Nghiên cứu hệ protease trùn quế (perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHAN THỊ BÍCH TRÂM




NGHIÊN CỨU HỆ PROTEASE TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)TRONG QUÁ TRÌNH TỰ
PHÂN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC









Tp. Hồ Chí Minh – 2010

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHAN THỊ BÍCH TRÂM


NGHIÊN CỨU HỆ PROTEASE TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)TRONG QUÁ TRÌNH TỰ
PHÂN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành:Hóa Sinh Học
Mã số : 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
2. PGS. TS HÀ THANH TOÀN





Tp. Hồ Chí Minh – 2010

ii



LỜI CAM ðOAN




Tôi xin cam ñoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.




Tác giả luận án





Phan Thị Bích Trâm


iii
LỜI CẢM ƠN

Với tất cả tình cảm chân thành và sâu sắc nhất, tôi vô cùng biết ơn:

PGS.TS. Phạm Thị Ánh Hồng ñã tận tình hướng dẫn, truyền thụ những tri thức khoa
học và tạo ñiều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu ñể tôi hoàn thành luận
án.
PGS. TS. Hà Thanh Toàn, ñã tận tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi
hoàn thành luận án.
Th.S Dương Thị Hương Giang ñã chỉ bảo tận tình về chuyên môn và tạo mọi ñiều kiện
thuận lợi về trang thiết bị cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
PGS. TS. Trần Thị Thanh Hiền ñã giúp tôi thiết lập công thức phối chế các loại thức
ăn và tạo ñiều kiện thuận lợi về trang thiết bị, trại thực nghiệm ñể tôi hoàn thành phần
ứng dụng của luận án.
Ban Giám ðốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học - ðại Học Cần
Thơ ñã tạo mọi ñiều kiện trang thiết bị ñể hoàn thành luận án.
Quý Thầy Cô của Bộ môn Sinh Hóa, Trường ðại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM
ñã tạo mọi ñiều kiện tốt cho tôi trong thời gian hoàn thành luận án.
Cảm ơn các em Nguyễn Thị Xuân Dung, Phạm Thị Quỳnh Trâm, Tạ Duy Tiên, Châu
Thị Loan và Châu Tài Tảo

luôn sẵn lòng giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận án.
Xin gởi lời cảm ơn chân thành ñến Khoa Nông Nghiệp & Sinh học Ứng Dụng và
Trường ðại Học Cần Thơ, các bạn bè ñồng nghiệp ñã hỗ trợ, ñộng viên và tạo ñiều
kiện cho tôi trong thời gian học tập.
Cám ơn những người thân trong gia ñình ñã luôn ñộng viên và tạo ñiều kiện thuận lợi
cho tôi vượt qua mọi khó khăn trong học tập và thực hiện luận án này.


Phan Thị Bích Trâm
iv
MỤC LỤC
Lời cam ñoan ii

Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt ix
Danh mục các bảng x
Danh mục các hình vẽ và ñồ thị xii
MỞ ðẦU 1
CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1.Trùn quế 3
1.1.1 ðặc tính sinh lý học 3
1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng 4
1.2. Hệ protease và các nghiên cứu ứng dụng 5
1.2.1 Phân loại về protease 7
1.2.2 Cơ chế phản ứng của nhóm serine peptidase 9
1.2.3 Ứng dụng nhóm serrine protease trong quá trình thủy phân fibrin 11
1.2.3.1 Khái quát về phân tử fibrinogen và fibrin 11
1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong ñiều trị tim mạch 15
1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin 16
1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình thủy phân protein 18
1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình tự phân 18
1.2.4.2 Các phương pháp ñánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein . 20
1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tích protein hiện ñại 21
1.3.1 Thu nhận và xử lý mẫu 22
1.3.1.1 Nguyên liệu 22
1.3.1.2 Một số thiết bị nghiền mẫu và phá vỡ tế bào dùng trong 22
chiết tách mẫu
1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein 23
1.3.1.4 Tủa sơ bộ 25
1.3.2 Các kỹ thuật sắc ký thường sử dụng trong tinh sạch protein 25
v
1.3.3 Kỹ thuật ñiện di 27

