 0,5-2,0 µm, hình dạng
không đồng nhất. Ưu điểm của đạn tungsten là không quá đắt, có nhiều loại với
đường kính khác nhau để lựa chọn và có khả năng dính bám DNA trên bề mặt khá
tốt. Nhược điểm của loại đạn này là có khả năng gây độc cho một số loại tế bào, dễ
bị oxy hóa bề mặt gây phá hủy cấu trúc DNA. Trong khi đạn bằng vàng có khá ít

kích cỡ, hình dạng nhẵn, đồng đều hơn so với đạn tungsten. Ưu điểm nổi bật của
loại đạn này là tính đồng nhất của chúng, cho phép chúng ta có thể tối ưu đường
kính đạn để phù hợp với dạng tế bào cần chuyển. Vàng không độc với bất kỳ loại tế
bào nào và đã được chứng nhận bởi FDA về tính an toàn khi sử dụng trong quá
trình chuyển gen. Tuy nhiên, nhược điểm của đạn vàng là rất đắt, đồng thời nó
không ổn định trong hỗn hợp chất lỏng và bị đóng cục khi để lâu. Đây là hai loại
đạn hiện nay hay được sử dụng. Ngoài ra, một số kim loại khác cũng đã được sử
dụng làm đạn cho quá trình chuyển gen nhu iridium hay platinium, tuy nhiên hiệu
suất biến nạp khá thấp [50].
Đường kính đạn cũng ảnh hưởng đến hiệu suất biến nạp, và nó phụ thuộc
vào kích thước của tế bào đích. Thường thì đường kính đạn bằng 1/10 đường kính
tế bào đích. Tuy nhiên, trong vài trường hợp sử dụng đạn có đường kính lớn hơn
như khi chuyển gen vào tế bào biểu bì chuột, đường kính đạn lớn (đường kính 3,9
µm) trong khi tế bào có đường kính 20 µm. Hoặc khi sử dụng đạn có đường kính 1
µm lại có hiệu quả cao trong nuôi cấy tế bào myotube (kích thước 40x100 µm). Còn
theo Kikkert (2005) khi sử dụng đạn vàng có đường kính từ 0,7-1 µm thì tỷ lệ biến
nạp ổn định cao nhất [32].
1.2.2.4. Khoảng cách di chuyển của vi đạn
Một trong những thông số ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả biến nạp là
khoảng cách di chuyển của vi đạn tính từ màng chắn đến vị trí đặt mô đích. Việc
thay đổi các vị trí đặt mô đích sẽ làm thay đổi khoảng cách này. Có 4 mức và có
thể thay đổi trong buồng bắn: 3, 6, 9 và 12 cm. Việc lựa chọn mức nào phụ thuộc
nhiều vào loại mô, tế bào đích [50].
Việc bọc DNA lên bề mặt đạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh
hưởng đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Việc kết lắng DNA trên bề mặt diễn
ra rất nhanh. Vì vậy rất khó để thu được một hỗn hợp đồng nhất, do vi đạn bằng
vàng hay tungsten rất khó giữ ở dạng huyền phù [50]. Để bọc DNA quanh vi đạn
hiệu quả, spermidine và calcium chloride được dùng phối hợp để tăng khả năng ổn
định của đạn. Harwood và cs (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình bọc
DNA lên bề mặt đạn trong thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa mạch. Thay đổi các

thông số về lượng đạn, lượng DNA và thể tích sử dụng cho một lần chuyển gen thu
nhận các kết quả khác nhau [26]. Các nghiên cứu của Lacorte và cs (1997) cũng cho
kết luận tương tự khi quan sát sự biểu hiện của gen gus ở các mô hạt đậu phộng
(Arachis hypogaea L.) chuyển gen. Sử dụng lượng đạn nhiều sẽ làm giảm khả năng
sống của mô đích dẫn đến làm giảm hiệu suất biến nạp [33]. Thường hay dùng
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 7 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
spermidine hay calcium chloride hay dùng kết hợp cả hai để bọc DNA. Tuy nhiên,
trong nghiên cứu của Elumalai và cs (2009) khi sử dụng protamine thay vì
spermidine để bọc DNA thì thu hiệu quả biến nạp cao hơn [23].
Cấu hình của vector được dùng trong chuyển DNA ngoại lai vào thực vật
ảnh hưởng đến cả sự tiếp hợp lẫn sự biểu hiện của các gen. Sự biến nạp sẽ hiệu quả
hơn khi dùng DNA mạch thẳng so với DNA mạch vòng. Hơn nữa các plasmid có
kích thước lớn (>10 kb) có thể bị phân đoạn trong quá trình bắn và do đó mức biểu
hiện gen ngoại lai thấp. Tuy nhiên, các đoạn DNA lớn có thể được đưa vào cây
bằng nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm mem (YAC) [2].
Bản chất của DNA ngoại lai cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
biến nạp. Người ta thường sử dụng DNA sợi đơn, sợi đôi, DNA mạch vòng như
plasmid do tính ổn định, bền vững về mặt cấu trúc của nó [32].
Để tối ưu hóa quá trình chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn, các nghiên cứu
thường thăm dò các thông số khác nhau nhằm tăng hiệu suất biến nạp. Tùy vào từng
loại tế bào, từng đối tượng nghiên cứu mà các thông số này có thể thay đổi khác
nhau.
1.3. Một số nghiên cứu về chuyển gen LTB trong nước và thế giới
1.3.1. Trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về chuyển gen LTB. Mason
và cs (1998) đã thiết kế và xây dựng quá trình tối ưu hóa cho việc tổng hợp gen mã
hóa LTB, để có thể sử dụng thực vật chuyển gen như là vaccine đường ăn (có thể
ăn được) bảo vệ cơ thể khỏi nội độc tố E. coli. Biểu hiện của gen LTB trong khoai

