ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
PTN CƠNG NGHỆ NANO
NGUYỄN TRUNG THÀNH
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH
DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT
HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Thành phố Hồ Chí Minh - 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
PTN CƠNG NGHỆ NANO
NGUYỄN TRUNG THÀNH
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH
DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT
HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1
Chuyên ngành:
Vật liệu và Linh kiện Nanơ
(Chun ngành đào tạo thí điểm)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
Thành phố Hồ Chí Minh - 2014
i
Lời cảm ơn
Công sinh thành, dưỡng dục, trao trọn yêu thương không bờ bến, một đời của cha mẹ
để con có được những ngày hơm nay, con xin tạc dạ. Cảm ơn người!
Ơn dạy dỗ tận tâm của thầy cô khơng thể nào đền đáp, em xin ghi lịng. Em xin cảm
ơn!
Xin gửi tới thầy giáo, cán bộ hướng dẫn em đề tài luận văn này, PGS.TS Nguyễn
Tiến Thắng lời cảm ơn chân thành nhất. Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dành thời gian quý
giá của mình để đọc và sửa nội dung khoa học của bài luận này.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đặng Mậu Chiến. Một người thầy, người
quản lý tận tâm vì sự phát triển của sự nghiệp khoa học nước nhà.
Xin gửi tới Thạc Sỹ Phan Nhật Thanh Khoa lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Anh là một người thầy, một người anh chưa bao giờ thiếu nhiệt tình và tâm huyết giúp đỡ
tơi hồn thành luận văn này.
Cảm ơn Thạc sỹ Phạm Văn Bình, anh đã giúp tơi hiểu sâu hơn một số vấn đề liên
quan đến y sinh trong đề tài này.
Cảm ơn em Phạm Văn Thọ, các nghiên cứu viên, nhân viên của Phịng thí Nghiệm
Cơng nghệ Nano đã có những giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài ở LNT.
Chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Hội đồng bảo vệ luận văn này đã đọc,
phản biện giúp em hiểu rõ hơn những vấn đề chưa rõ.
Tôi cũng chân thành cảm ơn đề tài C2014-32-01 thực hiện tại PTN Công nghệ Nano,
Đai học Quốc gia Tp. HCM đã cho tôi cơ hội tham gia thực hiện nghiên cứu này.
Xin gửi lời chúc sức khoẻ, hạnh phúc tới quý thầy cô, anh chị và các bạn!
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014
Học viên cao học
Nguyễn Trung Thành
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn
Nguyễn Trung Thành
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
iii
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i
Lời cam đoan ....................................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. vii
Danh muc các bảng........................................................................................................... viii
Danh mục hình ảnh ............................................................................................................. ix
Mở đầu .............................................................................................................................. 01
1. Giới thiệu ...................................................................................................................... 01
2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài .................................................................................... 02
2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 02
2.2. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 02
3. Tóm tắt nội dung của đề tài ........................................................................................ 03
CHƢƠNG 1 ...................................................................................................................... 04
TỔNG QUAN
1.1. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ....................................................... 04
1.1.1. Cảm biến sinh học.......................................................................................... 04
1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học. ............................. 04
1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học ................. 05
1.1.1.3. Phân loại ........................................................................................... 06
1.1.2. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ............................................... 08
1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên
nguyên lý thanh dao động. .................................................................. 08
1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của cảm biến sinh học trên cơ
sở thanh dao động .......................................................................................... 10
1.2. Ung thƣ gan ............................................................................................................... 11
1.2.1. Thực trạng bệnh nhân ung thư gan trên thế giới ........................................... 14
1.2.2. Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư gan ................................... 16
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
iv
1.2.2.1. Phòng tránh bệnh ung thư gan .......................................................... 16
1.2.2.2. Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan ................................ 17
1.2.2.3. Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan ............................... 18
1.2.3. Hệ kháng thể-kháng nguyên .......................................................................... 20
1.2.4. Chất chỉ thị ung thư gan ............................................................................... 22
1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP .............................................................................. 22
1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1 ........................................................................... 23
1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong
việc phát hiện ung thƣ gan .............................................................................................. 24
1.3.1 Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ...................................................................... 24
1.3.2. Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx ................................................................. 25
1.3.2.1 Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx ................................... 25
1.3.2.2 Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 .................................. 26
1.3.2.2.1 Giới thiệu về plasma O2 ...................................................... 26
1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma ................................................ 26
1.3.2.2.3 Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx ............................ 29
1.4 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh
dao động............................................................................................................................ 29
1.4.1. Đánh giá các bước biến đổi bề mặt ................................................................ 29
1.4.1.1. Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang .............................................. 29
1.4.1.2 Phương pháp đo góc tiếp xúc .......................................................... 30
1.4.1.3. Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP ........................ 33
1.4.2. Phương pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học
................................................................................................................................... 33
CHƢƠNG 2 ...................................................................................................................... 36
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1.
Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động ....................................................... 36
2.1.1. Quy trình xuất phát từ Au............................................................................ 36
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
v
2.1.1.1. Khảo sát trên wafer .......................................................................... 36
2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dị tìm AFP ..................... 37
2.1.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2 ...................................................... 39
2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx ......... 39
2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2.................................................. 43
2.1.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ............................................ 44
2.1.2.4. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với
GOPTS ........................................................................................................... 44
2.1.2.5. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với
APTES +GAD ............................................................................................... 44
2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dị tìm DKK1 .......................... 45
2.2 Các phƣơng pháp, thiết bị khảo sát và hoá chất sử dụng trong đề tài ................. 47
2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang ............................................................ 47
2.2.2. Máy đo góc tiếp xúc ..................................................................................... 48
2.2.3. Khảo sát bằng enzim HRP ............................................................................ 48
2.2.4. Đo độ lệch ..................................................................................................... 49
2.2.5. Các hoá chất sử dụng trong đề tài................................................................. 49
CHƢƠNG 3 ...................................................................................................................... 51
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ............................................ 51
3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD ...................................................................... 51
3.1.2 Khảo sát nồng độ GAD ................................................................................. 54
3.1.3 Đánh giá hiệu quả quy trình tối ưu thơng qua góc tiếp xúc ......................... 55
3.1.4 Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP ................................. 56
3.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO2 ................................................................ 57
3.2.1 Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 và bề mặt SiO2 ... 57
3.2.2. Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx bằng phương pháp xử lý plasma
oxy .......................................................................................................................... 58
3.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ....................................................... 59
3.2.3.1. Thời gian xử lý plasma ................................................................... 59
3.2.3.2. Ảnh hưởng của lưu lượng khí oxy.................................................. 61
3.2.3.3. Ảnh hưởng của cơng suất plasma ................................................... 64
3.2.3.4. Các thông số xử lý plasma tối ưu ................................................... 65
3.2.4. Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ưu ........ 66
3.2.5. Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề
mặt SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1 ...................................................... 68
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
vi
CHƢƠNG 4 ...................................................................................................................... 70
KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI
4.1. Kết luận .................................................................................................................... 70
4.2. Hướng phát triển của đề tài. ..................................................................................... 70
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 71
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Chữ viết tắt
AFP
Anti-AFP
Anti-DKK1
APTES
BSA
CAT
CCP
CT
DKK1
DNA
ELISA
FITC
F-LCA
GAD
GOPTS
GP73
HCC
HCV
HRP
ICP
IgA
IgD
IgE
IgG
IgM
LCA
LNT
MRI
PBS
RNA
SPR
UV-Vis
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Diễn giải
Alpha-fetoprotein
Anti-Alpha-fetoprotein
Anti-Dickkopf-1
3-Aminopropyl triethoxysilane
Bovine serum albumin
Computerized Axial Tomography
Capacitively coupled plasma
Computerized Tomography
Dickkopf-1
Deoxyribonucleic acid
Enzyme-linked immunosorbent assay
Fluorescein isothiocyanate
Fluorescein isothiocyanate-Lens culinaris agglutinin
Glutaraldehyde
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
Golgi Protein 73
Hepatocellular carcinoma
Hepatitis C
Horseradish peroxidase
Inductively Coupled Plasma
Immunoglobulin A
Immunoglobulin D
Immunoglobulin E
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
Lens culinaris agglutinin
Laboratory for Nanotechnology
Magnetic Resonance Imaging
Phosphate buffered saline
Ribonucleic acid
Surface plasmon reconance
Ultraviolet–visible spectroscopy
Nguyễn Trung Thành
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học. ......................................... 6
Bảng 2.2.1. Danh mục các hóa chất .................................................................................. 49
Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD. ..................................................................... 51
Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD. ................................................................................ 54
Bảng 3.1.3: Kết quả đo góc tiếp xúc nước. ....................................................................... 56
Bảng 3.2.1: Các thơng số của q trình xử lý plasma oxy ............................................... 58
Bảng 3.2.2: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy ...................................................... 60
Bảng 3.2.3: Các thơng số q trình xử lý plasma oxy ...................................................... 61
Bảng 3.2.4: Các thơng số q trình xử lý plasma oxy. ..................................................... 64
Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma oxy ..................................... 65
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
ix
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình ảnh
Trang
Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động khi đã nhận
kháng nguyên ..................................................................................................................... 01
Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên .......................................................................... 04
Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học. .................................................... 06
Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh học
và các chất phân tích riêng tương ứng. .............................................................................. 07
Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ
dày màng thay đổi.............................................................................................................. 08
Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt
độ thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao
động cộng hưởng khi thay đổi khối lượng ........................................................................ 09
Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất bề
mặt khác nhau. a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén. ............................................................. 09
Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống ...................................... 10
Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động ............................................. 10
Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư ........................................ 11
Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan .......................................................................... 12
Hình 1.2.3: Giai đoạn 2 của ung thư gan .......................................................................... 12
Hình 1.2.4: Giai đoạn 3 của ung thư gan .......................................................................... 13
Hình 1.2.5: Giai đoạn 4 của ung thư gan .......................................................................... 14
Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế giới trung
bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ.......................................................................... 14
Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng trên
thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới. ......................... 15
Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể ........................................................... 21
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
x
Hình 1.2.9: Bề mặt của kháng thể IgG. ............................................................................ 21
Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể. .......................................................... 22
Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẩu thuật liên
hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC ...................................................... 24
Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au ............................................ 25
Hình 1.3.2 : Cơng thức cấu tạo của cysteamine ............................................................... 25
Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP................................................... 27
Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP ............................................. 28
Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử Nitơ của nguyên tử Oxy ................................. 29
Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx ................................................. 29
Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid
succinimidyl ester .............................................................................................................. 30
Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen ........................................................... 31
Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) ........................ 31
Hình 1.4.4: Các trường hợp khơng thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt. ..................... 31
Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt. ..................... 32
Hình 1.4.6: Mơ tả ngun lý đo độ lệch của thanh dao động ........................................... 34
Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng;
b) Một chíp với 9 thanh dao động .................................................................................... 35
Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer .............................................. 36
Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au. ........................................... 37
Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO). ...... 37
Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3 ......................................................... 37
Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au ....................................... 38
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
xi
Hình 2.1.6: Vai trị của BSA............................................................................................. 39
Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2 ...................... 40
Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2 .......................................................... 40
Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES ............................................................. 41
Hình 2.1.10: Q trình silane hố trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane. R
là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) ..................................................................... 42
Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy .................................. 43
Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy. ...................................... 43
Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phịng thí Nghiệm Cơng nghệ Nano ... 44
Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối
ưu hố ................................................................................................................................ 45
Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận
DKK1................................................................................................................................. 46
Hình 2.1.16: Vai trị của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt
SiNx của thanh dao động .................................................................................................. 47
Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT................................... 47
Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101 ................................................................ 48
Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT ................................................................................... 49
Hình 3.1.1: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang và thời gian ngâm GAD ................. 52
Hình 3.1.2: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD: a) 15 phút; b) 30
phút; c) 60 phút; d) 60 phút; e) 120 phút ........................................................................... 53
Hình 3.1.3: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào nồng độ GAD .......................... 54
Hình 3.1.4: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo nồng độ GAD: a) 1%; b) 1.5%; c) 2%;
d) 2.5%; e) 3%. .................................................................................................................. 55
Hình 3.1.5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ khác
nhau của AFP..................................................................................................................... 57
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
xii
Hình 3.2.1: Ảnh huỳnh quang của a) wafer SiNx được biến đổi với GOPTS và không
được xử lý plasma oxy và mẫu SiO2 ................................................................................. 58
Hình 3.2.2: Ảnh huỳnh quang của mẫu SiNx có xử lý plasma oxy .................................. 59
Hình 3.2.3: Đồ thị thể hiện sự thay đổi của độ sáng huỳnh quang theo thời gian xử lý
plasma oxy. ........................................................................................................................ 60
Hình 3.2.4: Ảnh huỳnh quang của 4 mẫu wafer ứng với thời gian xử lý plasma khác
nhau: a) 20 phút; b) 30 phút; c) 45 phút; d) 60 phút ......................................................... 61
Hình 3.2.5: Đồ thị sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào lưu lượng khí oxy ......... 62
Hình 3.2.6: Ảnh huỳnh quang của các mẫu ứng với lưu lượng khí oxy khác nhau: a) 20
sccm; b) 40 sccm; c) 80 sccm; d) 120 sccm; e) 160 sccm................................................. 63
Hình 3.2.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào cơng suất xử lý
plasma ICP. ........................................................................................................................ 64
Hình 3.2.8: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo công suất plasma ICP: a) 200 W; b) 300
W; c) 400 W. ..................................................................................................................... 65
Hình 3.2.9: Ảnh huỳnh quang: a) mẫu khơng được xử lý plasma oxy; b) mẫu xử lý
plasma oxy với các thơng số tối ưu ................................................................................... 66
Hình 3.2.10: Hình ảnh huỳnh quang của F-LCA trên thanh dao động được biến tính bề
mặt sử dụng các thông số tối ưu của quy trình APTES..................................................... 67
Hình 3.2.11: Độ hấp thụ của dung dịch được đo bằng máy quang phổ UV-VIS với bước
sóng hấp thụ khoảng 540 nm ............................................................................................. 68
Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 khác
nhau ................................................................................................................................... 69
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
1
Mở đầu
1. Giới thiệu
Ung thư gan là 1 trong 9 bệnh ung thư hay gặp nhất trên toàn thế giới, chiếm 5,6%
trong tổng số các bệnh ung thư và là bệnh có tiên lượng xấu. Thời gian sống trung bình từ
khi phát hiện khoảng 6 tháng, chỉ có khoảng 4,7% có khả năng sống sót sau 5 năm [26].
Thật nguy hiểm hơn khi ngày càng ảnh hưởng mạnh từ mặt trái của sự phát triển như, ôi
nhiễm môi trường, lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm, uống rượu bia,… làm
tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư.
Để tăng khả năng điều trị bệnh ung thư thì yêu cầu cốt yếu là phát hiện bệnh sớm và
chính xác. Nhiều thập niên qua, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ra nhiều
phương pháp để chuẩn đoán sớm bệnh ung thư như, chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt
lớp đồng vị phóng xạ phát positron, chụp cắt lớp, nội soi,…[27].
Các phương pháp trên chủ yếu là chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã phát triển
thành khối u. Một phương pháp có khả năng phát hiện được bệnh sớm hơn, đơn giản, chi
phí thấp là phương pháp dùng chất chỉ thị thông qua cảm biến sinh học.
Các thanh dao động với kích thước micromet được ứng dụng làm cảm biến phát hiện
chất chỉ thị ung thư được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Với độ dày của
thanh dao động khoảng 1µm, dài khoảng 500-700µm, nhiều tính chất vật lý của thanh sẽ
thay đổi rõ rệt khi một lượng nhỏ chất chỉ thị (chất cần phân tích) bám lên bề mặt thanh.
Đo tín hiệu điện hố, ứng suất bề mặt, độ lệch hoặc sự thay đổi của tần số dao động của
thanh thì ta thu được nhiều thơng tin chính xác phục vụ cho q trình phân tích và chẩn
đốn bệnh. Hình 1 mơ tả sự thay đổi của thanh dao động trước và sau khi gắn kết chất chỉ
thị.
a)
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
b)
Nguyễn Trung Thành
2
Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động nhận
kháng nguyên.[1]
Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào khả năng cố định các phần tử sinh
học lên bề mặt của thanh dao động. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng khả năng
gắn kết các thụ thể sinh học lên bề mặt thanh dao động là rất cần thiết.
Các thanh dao động ứng dụng trong cảm biến sinh học thường làm từ vật liệu SiNx và
được phủ lên một lớp vàng và crom mỏng. Bản thân Au và SiNx không phản ứng trực
tiếp với các thụ thể nên để gắn kết các thụ thể này lên bề mặt thì chúng ta phải biến đổi
bề mặt của thanh dao động.
Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả
năng gắn kháng thể lên bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát
hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1.
2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài
2.1. Mục tiêu
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động
được phủ lớp Au, SiNx hướng ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị AFP và
DKK1.