1.3.3.1 Kỹ thuật ñiện di SDS-PAGE 27
1.3.3.2 ðiện di hai chiều 27
1.3.3.3 Phát hiện protein 28
1.3.4 Phân tích protein bằng phương pháp phổ khối lượng 29
1.3.4.1 Giới thiệu về phổ khối lượng trong phân tích peptide, protein 29
1.3.4.2 Các bước phân tích protein theo phương pháp phổ khối lượng 29
1.4 ðặc ñiểm sinh học và dinh dưỡng của ấu trùng tôm sú 32
1.4.1 Sự phát triển của ấu trùng tôm sú 32
1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường ñến quá trình sống của tôm sú 34
1.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng của tôm sú 35
1.4.4 Tình hình sử dụng nguồn thức ăn dinh dưỡng cho tôm 38

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 40
2.1 Vật liệu 40
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 40
2.1.2 Hóa chất 40
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 40
2.2 Phương pháp nghiên cứu 41
2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân 41
2.2.1.1 Xác ñịnh các thành phần nguyên liệu 41
2.2.1.2 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế 42
2.2.1.3 Khảo sát các yếu tố nhiệt ñộ, pH, ñiểm ñẳng ñiện và chất ức chế
ảnh hưởng lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 43
2.2.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease
trùn quế tự phân 43
2.2.2.1 Thu nhận bằng phương pháp tủa thích hợpdịch tự phân trùn quế 43
2.2.2.2 Tinh sạch protease trùn quế bằng kỹ thuật sắc ký, ñiện di 44
2.2.2.3 Khảo sát ñặc tính hóa học các protease sau khi tinh sạch 46
vi
2.2.3 Khảo sát các ñiều kiện tối ưu ñể thu nhận bột trùn quế tự phân 50

2.2.3.1 Xác ñịnh pH thích hợp cho quá trình tự phân 50
2.2.3.2 Xác ñịnh dung dịch thích hợp bổ sung cho quá trình tự phân 50
2.2.3.3 Xác ñịnh tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình tự phân 50
2.2.3.4 Xác ñịnh nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình tự phân 51
2.2.3.5 Xác ñịnh thời gian tự phân thích hợp 51
2.2.3.6 Khảo sát sự tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian 52
2.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế 53
tự phân
2.2.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá 54
khả năng sử dụng bột trùn quế tự phân
2.2.4.1 Phối chế thức ăn 54
2.2.4.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 54
tự phân lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú
2.2.4.3 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 55
tự phân lên tỷ lệ sống, tăng trưởng và chất lượng của hậu ấu trùng tôm sú
2.3 Phương pháp xử lý số liệu 56

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57
3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân 57
3.1.1 Thành phần nguyên liệu 57
3.1.2 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế 58
3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 58
3.1.4 Xác ñịnh ñiểm ñẳng ñiện protease trùn quế tự phân 59
3.1.5 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 60
3.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease 60
trùn quế tự phân
3.2.1 Thu nhận bằng phương pháp tủa thích hợpdịch tự phân trùn quế 60
3.2.2 Tinh sạch protease trùn quế tự phân bằng kỹ thuật sắc ký, ñiện di 62
vii
3.2.1.1 Sắc ký trao ñổi ion trên gel Unosphere Q 63

3.2.1.2 Sắc ký tương tác kỵ nước trên gel Phenyl sepharose 65
3.2.1.3 Sắc ký lọc gel trên cột Superose 12 66
3.2.3 Khảo sát ñặc tính hóa học các protease tinh sạch từ trùn quế tự phân 71
3.2.3.1 Tỷ lệ thu hồi mẫu và xác ñịnh hoạt tính các phân ñoạn protese 71
trên các cơ chất khác nhau
3.2.3.2 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease 73
3.2.3.3 Nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt 74
3.2.3.4 pH tối ưu và ñộ bền pH 75
3.2.3.5 ðộ bền các protease sau tinh sạch theo thời gian 76
3.2.3.6 Kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrinogen bằng ñiện di SDS-PAGE77
3.2.3.7 ðiểm ñẳng ñiện các protese sau tinh sạch 79
3.2.3.8 Phân tích các protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật 80
MALDI-TOF-TOF
3.3. Khảo sát các các ñiều kiện tối ưu ñể thu nhận bột trùn quế tự phân 83
3.3.1 Khảo sát pH thích hợp cho quá trình tự phân 83
3.3.2 Khảo sát loại dung dịch thích hợp cho quá trình tự phân 84
3.3.3 Khảo sát tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình tự phân 85
3.3.4 Khảo sát nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình tự phân 87
3.3.5 Khảo sát thời gian tự phân trùn quế thích hợp 89
3.3.6 Khảo sát sự tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian 91
3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế thủy phân 92
3.3.7.1 Khảo sát các chế ñộ sấy ảnh hưởng ñến chất lượng bột ñạm 92
3.3.7.2 Kết quả phân tích thành phần amino acid của bột trùn quế tự phân
và trùn quế chưa thủy phân 93
3.3.7.3 Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật bột trùn quế tự phân 95
3.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá khả năng 95
sử dụng sản phẩm bột trùn quế thủy phân
3.4.1 Thành phần hóa học các loại thức ăn sử dụng ñể ương ấu trùng và hậu 95
viii
ấu trùng tôm sú