tây được tổng hợp dưới sự kiểm soát của vùng promoter có hiệu quả cao hơn ở củ
và lá, và lượng LTB này nhiều hơn khi lấy từ vi khuẩn. Mason và cs chứng minh
tính sinh miễn dịch khi so sánh lượng kháng thể kháng LTB IgG trong huyết thanh
và IgA trong phân ở chuột được cho ăn củ khoai sống với chuột được gây miễn dịch
bởi LTB vi khuẩn. Kết quả chuột được cho ăn 1 lần/tuần/3 tuần với liều 5 g khoai củ
chứa 20-25 μg LTB so với 5 μg LTB từ E. coli tái tổ hợp. Một tuần sau liều thứ 3,
chuột được miễn dịch với LTB khoai tây có nồng độ huyết thanh, niêm mạc cao
hơn. Chuột được thử nghiệm với 25 μg LT và sự bảo vệ được đánh giá bởi tỷ lệ
ruột/thịt (gut/carcass mass ratios). Mặc dù không có con chuột nào được miễn dịch
hoàn toàn nhưng hiệu lực cao hơn được thấy ở vaccine khoai tây so với vaccine vi
khuẩn [40].
Kim và cs (2007) đã phát hiện gen sLTB trong DNA của tế bào lá cây diếp cá
chuyển gen bằng phương pháp PCR. Sự tổng hợp và gắn kết sLTB vào phần
oligomer của cấu trúc pentamer được quan sát thấy ở chất chiết xuất thực vật
chuyển gen bằng phương pháp phân tích Western Blot. Sự gắn kết của các sLTB
pentamer vào các receptor glucolipid ở màng tế bào thượng mô ruột được xác nhận
bằng phương pháp phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme G-ganglioside.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 8 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Protein sLTB chiếm khoảng 1.0-2.0% lượng protein hòa tan trong mô tế bào lá cây
diếp cá. Sự tổng hợp và gắn kết của các sLTB monomer vào các oligomer có hoạt
tính sinh học trong mô tế bào lá diếp cá cho thấy rõ tính khả thi của việc sử dụng
vaccine đường ăn từ thực vật để tạo miễn dịch niêm mạc [34].
Kang và cs (2005) nghiên cứu quá trình sử dụng phôi soma đã chuyển gen
LTB của nhân sâm Siberia để sản xuất ra một lượng lớn vaccine thực vật. Khi phôi
soma được nuôi cấy vào máy máy phản ứng sinh học loại khí nén 130 L, chúng
được chuyển thành phôi soma trưởng thành thông qua quá trình phát sinh phôi và
chứa khoảng 0.36% LTB của tổng số protein hòa tan. Phương pháp ELISA đã xác
định có sự gắn đặc hiệu vào G-ganglioside của protein LTB tổng hơp từ phôi soma,

có nghĩa LTB đã tạo dạng pentamer hoạt động. Vì thế, việc sử dụng hệ thống máy
phản ứng sinh học để tạo LTB protein trong phôi soma cho phép sản xuất lượng lớn
vaccine thực vật trong thời gian ngắn [29].
Salimian và cs (2010) đã thiết kế thành công gen tổng hợp được tối ưu hóa
từ thực vật, mã hóa cho protein CfaB-LTB. Sau khi chèn vào vector biểu hiện thực
vật với promoter đặc hiệu, gen này sẽ được đưa vào cây cải dầu. 10 dòng chuyển
gene đã được tái sinh. Sau khi phân tích phân tử, cho chuột balb/c ăn hạt của cây cải
dầu chuyển gen. Phân tích huyết thanh để xác định IgG và IgA đặc hiệu của Cfab-
LTB và phân tích phân để tìm IgA đặc hiệu của Cfab-LTB. Dựa theo kết quả
ELISA, Cfab-LTB protein chiếm xấp xỉ 0.3-0.5% tổng lượng protein hòa tan của
hạt cây cải dầu chuyển gene. Quan sát thấy phản ứng kháng thể anti Cfab-LTB có
nồng độ cao ở nhóm được cho ăn hạt chuyển gene. Các kết quả trên cho thấy Cfab-
LTB lấy từ hạt cây cải dầu chuyển gen có tính sinh miễn dịch và có tính bảo vệ khi
được dùng theo đường uống cho chuột [49].
Mendoza và cs (2007) nghiên cứu biểu hiện của gen LTB trong cây cà rốt.
Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium đã được sử dụng trong
nghiên cứu này. Ba mươi dòng chuyển gen độc lập đã tạo phôi soma trong 6 tháng
nuôi cấy và được chuyển qua nhà kính. Phương pháp GM1-ELISA được sử dụng để
đánh giá hàm lượng protein LTB trong rễ cây trưởng thành. Một số dòng chuyển
gen biểu hiện LTB lên đến 0,3% trong tổng số protein hòa tan, cao hơn so với biểu
hiện ở gen vi khuẩn ban đầu có trong cây. Phân tích miễn dịch học cho thấy hoạt
động của protein LTB tái tổ hợp có thể có chức năng phòng chống bệnh tiêu chảy
[41].
Oszvald và cs (2008) đã nghiên cứu biểu hiện LTB ở cây lúa chuyển gen.
LTB tổng hợp (sLTB) đã được thay đổi dựa trên việc sử dụng trình tự tối ưu hóa của
thực vật, và kết hợp với một tín hiệu dịch mã (các chuỗi Kozak) trước trình tự khởi
đầu và tín hiệu chặn ER, SEKDEL, trong c-teminus của gen sLTB. Các sLTB và
các gen LTB hoang dại (wLTB) được đặt vào vector biểu hiện thực vật dưới sự kiểm
soát của vùng promoter đặc biệt ở lúa mì Bx17 HMW (phân tử lượng cao) chứa các
intron đầu tiên của gen actin 1 ở lúa. Cả hai gen đã được đưa vào các tế bào lúa

(Oryza sativa L.) bằng phương pháp chuyển gen thông qua bắn phá hạt. Sự tích hợp
của LTB gen vào nhiễm sắc thể của cây biến đổi gen đã được xác nhận bởi phương
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 9 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
pháp di truyền DNA khuếch đại PCR. Các phiên mã và dịch mã của gen LTB đã
được xác định bằng kỹ thuật PCR đảo ngược (RT-PCR) và phân tích Western blot.
Các protein LTB tổng hợp trong các mô giống lúa biến đổi gen cho thấy ái lực liên
kết với GM1 ganglioside, LTB tổng hợp từ thực vật có khả năng hình thành
pentame hoạt động. Mức độ biểu hiện của sLTB cao hơn wLTB trong cây lúa
chuyển gen và lên tới 2,7% trong tổng số protein hòa tan của các mô hạt [44].
Chikwamba và cs (2002) nghiên cứu tổng hợp LTB trong hạt giống ngô biến
đổi gen. Phương pháp phân tích ELISA đã chỉ ra bằng việc sử dụng CaMV 35S,
lượng LTB tối đa được phát hiện trong mô sẹo là 0,04% trong tổng số protein chiết
trong dung dịch (TAEP) và 0,01% trong hạt R1 của cây chuyển gen. Sử dụng
promoter zein gamma, LTB tích lũy đạt 0,07% trong hạt R1. Trình tự SEKDEL làm
tăng lượng LTB khi kết hợp với các promoter zein gamma. Kết quả được theo dõi
qua 3 thế hệ cho thấy hạt R3 của một dòng chuyển gen mang promoter 35S CaMV
có tối đa là 0,3% LTB trong TAEP, dòng chuyển gen mang promoter zein gamma
lên đến 3,7% LTB trong TAEP. Như vậy hạt giống ngô có thể được sử dụng như
một hệ thống tổng hợp các kháng nguyên chức năng [19].
Rezaee và cs (2005) nghiên cứu sự biểu hiện của LTB ở chủng
Saccharomyces cerevisiae. Để xây dựng vector biểu hiện nấm men cho các protein
LTB, gen eltB mã hóa LTB đã được khuếch đại từ DNA E. coli có nguồn gốc con
người bằng PCR. Biểu hiện plasmid pLTB83 được xây dựng bằng cách chèn các
gene eltB vào vector pYES2 phía dưới promoter GAL1. Vector tái tổ hợp được
chuyển vào S. cerevisiae. Các protein LTB được xác định trong tổng số protein hòa
tan của nấm men bằng cách phân tích SDS-PAGE. ELISA định lượng đượclượng
tối đa của protein LTB biểu hiện hiện trong nấm men được khoảng 1,9% trong tổng
số protein hòa tan. Phân tích sinh miễn dịch cho thấy protein LTB có nguồn gốc từ