2.2. Ý nghĩa của đề tài
Sử dụng cảm biến thanh dao động để phát hiện các chất chỉ thị ung thư gan là
một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu, đơn giản, chi phí thấp và
đặc biệt là có thể phát hiện được bệnh ung thư gan ở giai đoạn đầu. Điều này sẽ giúp
tăng khả năng điều trị hiệu quả bệnh ung thư gan. Ở nước ta, đây là một đề tài khá
mới mẻ. Nghiên cứu này có thể mở ra những hướng nghiên cứu mới về xét nghiệm
miễn dịch nhằm chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
3
3. Tóm tắt nội dung của đề tài
Nội dung chính của đề tài bao gồm:
Khảo sát thí nghiệm biến đổi bề mặt Au của thanh dao động thông qua
cysteamine, GAD. Xây dựng quy trình dị tìm AFP.
Khảo sát phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động thơng qua
GOPTS, APTES, GAD. Xây dựng quy trình dị tìm DKK1.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động
1.1.1. Cảm biến sinh học
1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học
Sự phát triển của cảm biến sinh học đầu tiên gắn liền với cái tên L. C. Clark, người
đầu tiên đề xuất đầu dò oxy (1956) cho việc xác định oxy trong máu và sau đó được coi
là “enzyme electrode” gồm có đầu dò enzim và hai màng lọc máu kèm theo một phần
nhỏ dung dịch glucose oxidase giữa chúng (hình 1.1.1).
Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên.
Enzim xúc tác sự oxi hoá chuyển đổi glucose thành axít gluconic. Vì vậy, lượng oxy
bị phân giải gần bề mặt điện cực tương ứng với nồng độ glucose. Sau này, một thiết bị
tương tự với glucose oxidase được giữ trong gel polyacrylamide đã được mô tả bởi
Updike và Hicks (1967). Tuy nhiên, ứng dụng phân tích đầu tiên của cố định enzim đã
được tạo ra vào năm 1962 (Guilbault et al. 1962). G. Guilbault đã đề xuất hệ thống cảnh
báo cho việc phát hiện sớm chất độc thần kinh. Nó bao gồm 2 điện cực lưới Pt với một
thanh xốp hấp thụ chứa các enzim cholinesterase cố định.
Năm 1969, cảm biến enzyme potentiometric đầu tiên dựa trên điện cực NH3 chọn lọc
và urease cho việc kiểm tra u-rê trong nước tiếu (Guilbault và Montalvo 1969).
Năm 1970, Bergveld đã phát minh transistor hiệu ứng trường chọn lọc ion (ISFET).
Năm 1972, cảm biến sinh học thương mại đầu tiên được sản xuất. Nó là thiết bị kiểm
tra đường huyết, có dạng cây bút sử dụng một điện cực.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
5
Năm 1975, Janata phát minh ra cảm biến miễn dịch đầu tiên dự trên một bộ phân thế
(potentiometric transducer).
Năm 1976, ra đời cảm biến miễn dịch amperometric đầu tiên (Aizawa et al. 1976).
Cũng trong năm này, Karube phát mình ra cảm biến sinh học vi khuẩn (microbial
biosensor) dựa trên tốc độ hơ hấp như là một tín hiệu đặc trưng trong tổng lượng vật chất
hữu cơ có thể oxi hố trong nước.
Năm 1980, Peterson phát minh ra cảm biến pH sợi quang đầu tiên trong khí huyết cơ
thể.
Năm 1982, lần đầu tiên ra đời cảm biến sinh học glucose dựa trên cơ sở sợi quang.
Năm 1983, lần đầu ra đời cảm biên miễn dịch cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt
(surface plasmon reconance-SPR).
Năm 1984, ra đời cảm biến sinh học đo dòng gián tiếp đầu tiên. Ferrocene được sử
dụng với glucose oxidase cho việc thu nhận glucose.
Năm 1987, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết MediSense ExacTechTM (mơ hình
dải/bút và dùng một lần).
Năm 1990, ra mắt Pharmacia BIACore SPR dựa trên hệ thống cảm biến sinh học.
Năm 1992, i-STAT ra mắt thiết bị phân tích máu cầm tay.
Năm 1996, Glucocard được ra mắt.
Năm 1998, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết LifeScan FastTake.
Năm 2001, LifeScan đã mua hệ thống kinh doanh thiết bị kiểm tra glucose của
Inverness Medical’s với giá 1,3 tỷ đô.
Từ năm 1999-nay, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng một số kỹ thuật như BioNMES,
Quantum dots, nanopartivles, Nanocantilever, Nanowire và Nanotube vào cảm biến sinh
học [2], [3].