3.4.2 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú 98
3.4.2.1 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 98
tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú
3.4.2.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 103
tỷ lệ sống và tăng trưởng của hậu ấu trùng tôm sú
3.4.3 So sánh hiệu quả kinh tế giữa thức ăn chế biến từ bột trùn quế thủy phân và
thức ăn ngoại nhập 107

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
4.1 Kết luận 109
4.2 ðề nghị 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI 122
PHỤ LỤC 1 123
PHỤ LỤC 2 139
PHỤ LỤC 3 151
PHỤ LỤC 4 160












xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tựa hình Trang

1.1 Trùn quế (Perionyx excavatus) 3
1.2 Sơ ñồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 9
1.3 Hình dạng và gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 10
1.4 Mô hình phân tử fibrinogen 11
1.5 Cấu trúc phân tử fibrinogen 12
1.6 Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo fibrin 13
1.7 Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin 14
1.8 Quy trình lập bản ñồ phân tích protein theo phương pháp phổ 29
khối lượng
1.9 Vòng ñời của tôm sú 33
2.1 Sơ ñồ các bước thí nghiệm hệ protease trùn quế 49
3.1 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế theo thời gian tự thủy phân 58
3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ, pH lên hoạt tính protease trùn quế 59
3.3 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế 60
3.4 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế tủa sơ bộ bằng AS bão hòa và aceton .61
3.5 Sắc ký ñồ trên cột DEAE-Cellulose dung dịch enzyme thô 63
3.6 Sắc ký trên cột Unosphere Q dung dịch enzyme thô 64
3.7 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột trao ñổi ion 64
3.8 Sắc ký ñồ tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose 65
3.9 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột tương tác kỵ nước 66
3.10 Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 các tiểu phân ñoạn 67
3.11 ðiện di ñồ SDS-PAGE các phân ñoạn sau lọc gel 68
3.12 Quy trình tinh sạch enzyme protease trùn quế 70
3.13 Hoạt tính thủy phân trên ñĩa fibrin các phân ñoạn enzyme tinh sạch 72
xiv

3.14 A. Nhiệt ñộ tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 74
B. ðộ bền nhiệt các phân ñoạn sau khi tinh sạch 74
3.15 A. pH tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
B. ðộ bền pH các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
3.16 A. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong dung dich 77
ñệm Na-pp pH 7,5
B. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong nước cất 77
3.17 ðiện di SDS-PAGE khả năng thủy phân fibrinogen các protease 78
sau khi tinh sạch ở các thời ñiểm khác nhau
3.18 ðiện di hai chiều các phân ñoạn protease sau tinh sạch 79
3.19 So sánh trình tự amino acid FIII-1 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.20 So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.21 Biểu ñồ ảnh hưởng của pH ñến quá trình tự phân trùn quế 84
3.22 Biểu ñồ ảnh hưởng loại dung dịch ñến quá trình tự phân trùn quế 85
3.23 Biểu ñồ ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng trùn quế ñến quá trình tự phân 86
3.24 Dịch trùn quế chưa thủy phân ở các hàm lượng protein khác nhau 87
3.25 Dịch trùn quế ở các hàm lượng protein khác nhau sau 24 giờ tự phân 87
3.26 Biểu ñồ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình tự phân trùn quế 88
3.27 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến hàm lượng ñạm amine và ammoniac 89
trong quá trình tự phân trùn quế
3.28 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 90
3.29 ðiện di ñồ tiến trình tự phân protein trùn quế 91
3.30 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 92
3.31 Bột trùn quế tự phân sấy bằng các chế ñộ khác nhau 93
3.32 Các loại thức ăn Frippak, thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 97
và chưa thủy phân
xv
3.33 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn ấu trùng 100
3.34 Biểu ñồ chiều dài của ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 101
3.35 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng 104