nấm men không thể phân biệt được với protein LTB vi khuẩn về mặt kháng nguyên.
Như vậy, khi toàn bộ nấm men tái tổ hợp được xem như là một công thức vắc-xin
mới thì biểu hiện của LTB trong S. cerevisiae có thể là một chiến lược rẻ tiền nhưng
hiệu quả để bảo vệ chống lại ETEC [47].
Tacket và cs (2004) nghiên cứu chuyển gen LTB vào cây ngũ cốc. Ngũ cốc
chuyển gen có thể dùng để ăn mà vẫn không làm mất đi tính kháng nguyên . Điều
đó được thể hiện qua việc 1 mg LTB của E. coli mà không có bộ đệm đã được làm
thức ăn cho các tình nguyện viên người lớn với ba liều, mỗi liều chứa 2,1 g nguyên
liệu thực vật. Bảy trong chín tình nguyện viên (chiếm 78%) có lượng huyết thanh
IgG chống các độc tố không bền nhiệt E. coli (LT) và số lượng tế bào tiết kháng thể
tăng lên sau khi chủng ngừa. Bốn trong chín tình nguyện viên (chiếm 44%) có
lượng IgA tăng lên [53].
Kang và cs (2004) dùng phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium để
biểu hiện gen LTB tổng hợp trong N. tabacum, đồng thời sử dụng gen
acetyltransferase Phosphinothricin (bar) như là một điểm đánh dấu lựa chọn. Gen
LTB tổng hợp phù hợp với trình tự mã hóa của cây thuốc lá đã được nhân bản với
một vector biểu hiện thực vật dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitin và chuyển
vào thuốc lá chuyển gen thông qua Agrobacterium. Cây chuyển gen được lựa chọn
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 10 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
trong môi trường có bổ sung l mg 5’ Phosphinothricin 1 (PPT). Lượng protein LTB
được phát hiện trong thuốc lá chuyển gen xấp xỉ 3,3% tổng lượng protein hòa tan,
cao hơn khoảng 300 lần so với lượng tạo ra ở các cây sử dụng các gen LTB ban đầu
dưới sự kiểm soát của promoter 35S CaMV. Các cây trồng chuyển gen được đưa
vào nhà kính và hạt giống thu được đã chứng minh là có khả năng kháng thuốc diệt
cỏ. Do đó, kỹ thuật này có thể là một công cụ hữu ích cho việc chuyển đổi gene ở
cây thuốc lá [30].
Moravec Tomas và cs (2006) nghiên cứu việc sản xuất LTB từ hạt đậu nành
và tính sinh miễn dịch để sử dụng nó như một vaccine đường ăn. Các tiểu đơn vị B

của các độc tố không bền nhiệt của E. coli (LTB) được sử dụng như là một
immunogen mới trong quá trình sản xuất hạt đậu tương. Biểu hiện của LTB được
chuyển trực tiếp tới mạng lưới nội sinh chất của các tế bào nhu mô.Phức hợp
Pentameric LTB tích lũy chiếm đến 2,4% tổng lượng protein trong hạt giống vào
ngày cuối cùng và được ổn định trong hạt sấy khô. LTB từ đậu tương, cảm ứng với
những con chuột ở cả hai hệ thống IgG và IgA, và phản ứng kháng thể IgA niêm
mạc, và đặc biệt hiệu quả khi được sử dụng trong một chiến lược chủng ngừa bằng
đường ăn qua sonde. Huyết thanh từ những con chuột được chủng ngừa ngăn chặn
sự liên kết phối tử in-vitro và con chuột này cũng có thể chống lại các độc tố không
bền nhiệt E. coli (LT) khi được thử nghiệm. Hơn nữa, LTB chiết từ đậu tương kích
thích các phản ứng kháng thể chống lại một kháng nguyên gấp đến 500 lần. Những
kết quả này chứng minh sự hữu ích của đậu nành như một nguồn sản xuất hiệu quả
đối với vaccine đường ăn [43].
1.3.2 Trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thực vật chuyển gen hiện đang là một hướng
mới, tuy nhiên đã có những công trình mở đầu cho bước phát triển công nghệ gen ở
nước ta trong tương lai. Loc NH và cs (2010 a) đã tổng hợp được gene mã hóa cho
LTB được làm phù hợp với chuỗi mã hóa tối ưu ở thực vật và dung hợp với trình tự
SEKDEL để tăng cường mức độ biểu hiện và gắn kết protein ở thực vật. Gen tổng
hợp LTB được đặt vào một vector biểu hiện, dưới sự kiểm soát của promoter CaMV
35S và được đưa vào cây rau càng cua bằng phương pháp vi đạn. Sự tích hợp gen
LTB vào genome DNA của cây được xác định bởi phương pháp PCR. Sự tổng hợp
LTB thực vật được kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích Western Blot. Lượng LTB
protein được sản xuất từ lá cây rau càng cua là khoảng 0.75% của tổng lượng
protein hòa tan. Phương pháp ELISA xác định LTB thực vật đã gắn đặc hiệu vào
GM1-ganglioside, là receptor của LTB trên màng tế bào, như vậy LTB đã hình thành
dạng có hoạt tính sinh học [37].
Loc NH và cs (2010 b) đã nghiên cứu đưa gen LTB vào vector biểu hiện thực
vật dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S, sau đó vector được đưa vào cây cải
xoong bằng phương pháp chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Argobacterium. Sự

