Bài giảng kỹ thuật FISH

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM
HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM
MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
PGS. TS. TrÇn ThÞ Thanh H¬ng


•
DTBS: 2,7% tổng số đẻ
•
Ng/nhân: ĐB gen, ĐB NST
TVDT &
TVDT &
CĐTS
CĐTS
•
Thu thập mẫu:
TB ối
TB ối, tua rau, máu cuống rốn,
sinh thiết thai, TB thai tự do trong máu mẹ
•
KT phát hiện:
–
DT tế bào: phân tích NST  tiêu chuẩn C§RLNST
–
DT phân tử
–
DT tế bào – phân tử

CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN
THU THẬP MẪU:
-

Chọc ối
Chọc ối
-
Sinh thiết rau
-
Máu cuống rốn
-
Soi phôi thai
-
ADN tự do máu mẹ
DTTB
- phân tích NST băng G
DTPT: PCR, Sequencing,
Southerblot, Northerblot
DTTB – PT: FISH
Tiêu chuẩn phát
hiện ĐB NST
phát hiện
BĐ gen
Phát hiện ĐB
NST: SL, RL nhỏ

Các loại ADN dò
ADN dß ph?n
tâm

ADN dß đ?u
mút
ADN dß t?
ch?c h?ch
nhân
ADN dß l?p đ?c
hi?u trên băng R
ADN dß
toànb? NST
ADN dß đ?c hi?u
nhánh NST
ADN dß đ?c hi?u locus

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH

THẾ GIỚI
•
1969 bắt đầu,
1980 đầu dò huỳnh quang
Thập kỷ 90 ứng dụng rộng rãi
•
Phát hiện trước sinh các RL
NST:HC Down, Edward,
Patau, Turner
•
Mất đoạn nhỏ <3Mb
•
RL đầu mút & gần đầu mút

VIỆT NAM

•
2003 B.V.M.Hoàng-T/p
HCM: áp dụng CĐTS
•
2004 BM YSH – DT
ĐHYHN: hoàn chỉnh,
CĐTS HC Down
•
2007 viện HH-TM: CĐ
leceumia
DTTB khó hoặc
không thể phát hiện

1
Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên
nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y
2
Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước
sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y
3
Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối
loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X


Môc tiªu 1
§Çu dß ADN
13, 18, 21, X, Y:
+ 3 m u i: 15-18ẫ ố
w
+ 3 m u i: 28-32ẫ ố

w
Môc tiªu 2 Môc tiªu 3
§Çu dß ADN
TelXp/Yp &
TelXq/Yq:
3 m u i: 15-18ẫ ố
w
73
73
thai
thai
phụ
phụ


Dị dạng chi,
Dị dạng chi,
nội quan
nội quan

Siêu âm (+):
Siêu âm (+):
Nang BH
Nang BH
D
D
ày da gáy
ày da gáy


Triple test (+) hoặc (-)
Triple test (+) hoặc (-)
C n KQ FISH ầ 
đ i chi u:ố ế
+ 2 b nh nh©n:ệ
RLCT NST 21, X
+ 1 m u i RLCT ẫ ố
NST 13
C n KQ FISH ầ 
chÈn ®o¸n:
+ 2 b nh nh©n: ệ
NST marker
+ 1 trÎ nam 46,XX

Lấy mẫu – làm tiêu bản
Lấy mẫu – làm tiêu bản
nhân TB gian kỳ
nhân TB gian kỳ
Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm
Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm
tiêu bản NST kỳ giữa
tiêu bản NST kỳ giữa
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
Biến tính ADN
Biến tính ADN
Lai ADN dò và ADN đích
Lai ADN dò và ADN đích
Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang
Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang
Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang
(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)
(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)

1. Lµm tiªu b¶n TB èi ë gian
kú ho c nuặ ôi c y l m tiấ à ªu
b n NST k gi aả ỳ ữ
2. BiÕn tÝnh ADN dß vµ ADN
®Ých cña m u XNẫ
3. Lai ADN dß víi ADN ®Ých
cña thai (20-24h)
5. Ph©n tÝch d6íi KHV huúnh
quang t×m tÝn hiÖu lai





Kết quả
Kết quả
sau 2-3 ngày
sau 2-3 ngày
4. Nhu m m u lai b ng ộ ẫ ằ
thu c nhu m huúnh quangố ộ
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)