3.36 Biểu ñồ chiều dài của hậu ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 105
3.37 Biểu ñồ tỷ lệ sống của hậu ấu trùng khi sốc formol 106






ix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AS: Ammonium Sulphate
BApNA: Nα-benzoyl-arginine p-nitroanilide
BTpNA: Nα-benzoyl-tyrosine p-nitroanilide
BSA : Bovin Serum albumin
DEAE: diethylaminoethyl
DTE: 1,4-dithioerythritol
DTT: 1,4-dithiothreitol
EC: Enzyme Classification
EDTA: Ethylen diamine tetraacetic acid
EGTA:
Ethyleneglycol O,O’ bis(2- amino ethyl) NNN’N’ tetra acetic acid
ESI: Electrospray Ionisation
HUFA: Highly Unsaturated Fatty Acids
IEF : Isoelectric electrophoresis focus
IPG : Immobile pH gradient
IUBMB: International Union of Biochemistry and Molecular Biology
LB: Luria Broth
M1: Mysis-1
M3: Mysis-3

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
MS: Mass spectrometry
MS-MS: Tandem mass spectrometry
N1: Nauplius-1
N6: Nauplius-6
NRDB: Non-redundant protein sequence database
OPA: ortho-phthaldialdehyde
PL-1: Postlarvae-1
PL-10: Postlarvae-10
x
PL-15: Postlarvae-15
PL-45: Postlarvae-45
PMSF : Phenylmethyl Sulfonyl Flouride
Q : Quaternary amine
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis
SBTI: Soybean trypsin inhibtor
TACB: Thức ăn chế biến
TEMED : N, N, N’, N’-tera methyl ethylene diamine
TLCK: N-torsyl-L-lysine chloromethyl keton
TNBS : Trinitro-benzene sulfonic acid
TOF : Time of fly
TPCK: N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl keton
Tris : Tris-[hydroxymethyl]aminomethane
tPA : tisue plasminogen activator
uPA: urokinase plasminogen activator
Z1: Zoea-1
Z3: Zoea-3

xi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tựa bảng Trang

1.1 Một số serine protease thông dụng hiện nay 8
1.2 Nguyên tắc các phương pháp xác ñịnh hiệu suất thủy phân 20
1.3 Các chất ức chế protease thông dụng 24
1.4 Tác nhân tủa protein thông dụng 25
1.5 Tính chất enzyme cắt chuyên biệt phân giải protein trong phân tích MS 30
3.1 Thành phần hóa học của trùn quế 57
3.2 Hoat ñộ tổng ở các pH khác nhau sau khi thu hồi tủa 60
3.3 Tổng kết tủa sơ bộ dịch thủy phân trùn quế 62
3.4 Tổng kết các bước tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký 69
3.5 Xác ñịnh hoạt ñộ các phân ñoạn protease trên các cơ chất khác nhau 71
3.6 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính các phân ñoạn enzyme 73
trùn quế sau tinh sạch
3.7 Khối lượng phân tử và ñiểm ñẳng ñiện các protease tinh sạch xác ñịnh 80
bằng phần mềm PD Quest
3.8 Các chỉ tiêu bột trùn quế tự phân sấy bằng các chế ñộ khác nhau 92
3.9 Hàm lượng amino acid (%) trong bột trùn quế chưa thủy phân và 94
bột trùn quế tự phân sấy phun

3.10 Kết quả kiểm nghiệm vi sinh bột trùn quế tự phân sấy phun 95
3.11 Thành phần hóa học các loại thức ăn sử dụng ñể ương ấu trùng 96
và hậu ấu trùng tôm sú
3.12 Biến ñộng một số yếu tố môi trường trong thời gian nuôi ấu trùng tôm sú . 98
3.13 Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn ấu trùng theo các nghiệm thức 99
3.14 Chiều dài (mm) các giai ñoạn ấu trùng tôm sú 102
3.15 Biến ñộng một số yếu tố môi trường trong thời gian nuôi hậu ấu trùng 103
tôm sú
xii
3.16 Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng theo các nghiệm thức 103
3.17 Chiều dài (mm) các giai ñoạn hậu ấu trùng tôm sú 104
3.18 Tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol 106
3.19 Chi phí nguyên liệu ñể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế 107
tự phân
3.20 Chi phí ñể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 108
3.21 Bảng giá tham khảo các loại thức ăn trên thị trường 108












xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tựa hình Trang

1.1 Trùn quế (Perionyx excavatus) 3
1.2 Sơ ñồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 9
1.3 Hình dạng và gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 10
1.4 Mô hình phân tử fibrinogen 11
1.5 Cấu trúc phân tử fibrinogen 12
1.6 Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo fibrin 13
1.7 Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin 14
1.8 Quy trình lập bản ñồ phân tích protein theo phương pháp phổ 29
khối lượng
1.9 Vòng ñời của tôm sú 33
2.1 Sơ ñồ các bước thí nghiệm hệ protease trùn quế 49
3.1 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế theo thời gian tự thủy phân 58
3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ, pH lên hoạt tính protease trùn quế 59
3.3 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế 60
3.4 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế tủa sơ bộ bằng AS bão hòa và aceton .61
3.5 Sắc ký ñồ trên cột DEAE-Cellulose dung dịch enzyme thô 63
3.6 Sắc ký trên cột Unosphere Q dung dịch enzyme thô 64
3.7 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột trao ñổi ion 64
3.8 Sắc ký ñồ tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose 65
3.9 ðiện di ñồ các phân ñoạn sắc ký qua cột tương tác kỵ nước 66
3.10 Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 các tiểu phân ñoạn 67
3.11 ðiện di ñồ SDS-PAGE các phân ñoạn sau lọc gel 68
3.12 Quy trình tinh sạch enzyme protease trùn quế 70
3.13 Hoạt tính thủy phân trên ñĩa fibrin các phân ñoạn enzyme tinh sạch 72
xiv

3.14 A. Nhiệt ñộ tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 74

B. ðộ bền nhiệt các phân ñoạn sau khi tinh sạch 74
3.15 A. pH tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
B. ðộ bền pH các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
3.16 A. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong dung dich 77
ñệm Na-pp pH 7,5
B. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong nước cất 77
3.17 ðiện di SDS-PAGE khả năng thủy phân fibrinogen các protease 78
sau khi tinh sạch ở các thời ñiểm khác nhau
3.18 ðiện di hai chiều các phân ñoạn protease sau tinh sạch 79
3.19 So sánh trình tự amino acid FIII-1 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.20 So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.21 Biểu ñồ ảnh hưởng của pH ñến quá trình tự phân trùn quế 84
3.22 Biểu ñồ ảnh hưởng loại dung dịch ñến quá trình tự phân trùn quế 85
3.23 Biểu ñồ ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng trùn quế ñến quá trình tự phân 86
3.24 Dịch trùn quế chưa thủy phân ở các hàm lượng protein khác nhau 87
3.25 Dịch trùn quế ở các hàm lượng protein khác nhau sau 24 giờ tự phân 87
3.26 Biểu ñồ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình tự phân trùn quế 88
3.27 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến hàm lượng ñạm amine và ammoniac 89
trong quá trình tự phân trùn quế
3.28 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 90
3.29 ðiện di ñồ tiến trình tự phân protein trùn quế 91
3.30 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 92
3.31 Bột trùn quế tự phân sấy bằng các chế ñộ khác nhau 93
3.32 Các loại thức ăn Frippak, thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 97
và chưa thủy phân
xv
3.33 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn ấu trùng 100
3.34 Biểu ñồ chiều dài của ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 101
3.35 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng 104
3.36 Biểu ñồ chiều dài của hậu ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 105