tích hợp của gen LTB tổng hợp vào genome được xác nhận bằng kỹ thuật PCR
(khuếch đại chuỗi DNA). Sự tổng hợp protein LTB thực vật được xác định bằng
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 11 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
phương pháp phân tích Western Blot. Lượng lớn nhất của LTB protein được tạo ra ở
mô lá cây cải xoong xấp xỉ 1.3% tổng lượng protein hòa tan của cây. Phương pháp
ELISA (GM1-ganglioside ELISA) cho thấy LTB thực vật đã gắn đặc hiệu vào
GM1-ganglioside, là receptor đặc hiệu của màng tế bào. Như vậy LTB thực vật đã
tạo thành dạng có hoạt tính sinh học [38].
Nguyễn Hoàng Bách (2009) đã nghiên cứu đưa gen LTB vào cây càng cua
bằng kỹ thuật vi đạn, sử dụng vector pMY051 dưới sự kiểm soát của promoter
CaMV 35S. Sự tích hợp gen LTB vào genome được xác định bằng phương pháp
PCR. Sự tổng hợp protein LTB thực vật được xác định bằng phương pháp phân tích
Western Blot. Lượng protein LTB được tạo ra từ mô lá cây càng cua cao nhất là
0,8% tổng lượng protein hòa tan. Sự gắn đặc hiệu của các protein này vào GM1-
ganglioside đã được xác định bằng phương pháp PCR. Như vậy gen LTB trong cây
càng cua chuyển gen đã biểu hiện thành protein LTB có hoạt tính sinh học [1].
1.4. Vaccine thực vật
Vaccine thực vật (plant-based vaccines) là loại vaccines được sản xuất dựa
trên cơ sở thực vật, trước đây được gọi là vaccine thực phẩm (edible vaccines). Ưu
thế của thực vật chuyển gen để sản xuất vaccine và các hợp chất có hoạt tính sinh
học cao là chúng dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, sản lượng cao, và do vậy cho
chúng ta thu được một lượng sản phẩm lớn. Nếu dùng chúng làm vaccine thì
phương thức đưa vaccine vào cơ thể lại đơn giản, động vật và người chỉ cần “ăn”
nguồn thực vật có vaccine là có thể có miễn dịch. Những kháng nguyên được sản
xuất trong thực vật không mang nguồn bệnh đến cho con người, những độc tố trong
hệ thống vaccine được giảm thiểu vì những tác nhân gây bệnh cho người và động
vật không gây bệnh trên thực vật. Tuy nhiên, có một số vấn đề cần phải giải quyết
khi phát triển vaccine thực phẩm. Thứ nhất, chúng ta phải lựa chọn loại thực vật nào

để dễ dàng thao tác đưa gen vaccine vào, lại vừa có thể ăn được để con người và
động vật ăn chúng. Sự lựa chọn thực vật để sản xuất và phát triển vaccine rất quan
trọng. Mặc dù những cây ngũ cốc có thể chứa protein LTB (B subunit of E. coli
heat-labile enterotoxin) trung hòa độc tố E. coli nhưng chúng sẽ bị mất hoạt tính
kháng nguyên khi nấu chín. Khoai tây chuyển gen đun sôi trong thời gian ngắn (3
phút) mất đi 50% tác dụng của nó. Thứ hai, chúng ta nên chọn loại gen sản xuất
kháng nguyên nào đưa vào genome của thực vật, để sau khi chuyển vào cơ thể,
chúng không bị enzyme của hệ tiêu hóa phân hủy, đảm bảo còn tồn tại để kích thích
miễn dịch. Trở ngại chính của việc sử dụng vaccine thực phẩm là phải tìm cách
khắc phục sự phân giải của protein trong môi trường ruột. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, vaccine gây đáp ứng miễn dịch bằng đường miệng đòi hỏi một liều dùng phải
cao hơn vaccine tái tổ hợp do một phần kháng nguyên bị mất tác dụng trong môi
trường acid của dạ dày. Thứ ba, nếu dùng thực vật chuyển gen để sản xuất kháng
nguyên làm vaccine phân tử thì phải chọn cây dễ trồng, năng suất cao, dễ dàng thu
hoạch, chế biến và bảo quản [12].
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 12 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Từ kết quả nghiên cứu đầu tiên của Curtiss và cs (1990) về biểu hiện của
SpaA trong thuốc lá, đến nay đã có nhiều protein kháng nguyên được biểu hiện
thành công trong thực vật như protein L1 của papiloma virus loại 11 của người
(HPV-human papilomavirus type 11) [1]; virus viên gan C (HCV-hepatitis C virus)
[21];peptide β-amyloid người [32]; HbsAg; protein G của virus bệnh dại; NCVP
[55]; LTB [19, 11, 25, 39, 43], CTB; HEV [33].
Một lượng lớn các cây lương thực thực phẩm được dùng cho mục đích này
như: khoai tây, ngô, lúa mì, đậu tương, táo, chuối, mận, cà chua, hướng dương [1,
24, 31, 47].
1.5. Đại cương về bệnh tiêu chảy
Tiêu chảy là bệnh toàn cầu, bệnh tuy không khó chữa nhưng lại nguy hiểm
do làm mất nước, rối loạn điện giải trong cơ thể dẫn đến suy kiệt, trụy tim mạch và

có thể tử vong. Độc tố của E. coli (enterotoxigenic E. coli-ETEC) là nguyên nhân
chính gây nên tiêu chảy, làm chết khoảng 1,5 triệu người mỗi năm, do nó sản sinh
ra nhiều độc tố trong ruột. Tác nhân gây bệnh chính của ETEC là nội độc tố không
bền nhiệu LT (heat-labile toxin), có khối lượng phân tử cao và có những tính chất
tương tự như độc tố cholera toxin (CT) của vi khuẩn tả Vibrio cholerae về cấu trúc,
chức năng và hóa miễn dịch [3, 28, 41, 47].
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. coli tiết độc tố liên quan đến hai yếu tố
độc lực:
Yếu tố dính bám: qua trung gian là các lông pili có tính miễn dịch. ETEC
bám một cách đặc hiệu lên các thụ thể (receptor) tên tế bào mô ruột.
Độc tố ruột: gồm độc tố không bền nhiệt (labile toxin-LT) và độc tố bền
nhiệt (stable toxin-ST).
Độc tố không bền nhiệt (LT) là một protein có khối lượng phân tử 86 kDa,
không hoạt động ở nhiệt độ 100
o
C. Nó bao gồm tiểu đơn vị A (có khối lượng lượng
27 kDa) là phần hoạt động chứ ADP-ribocylate và 5 tiểu đơn vị B (khối lượng 11,5
kDa) là phần gắn với thụ thể đặc hiệu trên tế bào biểu mô là GM1 (glycoprotein).
Sau khi găn với tế bào, tiểu đơn vị A tác động lên enzyme adenylcyclase gây tăng
nồng độ bất thường AMP vòng bên trong tế bào, dẫn đến giảm hấp thụ ion Na
+
vào
trong tế bào và tăng ion Cl
-
từ tế bào ra lòng ruột, kết quả là có một sự tăng tiết
nước giàu chất điện giải vào lòng ruột và gây nên tiêu chảy.
Độc tố bền nhiệt (ST) có khối lượng phân tử thấp (2 kDa), bền vững với
nhiệt, hoạt động được ở 100
o
C [3, 28].