§Çu dß ADN

13, 18, 21, X, Y
 !"
 !"
Phin läc Aqua
Phin läc orange
Phin läc orange
Phin läc green
Phin läc green
§Çu dß ADN
Tel Xp/Yp
(TTAGGG)n
Telomere
ADN
§Çu dß ADN TelXp
Phin läc green


Không đánh giá vì hai
tế bào chồng lên nhau

Đếm là 2 tín hiệu lai,
1 tín hiệu bị khuếch tán

Không đánh giá vì các
tế bào chồng lên nhau

Đếm là 2 tín hiệu lai,
1 tín hiệu bị chia nhỏ

Đếm là 3 tín hiệu lai


Đếm là 4 tín hiệu lai

Đếm là 3 tín hiệu lai,
1 tín hiệu bị chia nhỏ
#$%&'())*
#$%&'())*

T vÊn DT Theo dâi –
QT mang thai, sau sinh
XN: DTTB ph©n tÝch NST–
KT FISH
TV di truyÒn S¶n khoa–
Chäc èi C§ tríc sinh–
SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS
SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS
+, /0
X§ thai phô nguy c¬ cao
sinh con bÊt thêng NST
Thai phô ≥ 35 tuæi
TS sinh con DT
XN triple test
AFP, HCG, uE
3
Siªu ©m

12 -34567/-
82 "945:);<
; =)>)? @)
A2 "945:);<

>)?;?B)

Bảng 1. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với
đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳ
 ẫ

KẾT QUẢ FISH


   !    "  #
1
     $ %""
2
!      %"#
3
!      %"#
4
!     $ %""&!
5
$      %"#%&
6
      %"#
12-34567/-

HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG
•
Thể tích dịch ối:
–
Thai 15-18
w

: 5ml
–
Thai 28-32
w
: 10ml
•
Xử lý nhân TB
–
Loại trừ máu mẹ (nếu lẫn)
–
Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thai
•
Biến tính ADN: 73
0
C x 3’
•
Lai ADN dò và ADN đích:
–
thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
–
Thời gian lai 20-22
h
•
Phân tích tín hiệu lai
–
Tín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước
ổn định
–
Tín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước không
ổn định

Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thường
Đầu dò ADN 13, 21
NST 21
NST 21
NST 13
NST 13
Đầu dò ADN 18, X, Y
NST 18
NST 18
NST X
NST Y

C; =)
Đầu dò ADN 13, 21
NST 21
NST 21
NST 13
NST 13
Đầu dò ADN 18, X, Y
NST X
NST X
NST 18
NST 18
Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bình thường

Bảng 2. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH
với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và

Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa





ả
ả

 !
Đ"#$%#&%'#%(%)
Đ"
*(+,)+
Đ"
*(,)
 

 
!
 

 
"
 
#
"' #' " #
#
15 2 2 2 2 0 2 0 2 0 46, XX
'
15 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY

$
18 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY

HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG
•
Thu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt thanh,
carnoy
•
Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng
cồn 70%/2’, 80%/2’, 100%/2’.
•
Biến tính ADN: 73
0
C x 5’
•
Lai ADN dò và ADN đích:
–
thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
–
Thời gian lai 42
0
C: 20-22
h
(13, 18, 21, X, Y)
22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq)
•
Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST 
đánh giá dễ hơn nhân gian kỳ

Đầu dò Telq/Yq trên NST kỳ

giữa của thai nam bình thường
TelYq
TelXq
Đầu dò TelXp/Yp trên NST kỳ
giữa của thai nam bình thường
TelXp
TelYp

82"945:);<
; =)>)? @)
Kết quả chẩn đoán trước sinh một số bất thường NST

Kết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng Turner
Đối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chứng Turner
Sè l
îng

mÉu
ả()*
+, -
.( 
./0
123
 !  " #
-
./01
' ' ' # 2 -3%(
#4
./% +5 !  6% 7
789:;<=

' ' ' # 2 -3%(
#
>: =? ./% =6 
:@%ABC
' ' ' # 2 -3%(
#
./% +5 !  AMP,
TDMB
' ' '
#(92%)
'(8%)
2
-3%((92%),
-D%(((8%)

Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ
và karyotyp của thai hội chứng Turner
NST X
NST 18



NST 18



Sơ đồ đối chiếu kết quả siêu âm
nang bạch huyết với các bất thường NST