3.37 Biểu ñồ tỷ lệ sống của hậu ấu trùng khi sốc formol 106






1
MỞ ðẦU
Ở Việt Nam trùn ñất ñã ñược các thầy thuốc ðông y sử dụng chữa các bệnh cảm hàn, sốt
rét ở dạng sao tẩm, phơi khô và dưới dạng tán nhỏ, ñóng viên nang như Doragon, Cao
ðịa Long từ loài trùn ñất Pheretima aspergillum và một số loài Pheretima khác. Tác
dụng chủ yếu các loại thuốc này là tăng cường và bồi bổ sức khỏe cho người ốm yếu và
ñiều trị tăng huyết áp lâu dài [33]. Các hoạt chất sinh học trong trùn ñất cho ñến nay
chưa ñược nghiên cứu nhiều [1], cơ sở khoa học của các loại thuốc từ trùn ñất chưa ñược
chứng minh cụ thể.
Hiện nay trên thế giới ñặc biệt là Trung quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc rất quan tâm ñến
hoạt chất enzyme thủy phân fibrin có tên Lumbrokinase từ các loài trùn ñất Lumbricus
rubellus [56], [82] và Eisenia fetida [112], ñặc ñiểm chung của enzyme này rất bền nhiệt
và chịu ñược pH kiềm. Với các ưu ñiểm của lumbrokinase, các nhà nghiên cứu Việt
Nam bước ñầu ñã tiến hành xác ñịnh hoạt tính thủy phân fibrin tách từ một số loài trùn
ñất ở phía Bắc Việt Nam, hoạt tính này cao nhất ở loài trùn quế (Perionyx excavatus).
Tiếp ñó là tinh sạch và khảo sát một số tính chất của enzyme thủy phân fibrin của dịch
chiết thô từ loài trùn này [34], [35].
Trong những năm gần ñây, nghề nuôi trùn quế phát triển ở các vùng lân cận Thành phố
Hồ Chí Minh và một số tỉnh ñồng bằng sông Cửu Long. ðây là ñối tượng dễ nuôi, chóng
lớn, mắn ñẻ, dễ thu hoạch. ðặc biệt trùn quế có hàm lượng protein rất cao (chiếm 68-
70% so với vật chất khô) nên ñây là nguồn bổ sung ñạm quý giá cho gia súc, gia cầm,
thủy hải sản và ñã ñược ñưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ.
Các khảo sát ban ñầu cho thấy hệ protease trong loài trùn quế nuôi công nghiệp cũng có

khả năng thủy phân mạnh fibrin, chịu nhiệt và bền với pH kiềm cao, ñặc biệt có khả
năng tự phân giải chính protein của nó tạo ra sản phẩm giàu ñạm amin. Vì vậy ñể nâng
cao giá trị sử dụng từ trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng, ñề tài “Nghiên cứu hệ
protease trùn quế trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng” ñược tiến hành
nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng trùn quế trong ñiều trị bệnh và bồi bổ sức
khỏe, ñồng thời tạo ra chế phẩm bột ñạm nuôi ấu trùng tôm sú ñể nâng cao giá trị thương
2
mại của loài trùn ñất nuôi công nghiệp này góp phần mở rộng và phát triển mô hình nuôi
trùn quế phục vụ trong y dược học và nuôi trồng thủy sản, cải thiện cuộc sống của người
dân vùng ñồng bằng sông Cửu Long.
Mục tiêu ñề tài
Nghiên cứu hệ protease trùn quế trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng của
chúng.
Nội dung nghiên cứu ñề tài:
1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân.
2. Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease trong trùn quế
tự phân.
3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tự phân trùn quế.
4. Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá hiệu quả của sản phẩm
tự phân trùn quế.
Những ñiểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án :
1. Luận án ñã nghiên cứu hoàn chỉnh hệ protease trùn quế (Perionyx excavatus) trong
quá trình tự phân từ khâu chiết tách, tinh sạch, khảo sát ñặc ñiểm hóa học của hệ enzyme
này ñến việc so sánh trình tự amino acid với lumbrokinase từ các loài trùn ñất khác ñã
ñược nghiên cứu trên thế giới.
2. Nghiên cứu tận dụng nguồn protease trùn quế ñể thủy phân chính nguồn ñạm của nó
ñể tạo ra sản phẩm bột ñạm chất lượng cao dùng nuôi thử nghiệm tôm sú giai ñoạn ấu
trùng và hậu ấu trùng ñạt kết quả rất khả quan.
3. Kết quả của luận án là cơ sở cho các nghiên cứu cơ bản về enzyme nói chung ñặc biệt
nhóm serine protease ñược áp dụng trong y dược. Trùn quế ñược xem là nguồn protease

có gía trị ñể khai thác và nghiên cứu sâu hơn ñể có thể ứng dụng trong ñiều trị bệnh tim
mạch. Sản phẩm bột ñạm tự phân từ trùn quế còn là nguồn protein dễ tiêu hóa cho các
loài ñộng vật non.


3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Trùn quế
1.1.1 ðặc tính sinh lý học:
Trùn quế thuộc:
Ngành: Giun ñốt (Annelida). Ngành phụ: Có ñai sinh dục (Clillata).
Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta). Họ: Megascolecidae.
Tên khoa học: Perionyx excavatus.