Việt Nam chúng ta nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, dân cư đông đúc, điều
kiện vệ sinh kém, nên bệnh tiêu chảy phát triển khá phổ biến. Bệnh tiêu chảy ở nước
ta đứng thứ nhất trong 10 bệnh phổ biến nhất và đứng thứ tư trong 10 bệnh có tỷ lệ
tử vong cao nhất. Trung bình mỗi năm có khoảng 2000-2200 lượt trẻ em dưới 5
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 13 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
tuổi mắc bệnh này. Bệnh tiêu chảy thực sự là mối đe dọa nguy hiểm cho con người,
là gánh nặng cho y tế cộng đồng và gây thiệt hại lớn về kinh tế-xã hội. Mặc dù hiện
nay, thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đã có nhiều nổ lực trong việc phát
triển vaccine phòng bệnh tiêu chảy nhưng tỷ lệ tử vong do E. coli tiếc độc tố gây ra
vẫn còn ở mức cao. Vì vậy, nghiên cứu để chuyển các gen mong muốn vào cây
trồng làm cơ sở cho việc phát triển mô hình sản xuất vaccine dựa vào thực vật, góp
phần khống chế bệnh này là một trong những vấn đề đang được quan tâm trên toàn
cầu.
1.6. Giới thiệu về cây rau má
1.6.1. Vị trí phân loại
Cây rau má hay còn gọi là tích tuyết thảo, có tên khoa học là Centella
asiatica (L.) Urb, đây là cây một năm, thân thảo thuộc họ Hoa tán Apiaceae
(Umbelligerae) [4].
1.6.2. Phân bố và đặc điểm hình thái
1.6.2.1. Phân bố
Thường mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lũng, bờ mương thuộc những
vùng nhiệt đới như Việt Nam, Lào, Cambuchia, Indonesia, Mailasia, Srilanka, Ấn
độ, Pakistan, Madagascar… [5, 7].
1.6.2.2. Đặc điểm về hình thái
Rau má là một loại cỏ mọc bò, có rễ ở các mấu, thân gầy, nhẵn. Lá hình mắt
chim, màu xanh, phần đỉnh lá tròn, gân lá dạng lưới hình chân vịt, xung quanh có
khía tai bèo, lá rộng 2-4 cm, cuống dài 2-4 cm trong những nhánh mang hoa và dài
10-12 cm trong những nhánh thường. Cụm hoa đơn mọc ở kẽ lá, gồm 1-5 hoa nhỏ.

Quả dẹt rộng 3-5 mm, có hình mắt lưới dày đặc, quả chín sau 3 tháng [5, 7].
1.6.2.3. Thành phần hóa học
Các phân tích cho thấy thành phần hóa học của rau má gồm: nước 88,2%,
protein 3,2%, carbohydrate 1,8%, cellulose 4,5% , calcium 2,29% phosphorus 2%,
iron 3,1%, β-caroten 1,3%, vitamin B1 0,15% và vitamin C 37% [53].
Toàn bộ cây rau má đều chứa tinh dầu, dầu béo. Chất béo chủ yếu là
glyceride của các acid: oleic, linolic, lignoceric, palmitic và stearic. Trong rau má
còn chứa một lượng alkaloid hydrocotylin, chất đắng vellarin, glucoside asiaticoside
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 14 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
và các loại vitamins B1, B2, B3, C và K, tùy theo khu vực trồng hoặc mùa thu
hoạch tỷ lệ các hoạt động chất có thể sai khác [7].
1.6.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng của cây rau má
Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào Can, Tỳ Vị
có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Rau má thường
dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn
nhọt, rôm sẩy. Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác
dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn được gọi là
tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và Asiatic aid.
Hoạt chất asiaticoside đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong và bệnh lao.
Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn được bao phủ bởi một màng
ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất
asiaticoside trong dịch chiết ra má có thể làm tan lớp màng bao này để hệ thống
miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng [5, 7].
Đối với da, nhiều công trình nghiên cứu và kết quả lâm sàng đều cho thấy
dịch chiết rau má có khả năng kích hoạt các tiến trình sinh học trong việc phân chia
tế bào và tái tạo mô liên kết giúp vết thương chóng lành và mau lên da non. Hiện
nay, rau má đã được sử dụng rất đa dạng dưới hình thức thuốc tiêm, thuốc bột,
thuốc mở để điều trị tất cả các chứng bệnh về da như vết bỏng, vết thương do chấn

thương, do giải phẫu, cây ghép da, những vết lở lâu lành, vết lở do ung thư, bệnh
phong, vẩy nến [5, 7].
Đối với tuần hoàn huyết, những hoạt chất của rau má có tác dụng cải thiện vi
tuần hoàn ở các tĩnh mạch, mao mạch, bảo vệ lớp áo trong của thành mạch và làm
gia tăng tính đàn hồi của mạch máu. Do đó rau má cũng hữu ích trong các chứng
tăng áp lực tĩnh mạch ở các chi dưới [5, 7].
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 15 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây rau má (Centella asiatica L.) thuộc họ Hoa tán
[5].
Hình 2.1. Cây rau má tự nhiên
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu
Vetor biểu hiện thưc vật pMY051 có mang gen LTB (Tiểu đơn vị B của độc
tố bền nhiệt ở E. coli) do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, Đại học
Quốc gia Chonbuk, Hàn Quốc thiết kế (Hình 2.2).
Hình 2.2. Cấu trúc của vector pMY051. LB và RB bờ trái và bờ phải. Gen LTB
dung hợp với trình tự SEKDEL và được điều hòa bởi promoter CaMV 35S. Một cassette
biểu hiện NPTII được dùng để chọn lọc kháng sinh cho cây chuyển gen.
Gen LTB tổng hợp (414bp) là gen LTB tự nhiên đã được tối ưu trình tự mã
hóa bằng cách thay các nucleotid đặc trưng của thực vật để tăng mức độ biểu hiện
của gen trong cây.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 16 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
GGATCC GCCACC 12

BamHI Kozak
ATG GTG AAG GTG AAG TGC TAC GTT TTG TTC ACC GCT TTG CTC TCC 57
Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser
TCT CTC TGC GCT TAC GGA GCT CCA CAG TCC ATT ACA GAG CTC TGC 102
Ser Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys
TCC GAG TAC AGG AAC ACA CAA ATC TAC ACC ATC AAC GAT AAG ATC 147
Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile
CTC TCC TAC ACC GAG TCC ATG GCT GGA AAG AGG GAG ATG GTT ATC 192
Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile
ATT ACA TTC AAG AGC GGA GCT ACA TTC CAG GTG GAG GTG CCA GGA 237
Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly
AGC CAA CAT ATT GAT TCC CAG AAG AAG GCT ATT GAG AGG ATG AAG 282
Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys
GAT ACA TTG AGG ATC ACA TAC CTC ACC GAG ACC AAG ATT GAT AAG 327
Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys
TTG TGC GTG TGG AAC AAC AAG ACC CCA AAC TCC ATT GCT GCT ATC 372
Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile
AGC ATG GAG AAC TAC TCT GAG AAA GAT GAG CTA TGA GGTACC 414
Ser Met Glu Asn *** S E K D E L *** KpnI
Hình 2.3 Trình tự nucleotid của gen LTB tổng hợp. Trình tự Kozak (GCCACC), trình
tự SEKDEL (TCTGAGAAGATGAGCTA).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo cây rau má in vitro
Cây rau má tự nhiên có đặc tính sạch bệnh, khỏe mạnh được chọn làm đối
tượng chuyển gen trong nghiên cứu này. Rau má sau khi được thu thập sẽ cắt bỏ rễ và
một phần cuống lá để thu chồi đỉnh có kích thước 5-6 cm.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 17 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Chồi đỉnh được ngâm trong dung dịch xà phòng loãng 10 phút, rửa sạch dưới

vòi nước chảy khoảng 30 phút, khử trùng sơ bộ bằng ethanol 70% trong 30 giây, tiếp
đến khử trùng bằng 0,1% HgCl
2
trong 2-3 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 lần.
Sau khi khử trùng, chồi đỉnh (dài 1-2 cm) được tách ra và nuôi cấy trên môi
trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 1 mg/L BAP và pH 5,8 để
thu chồi in vitro [9].
Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121
o
C trong 15 phút; cây trong
phòng thí nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 25±2
o
C, điều kiện chiếu sáng 2000-3000
lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày [14].
Hình 2.4. Đoạn thân rau má dùng trong thí nghiệm chuyển gene
2.2.2. Chuẩn bị mẫu cho chuyển gen
Cuống là của cây rau má invitro sau 5 tuần nuôi cấy được cắt nhỏ phần thân
cây thành các đoạn có kích thước 3-4 cm. Các đoạn này được sắp xếp kín thành
vòng tròn (d=2 cm) đồng tâm với đĩa Petri nhựa (d=9 cm). Mẫu vật được tiền nuôi
cấy trên môi trường cơ bản MS gồm 3,0 % sucrose, 0,8% agar 2 ngày trước khi tiến
hành chuyển gen.
2.2.3. Chuyển gen ltb vào cây rau má bằng kỹ thuật vi đạn
2.2.3.1. Chuẩn bị mẫu đạn vàng
Đạn vàng (đường kính 0,1 μm) được sử dụng như vật mang DNA trong thí
nghiệm chuyển gen. Đạn được rửa bằng ethanol 70%, vortex mạnh và ủ ở nhiệt độ
phòng trong 15 phút. Dịch nổi được loại bỏ bằng ly tâm nhẹ trong 5 giây. Tiếp tục
rửa đạn bằng 1 ml nước cất vô trùng, vortex mạnh và để im trong 1 phút, ly tâm nhẹ
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 18 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai

trong 2 giây rồi hút bỏ thể nổi trên. Sau khi rửa xong, 500 μl glycerol 50% được bổ
sung để bảo quản dung dịch đạn.
5 μg DNA plasmid (1 μg / 1 μl) được bọc lên bê mặt đạn vàng trong dung
dịch bao gồm 50 μl dung dịch đạn vàng đã được chuẩn bị như mô tả ở trên (3 mg),
50 μl dung dịch 2,5 M CaCl
2
và 20 μl dung dịch 0,1 spermidine. Hỗn hợp được trộn
đều bằng vortex mạnh trong 2-3 phút, ủ ở nhiêt phòng 1 phút, sau đó ly tâm nhẹ
trong 2 giây. Sau khi loại bỏ dịch nổi, hỗn hợp được rửa bằng 140 μl ethanol 100%.
Cuối cùng, hổn hợp được hòa trong 48 μl ethanol 100%. Cho một thí nghiệm
chuyển gen, 500 μg vi đạn được hút ra và cho lên màng rush disk.
2.2.3.2. Chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn
Để khảo sát ảnh hưởng của khí helium lên hiệu quả chuyển gen bằng vi đạn,
các mức độ áp suất khí helium khác nhau từ 650 đên 1350 psi đã được khảo sát.
Đồng thời, ảnh hưởng của khoảng cách từ đạn đến mẫu cũng được khảo sát với các
mức 3, 6, 9 và 12 cm. Áp suất buồng bắn được duy trì ở mức 28 inHg trong suốt
quá trình. Gen ltb được chuyển vào mô tế bào thực vật bằng thiết bị chuyển gen
Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(BioRad). Các thao tác trong quá
trình chuyển gen được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.4. Tái sinh cây
Hai ngày sau khi biến nạp, mẫu được chuyển sang môi trường cảm ứng
callus không chứa kháng sinh trong 1 tuần rồi chuyển sang môi trường chọn lọc
(môi trường tái sinh chồi có bổ sung thêm 25 mg/L Km). Chồi phát sinh từ callus
được tách và chuyển sang môi trường tái sinh chồi.
2.2.5. Xác định sự hiện diện gen
Chồi phát sinh sau khi được sinh trưởng trên môi trường tái sinh được thu
nhận và tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Kang và cs [28].
Sự hiện diện của gen ltb trong cây chuyển gen được xác định bằng phân tích
PCR với cặp primer đặc trưng của gen này.
Primer- F: 5' -GGG GAT CCG CCA CCA TGG TGA AAG- 3'

Primer- R: 5' -GGG GTA CCT CAT AGG TCA TCT TTC - 3'
DNA tổng số của cây chuyển gen và cây đối chứng được dùng làm khuôn
mẫu để khuếch đại PCR. Hỗn hợp PCR chứa 10 pmol mỗi loại primer, 200 µM
dNTP mỗi loại, đệm Taq polymerase chuẩn và 1,25 unit enzyme Taq polymerase
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 19 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
(BioRad) trong tổng số dung tích 50 µL. Khuếch đại PCR theo quy trình: 95
o
C/5
phút, 95
o
C/1 phút (30 chu kỳ), 55
o
C/1 phút, 72
o
C/1 phút và cuối cùng 72
o
C/10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% và nhuộm với
ethidium bromide [28].

Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 20 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo cây rau má in vitro
Trong chuyển gen, việc lựa chọn môi trường thích hợp để tạo cây in vitro đạt
tỉ lệ cao là công đoạn quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp. BAP là 1 chất

thuộc nhóm cytokynin, có khả năng kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có
ưu thế ngọn và kích thích tăng trưởng chồi. Vì vậy chúng tôi sử dụng BAP trong
quá trình tạo cây rau má in vitro từ chồi đỉnh.
Một trăm chồi đỉnh của rau má sau khi khử trùng được cấy lên môi trường
MS cơ bản có bổ sung 1 mg/L BAP, pH 5,8 . Sau 1 tuần nuôi cấy, 70 mô đã bắt đầu
hình thành cụm chồi (khoảng 2-3 chồi/mô), mỗi chồi gồm 5-6 lá. Như vậy tỷ lệ cụm
chồi hình thành từ mô ban đầu đạt 70%. Nguyễn Hoàng Bách và cs (2009) nghiên
cứu chuyển gen LTB vào cây càng cua bằng kỹ thuật vi đạn, sau 2 tuần nuôi cấy
đoạn thân in vitro trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA
hoặc 1,0 mg/L BAP và 15% nước dừa, nhóm nghiên cứu nhận thấy có sự cảm ứng
callus, tuy nhiên giai đoạn này chỉ kéo dài 5-7 ngày thì chuyển qua giai đoạn tạo
chồi. Chồi hình thành trên các khối callus với tỷ lệ 100% [1].
Sau 5 tuần nuôi cấy, cây phát triển hoàn chỉnh với tỷ lệ 85%, cuống lá đạt
chiều dài khoảng 4-5 cm (Hình 3.1) và được sử dụng để làm nguyên liệu tiến hành
chuyển gen LTB. Nguyễn Hoàng Bách và cs (2009) nghiên cứu chuyển gen LTB
vào cây càng cua bằng kỹ thuật vi đạn, sau khi tái sinh chồi từ đoạn thân in vitro,
nhóm nghiên cứu tách các chồi này cấy lên môi trường MS cơ bản. Sau 10 ngày
nuôi, chồi bắt đầu tạo rễ; sau 2 tuần thì rễ phát triển nhiều và dài ra (2-3 cm) và sau
6 tuần thì chồi in vitro đã phát triển thành cây hoàn chỉnh với chiều cao trung bình
đạt 5 cm [1].

Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 21 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai

Hình 3.1. (A). Tái sinh chồi từ cuống lá rau má in vitro. (B). Cây rau má in
vitro sau 5 tuần nuôi cấy
3.2. Chuyển gen ltb bằng kỹ thuật vi đạn
Ảnh hưởng của áp suất khí helium, khoảng cách bắn đến quá trình chuyển
gen được khảo sát. Mô sau chuyên gene được quan sát hình thái trong suốt 8 tuần

sau chuyển gen. Kết quả thu được cho thấy, sau một tuần cấy chuyển lên môi
trường chọn lọc, hình thái của các mô hoàn toàn giống nhau. Do thực vật (rau má)
có khả năng sinh trưởng chậm nên ảnh hưởng của kháng sinh lên mô chưa được thể
hiện rõ.
Sau 2 tuần nuôi cấy: 60 mô chuyển gen ở áp suất khí helium 650 psi, khoảng
cách bắn 3 cm có 15 mô xuất hiện màu đỏ tía ở 2 đầu lóng thân (Hình 3.3). Một
trăm mô chuyển gen ở áp suất khí helium 900 psi, khoảng cách bắn 6 và 9 cm có
58 mô cùng hiện tượng. Một trăm mô chuyển gen ở áp suất khí helium 1100 psi,
khoảng cách bắn 6 và 9 cm đều xuất hiện màu đỏ tía hoặc màu vàng (Hình 3.4).
Một trăm bốn mươi mô chuyển gen ở áp suất khí helium 1350 psi, khoảng cách bắn
9 và 12 cm có 23 mô xuất hiện màu vàng. Các hiện tượng mô màu đỏ tía hoặc vàng
chứng tỏ chuyển gen ở những mô này là không thành công.
Sau 3 tuần nuôi cấy: Những mô có hiện tượng chuyển màu ở tuần thứ 2 tiếp
tục thâm dần. Các mô xanh còn lại dần tăng về kích thước, 2 đầu lóng thân hơi
phình, có dấu hiệu cảm ứng tạo callus (Hình 3.5). Mẫu đối chứng không chuyển gen
dần dần chuyển sang màu đen và chết sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
(hình 3.6). Nguyễn Hoàng Bách và cs (2009) tiến hành chuyển gen ltb vào cây càng
cua ở áp suất khí helium 1100 psi, khoảng cách bắn 9 cm, sau 3 tuần nuôi cấy, ở các
đoạn thân chuyển gen bắt đầu xuất hiện chồi. Tỷ lệ đoạn thân xuất hiện chồi chỉ đạt
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
A
B
Năm 2011 22 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
3%, khoảng 2-3 chồi/mô. Mẫu đối chứng không chuyển gen dần dần chuyển sang màu
đen và chết sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc [1].
Hình 3.2. Mô đối chứng không chuyển gen chết sau 3 tuần nuôi cấy trên
môi trường chọn lọc.
Sau 4 tuần nuôi cấy: Những mô màu đỏ hoặc vàng đều chuyển sang thâm
đen và có dấu hiệu chết (Hình 3.8). Ngoài ra còn xuất hiện thêm 35 mô màu đỏ tía