Hình 1.1: Trùn quế (Perionyx excavatus)
Trùn quế có kích thước tương ñối nhỏ, con trưởng thành dài khoảng 10 - 15 cm, thân hơi
dẹt, màu từ ñỏ ñến mận chín, có ánh kim, nhạt dần về phía bụng, hai ñầu hơi nhọn. Trùn
quế có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều ñốt, trên mỗi ñốt có một vành tơ.
Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu O
2
và thải CO
2
trong môi trường

nước nên có khả năng tồn tại trong nước một thời gian vài tháng.
Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, ñai và các lỗ sinh dục lệch về phía ñầu cơ thể, có thể
giao phối chéo với nhau ñể hình thành kén. Sau 14 - 21 ngày mỗi kén nở cho 2 - 10 trùn
con màu trắng, sau 5 - 7 ngày có màu hồng và ñỏ dần.
Về thành phần hóa học của trùn quế gồm nước chiếm khoảng 80 - 85%, chất khô khoảng
15 - 20%. Hàm lượng các chất khô (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 -
70%, lipid: 7 - 8%, chất ñường: 12 -14 %, tro: 11 - 12% [47].

4
Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, ấm áp, yên tĩnh. Chúng sợ ánh sáng, nhiệt ñộ cao, tiếng
ñộng, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi. Nhiệt ñộ thích hợp từ 20 - 30°C, ẩm ñộ 75-
80%, pH 7,0 - 7,5. Ở nhiệt ñộ khoảng 30°C và ñộ ẩm thích hợp trùn quế sinh trưởng và
sinh sản rất nhanh.
Thức ăn của trùn là các loại phân gia súc, gia cầm, rác ñang phân hủy… trong ñó phân
bò tươi và phân trâu tươi là món ăn thích hợp nhất. Mỗi ngày trùn quế tiêu thụ lượng
thức ăn tương ñương với trọng lượng cơ thể của nó [48].
1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng
Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn ñất ñược dùng trong một số bài thuốc chữa sốt rét,
sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não [33]. Trùn quế còn
chứa enzyme có thể thủy phân ñặc hiệu fibrin với hoạt tính xúc tác rất cao, có triển vọng
khai thác làm thuốc ñiều trị những căn bệnh ñột quỵ, tim mạch [35].
Hiện nay các tỉnh phía Nam và ñồng bằng sông Cửu Long ñã bắt ñầu nuôi trùn quế với
quy mô lớn, nguồn thức ăn chủ yếu lấy từ phân bò, trâu [48]. Một số nghiên cứu sử dụng
trùn ñất làm thức ăn bổ sung cho gà góp phần nâng cao hiệu suất nuôi gà thả vườn cho
các hộ nông dân [2], hoặc sử dụng trùn quế ñể sản xuất chế phẩm sinh học dùng trong
nông nghiệp[14]. Ngoài ra, nông dân các tỉnh miền Tây sử dụng thêm nguồn thức ăn trực
tiếp từ trùn quế giàu ñạm ñể bổ sung thêm khẩu phần dinh dưỡng cho các loại tôm cá
vừa qua giai ñoạn ấu trùng, hoặc khôi phục sức khỏe vật nuôi sau dịch bệnh. Ở các nước
Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc ñã nghiên cứu thành công enzyme
thủy phân fibrin từ các loài trùn ñất Lumbricus rubellus [55], [80] và Eisenia fetida

[102]. Trình tự nucleotide của gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin
cao cũng ñược nghiên cứu nhằm tiến tới việc chủ ñộng sinh tổng hợp enzyme này bằng
con ñường tái tổ hợp [57], [103]. Trên thế giới ñã có hai sản phẩm thuốc chữa bệnh tim
mạch từ trùn ñất là Lumbrokinase và Boluoke.
Một hướng nghiên cứu khác về sự ổn ñịnh và ứng dụng các serine protease của loài trùn
Lumbricus rubellus. Kết quả cho thấy các enzyme này ổn ñịnh trong dung dịch ñệm
Tris-HCl 100 mM trong thời gian 5 năm ở nhiệt ñộ phòng và có khả năng chịu ñựng các
dung môi hữu cơ tốt, kể cả toluen và n-hexane. Chúng có thể thủy phân nhiều cơ chất
5
protein khác nhau như elastin, hemoglobin, fibrin, casein, collagen, albumin và keratin
và ñặc biệt là thủy phân chính protein của loài trùn ñất này và tạo ra dung dịch ñạm có
thành phần tương tự nước tương và ứng dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật [45].
Ở Úc, nghiên cứu sử dụng ñạm từ thịt trùn thay thế thịt cá cho việc nuôi loại tôm hùm
nhỏ, kết quả hoàn toàn không làm giảm tỉ lệ tăng trưởng của tôm [69]. Ở Trung Quốc
một số nghiên cứu ứng dụng trùn làm thức ăn cho gà con hoặc dùng trong y học [105]. Ở
Nigeria ñã nghiên cứu sử dụng 25% protein trùn ñất thay thế vào thức ăn nuôi cá hồi nhỏ
Heterobranchus longifilis ñạt kết quả tốt cả về môi trường nước và tốc ñộ sinh trưởng
của cá [99]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu về thức ăn cho trùn ñất như bổ sung protein,
acid béo nhằm thu ñược hiệu suất tạo sinh khối và phân trùn cao là một trong những
nghiên cứu nằm trong dự án lớn RIRDC của Chính phủ Úc [64].
Từ việc khảo sát, tập hợp các tài liệu nghiên cứu ứng dụng của trùn ñất nói chung và
trùn quế nói riêng ở trong và ngoài nước cho thấy hiện nay các tỉnh ðông Nam Bộ và
ðồng Bằng sông Cửu Long trùn quế ñang ñược nuôi rộng rãi tại các vùng chăn nuôi bò
với một sản lượng lớn nhưng gặp khó khăn trong quá trình bảo quản và vận chuyển nên
khả năng tiêu thụ chúng còn hạn chế. Nhằm làm tăng thêm giá trị sử dụng trùn quế cần
khai thác thêm một số ứng dụng khác nữa một khi ñã tìm hiểu rõ hơn về hệ enzyme trong
loài trùn ñất này .
1. 2 Hệ protease và các nghiên cứu ứng dụng
Protease là nhóm enzyme ñược ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,

công nghiệp sản xuất xà phòng. Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác
nhau như thực vật, ñộng vật và vi sinh vật.
Trong chế biến thực phẩm: sử dụng nhiều nhất ñể cải tiến công nghệ sản xuất nước
mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu ñậu nành bằng việc bổ sung
protease từ giai ñoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ ñu ñủ xanh, vỏ dứa, ruột cá, ruột lợn ñến
giai ñoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme thêm vào quá trình thủy phân như chế phẩm
bromelain [7], [20], [54], papain [11], [94], [96], ficin [49], chế phẩm protease từ nấm
mốc A.oryzae [10], [40], vi khuẩn Bacillus subtilis S5 [3], [36] hoặc nấm sợi [37] và cả
6
các chế phẩm protease từ ñầu tôm [5], [8]. Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ
sung thêm protease vào cá thì hàm lượng ñạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh
hơn nên rút ngắn ñược thời gian chế biến nước mắm.
Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột ñạm cao cấp cho trẻ em và người lớn tuổi già
từ bột ñậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain ñể cải biến kích thước
phân tử protein và xử lý các protein ức chế tiêu hóa có sẵn trong nguyên liệu [6], hoặc sử
dụng các protease thương mại Alcalase, Novozym, Flavourzyme thủy phân bột ñậu nành
tách béo nhằm làm tăng hàm lượng amino acid tự do ñạt hiệu suất thủy phân cao và rút
ngắn thời gian thủy phân làm giảm thiểu sự hoạt ñộng vi sinh vật [70]. Ngoài ra enzyme
protease còn ñược sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làm phomat
[32], làm mềm thịt,…
Trong y học : một số protease như trypsin, α-chymotrypsin dùng sản xuất thuốc chữa
bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông ñường hô hấp rất thông dụng trên thị
trường dược phẩm. Nghiên cứu chế phẩm protease có tên gọi “prozimabo” trong ñiều trị
bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng nhanh khỏi [5]. ðặc biệt hiện nay protease ñược
ứng dụng trong ñiều trị bệnh tim mạch, chúng rất ña dạng và có nguồn gốc khác nhau: từ
ñộng vật [56], [62], [63], [81], [82], [112], thực vật [58], [74], ñến vi sinh vật [51], [75],
[60], [114], [107], chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân fibrin,
fibrinogen.
Trong nông nghiệp: protease ñược bổ sung vào thức ăn cho ñộng vật nuôi nhằm tăng
khả năng tiêu hóa, chúng ñược xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử dụng hoặc xử lý

sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp protease và các enzyme
thủy phân khác cũng ñược sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu
hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường nước nuôi [13, [17], [21].
Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác như công nghiệp
thuộc da ñể làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không ảnh
hưởng ñến chất lượng da [83]. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng
tẩy vết bẩn có thành phần là protein [95], [97].