(hình 3.9) và 18 mô màu vàng ở lần lượt các áp suất khí helium 900 và 1350 psi.
Trong 45 mô xanh còn lại ở áp suất 650 psi, có 26 mô cảm ứng tạo callus (hình
3.10), các callus phát triển chậm. Chín mươi chín mô xanh ở áp suất khí helium
1350 psi bắt đầu cảm ứng tạo callus. Bảy mô xanh còn lại ở áp suất khí helium 900
psi chưa cảm ứng tạo callus.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 23 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
Hình 3.3. Mô cảm ứng tạo callus sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.
Sau 6 tuần nuôi cấy: Những mô cảm ứng tạo callus ở tuần thứ 4, đến tuần
thứ 6 kích thước có tăng hơn đáng kể, nhưng callus chưa phát triển rõ rệt.
Hình 3.4. Mô chuyển gen sau 8 tuần nuôi trên môi trường chọn lọc
Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy với áp suất khí helium 1350 psi,
khoảng cách bắn là 12 cm cho tỉ lệ mô có dấu hiệu sống sót cao nhất là 88.75%
(mẫu vẫn xanh sau 8 tuần cấy chuyển trên môi trường chọn lọc). Với khoảng cách
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Năm 2011 24 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
bắn 3cm, áp suất khí helium là 650 psi thì cho thấy có 70% mẫu có khả năng tái
sinh. Trong khi đó kết quả chuyển gen với áp suất khí helium là 900 psi cho kết quả
mô thấp nhất lần lượt là 9,09% và 4,44% với khoảng cách bắn 6 và 9 cm. Một số
nghiên cứu chuyển gen bằng vi đạn cho thấy, mô chuyển gen với áp suất thấp
thường cho tỷ lệ mô sống sót cao tuy nhiên mô thực sự có mang gen thường phấp
hơn. Điều này có thể do ảnh hưởng của áp suất khi helium và khoảng cách bắn đã
tác động lên mô, và mức độ tổn thương mô là một yếu tố quan trọng quyết định sự
tái sinh mô. Kết quả của chúng tôi cũng tương tự như những nghiên cứu này khi tỷ
lệ mô có khả năng tái sinh cao xuất hiện khi tiến hành bắn ở áp suất thấp (650 psi)
và áp suất cao nhưng khoảng cách bắn xa (1350psi / 12 cm).
Bảng 3.1. Bảng thống kê số mô có khả năng tái sinh sau 8 tuần nuôi cấy
Mặc dù tỷ lệ mô có khả năng sống sót sau 8 tuần cấy chuyển là cao, nhưng số

mô có khả năng tái sinh chỉ chiếm tỉ lệ rất nhỏ. Trong số 52 mô có khả năng sống
sót khi tiến hành thí nghiệm ở điều kiện ở áp suất khí helium 650 và 900 psi, thì
không có mô nào có khả năng tái sinh thành chồi. Trong khi đó, chỉ có một chồi
xuất hiện từ 99 số mô có khả năng sống sót ở điều kiện thí nghiệm với áp suất khí
helium 1350 psi, khoảng cách bắn 12 cm. Phạm Thị Quỳnh Nga và cs (2010) tiến
hành chuyển gen LTB vào cây cải xoong ở áp suất khí helium 1100 psi, khoảng
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn
Thông số kỹ thuật
Số mô
thí
nghiệm
Số mô
sống
sót
Tỷ lệ
sống sót
(%)
Áp suất khí
helium
650
Khoảng cách
bắn (cm)
3 60 45 75,00
900
Khoảng
cách bắn (cm)
6 55 5 9,09
9 45 2 4,44
1350

Khoảng
cách bắn (cm)
9 70 37 52,86
12 70 62 88,57
Năm 2011 25 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai
cách bắn 9 cm, sau 8 tuần nuôi cấy, các đoạn thân chuyển gen bắt đầu xuất hiện
chồi [18].
Watad và cs (1998) chuyển gen PAT vào cây hoa loa kèn, sử dụng nguyên
liệu là callus, điều kiện biến nạp như áp suất khí helium 1100 psi, khoảng cách bắn
6 cm. Tiến hành chuyển gen cho 1800 khối callus thu được 55 mẫu tái sinh chồi
trên môi trường chọn lọc. Tuy nhiên, kiêm tra sự hiện diện gen PAT trong các cây
thu được bằng kỹ tthuật PCR cho thấy chỉ có 19 cây có chứa gen PAT, hiệu suất
biến nạp khoảng 1%.
Oszvald và cs (2008) chuyển gen LTB vào cây lúa bằng kỹ thuật vi đạn thu
được 29 mô tái sinh trên môi trường chọn lọc trên tổng số 1000 mô, hiệu suất biến
nạp là 2,9%. Dora và cs (2008) đã nghiên cứu chuyển gen gusA vào cây houblon,
điều kiện biến nạp là áp suất khí helium 350 psi, khoảng cách bắn 9 cm. Sau khi
chuyển gen vào cây, tiến hành chọn lọc trên môi trường chứa hygromycin B thu
được 36 cây có tính kháng kháng sinh trong tổng số 270 cây thí nghiệm. Phân tích
PCR đê kiểm tra sự hiện diện của gen gusA thấy có 25 cây chứa gen, hiệu suất biến
nạp khoảng 7,5%.
Nguyễn Hoàng Bách và cs (2009) nghiên cứu chuyển gen LTB vào cây càng
cua. Hiệu quả biến nạp bằng kỹ thuật vi đạn đạt 3% ở điều kiện áp suất khí hellium
1100 psi, khoảng cách bắn 9 cm, áp suất buồng bắn 28 inHg, đạn vàng 1 µm. Kết quả
phân tích cho thấy 6 cây chuyển gen được tái sinh có mang gen LTB. Tuy nhiên, chỉ
2 trong 6 cây biểu hiện protein LTB với hàm lượng 0,6-0,8% protein hòa tan tổng
số. Các protein này đã có ái lực với GM1 [1]
Nga va cs (2010) tiến hành chuyển gen LTB vào cây cải xoong. Hiệu quả nạp
biến nạp bằng kỹ thuật vi đạn đạt 1,33% ở điều kiện áp suất khí helium 1100 psi,
khoảng cách bắn 9cm, áp suất buồng bắn 28 inHg, đạn vàng đường kính 0,6 µm.

PCR cho thấy gen LTB đã hợp nhất vào genome 4 cây cải xoong chuyển gen. Kết
quả phân tích Western blot cho thấy trong 4 cây chuyển gen có 3 cây có biểu hiện
protein LTB.
Cây rau má sau khi tái sinh từ mô chuyển gen được đem đi phân tích sự hiện
diện của gen ltb bằng phương pháo PCR. Kết quả PCR được trình bày ở hình 3.5
cho thấy có sự hiện diện của một band DNA với kích thước khoảng gen ltb trong
cây rau má.
Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ
thuật vi đạn