1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học
Cấu tạo cơ bản của một cảm biến sinh học được mơ ta ở hình 1.1.2 [5]:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
6
Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học.
Một cảm biến sinh học bao gồm 3 phần chính: (1) các thụ thể (kháng thể, bộ dị DNA,
cell receptor…) có thể bắt giữ các phần tử sinh học (như là kháng nguyên, DNA đích,
cell…); (2) bề mặt cảm biến, nơi gắn các thụ thể đồng thời cũng là nơi sinh ra các tín
hiệu vật lý (độ lệch, điện trở, chiết suất…) hoặc hóa học thay đổi khi các thụ thể bắt giữ
được các phần tử sinh học, (3) thiết bị điện tử có nhiệm vụ biến các tín hiệu vật lý, hóa
học từ cảm biến và chuyển thành tin hiệu chuyển về hệ thống máy tính để xử lý và hiển
thị kết quả.
Nguyên tắc hoạt động cơ bản của cảm biến sinh học: bề mặt cảm biến được biến đổi
và cố định các thụ thể lên đó, khi tiếp xúc với mơi trường cần phân tích, các thụ thể này
sẽ bắt giữ các chất cần phân tích dẫn đến làm thay đổi một số tính chất hóa, lý của bề mặt
(độ lệch, điện trở, chiết suất…). Sau đó, thông qua bộ chuyển đổi, những thay đổi này
được chuyển sang các tín hiệu quang, điện, cơ,...và nhờ bộ phận xử lý tín hiệu (vi xử lý,
thiết bị điện tử) khuếch đại, đo lường các tín hiệu này và cho ta biết được thơng tin về
chất phân tích.
1.1.1.3. Phân loại cảm biến sinh học
Việc phân loại cảm biến sinh học thơng thường dựa vào nguồn gốc các bộ phận chính
của chúng (bảng 1.1.1.) [2].
Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học.
Thành phần sinh hố
Enzim
Kháng thể
Axít nucleic
Chất cảm thụ
Mô
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Bộ phận truyền dẫn
Điện hố
Quang
Vi cơ điện
Mass sensitive
Enthalpiemetric
Thành phần phân tích
Thuốc và chất chuyển hoá của chúng
Chất chỉ thị sinh học
Vitamin và các chất chống oxi hố
Các chất chuyển đổi
Chất ơ nhiễm mơi trường
Nguyễn Trung Thành
7
Tế bào
Cơng nghiệp hố mỹ phẩm
Cảm biến sinh học enzim (còn gọi là cảm biến enzim, hay điện cực enzim) sử dụng
các enzim làm công cụ trên bề mặt của lớp chuyển đổi. Cảm biến miễn dịch
(immunosensors) sử dụng các thành phần tương tác miễn dịch, như là các kháng thể hay
kháng nguyên. Cảm biến DNA bao gồm đầu dò DNA và các aptamer. Một đầu dò DNA
là một chuỗi oligonucleotide ngắn sao chép lại một phần của gen. Những cảm biến sinh
học dựa trên chuỗi này và được mong đợi thu nhận những đoạn DNA đặc trưng cho
những gen thích hợp cịn được gọi là genosensors (Yang và McGovern 1997). Các
aptamer cũng bao gồm các nucleotide nhưng khơng có cấu trúc tương tự như DNA tự
nhiên. Những aptamer được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp và được lựa chọn
bằng phép ghi sắc mô phỏng đối chiếu với một mục tiêu phân tích. Những aptamer có thể
dựa trên một thư viên RNA, trong khi đó các phần tử RNA tự nhiên vẫn chưa được sử
dụng trong cảm biến sinh học. Những cảm biến sinh học trên cơ sở aptamer được gọi là
aptasensor (Famulok và Mayer 2011).
Trong vài thập niên qua, người ta đã đề xuất việc sử dụng các mô sinh học trong cấu
trúc của cảm biến sinh học. Trong nhiều trường hợp, chúng được ứng dụng như một
nguồn hoạt tính của enzim riêng biệt. Theo đó, chúng được thay thế cho những enzim đắt
tiền hoặc khơng có. Bên cạnh đó, sự ổn định của những enzim trong các mơ sinh học
thậm chí cịn cao hơn so với ở trạng thái được tách riêng biệt bởi hiệu ứng bảo vệ của vi
môi. Sau này, việc sử dụng các mô sinh học giảm đi bởi việc tiếp cận các protein tinh
khiết và thậm chí cịn cung cấp một số sản phẩm thực tế kết hợp các enzim và những chất
hỗ trợ (dẫn xuất cellulose, các hạt silica, và các hạt từ).
Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hố được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh
học và các chất phân tích riêng tương ứng.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
8
Ngồi ra, cảm biến sinh học cịn có thể được phân loại theo bộ phận chuyển đổi hay
nguyên tắc truyền dẫn tín hiệu [2].
- Cảm biến sinh học dựa trên tín hiệu điện hóa: Ngun lý của việc thu nhận tín hiệu
điện hố sử dụng trong cảm biến sinh học là dựa trên q trình di chuyển của các điện
tích xảy ra trên mặt tiếp xúc của dung dịch phân tích-điện cực. Một số chất phản ứng (các
chất điều hồ, enzim nền, chất điện phân) được cho vào dung dịch, nhưng những thay đổi
các đặc trưng điện hố (thế, dịng, độ dẫn) theo những chất thêm vào liên quan đến sự
thay đổi sự phân bổ năng lượng, cấu trúc và thành phần hoá học của mặt tiếp xúc.
- Những cảm biến sinh học quang dựa trên sự thay đổi pha và biên độ của ánh sáng
bị phân cực cung cấp thông tin độ dày và chiết suất của lớp phần tử sinh học bị hấp thụ
trên bề mặt. Sự thay đổi của chiết suất và độ dày của lớp màng mỏng này sẽ làm thay đổi
màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt của cảm biến [4].
Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ
dày màng thay đổi.
1.1.2. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động (cantilevers)
1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh
dao động
Trong những năm gần đây, các cantilever được ứng dụng rộng rãi trong cảm biến
sinh học bởi những ưu điểm nổi bật của nó như độ nhạy cao, kích thước nhỏ, thời gian xử
lý ngắn, và chi phí thấp. Chúng được ứng dụng: để phát hiện những thay đổi về nhiệt độ,
ứng suất bề mặt, và khối lượng với một lượng cỡ picogram của chất phân tích. Những
cantilever được sử sụng trong hệ thống cảm biến để có được một dạng bộ chuyển đổi nhỏ
hoàn toàn mới dựa trên các nguyên lý cơ ban của vật lý như là hiệu ứng lưỡng kim, ứng
suất bề mặt, hoặc dao động điều hồ.
Có 3 ngun tắc truyền dẫn của cantilever chia làm ba phương pháp khác nhau. Thứ
nhất, là do sự thay đổi tần số cộng hưởng bởi sự tăng khối lượng hoặc sự thay đổi về
hằng số lực có thể đo được. Thứ hai, là do độ cong của một cantilever lưỡng kim bởi sự
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
9
thay đổi về nhiệt độ. Cuối cùng, là do cantilever thay đổi độ cong khi thành phần các chất
trên bề mặt thay đổi. Những nguyên tắc này được thể hiện trong hình 1.1.5 [6].
Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt độ
thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao động cộng
hưởng khi thay đổi khối lượng.
Sự thay đổi ứng suất bề mặt của cantilever có thể do sự thay đổi về khối lượng chất
hấp phụ, sự tương tác tĩnh điện của các chất trên bề mặt hoặc sự tương tác giữa các kháng
nguyên và kháng thể (hình 1.1.6).
Việc đo độ lệch của các cantilever hoặc độ dịch tần số dao động cộng hưởng sau khi
gắn các kháng nguyên cho phép ta định lượng được nồng độ của các chất cần phân tích.
Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất
bề mặt khác nhau. a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén.
Thanh dao động trong nghiên cứu này làm bằng vật liệu silicon nitride trên đế wafer
Si. Mặt trên của thanh có phủ một lớp màng mỏng Cr và Au nhằm tăng độ phản xạ (phục
vụ cho việc đo độ lệch của thanh, vì bản thân màng mỏng SiNx là trong suốt, không phản
xạ ánh sáng).
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
10
Si (380 µm)
Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống
Au
Cr
SiNx (1 μm)
Si (380 µm)
Phần thanh dao động
Phần thân chip
Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động
Để có thể ứng dụng thanh dao động làm cảm biến sinh học cần phải gắn lên bề mặt
thanh kháng thể tương ứng. Mục đích của luận văn này là dị tìm Alpha-fetoprotein
(AFP) và Dickkopt-1 (DKK1) là hai chất chỉ thị ung thư gan. Do đó cần phải gắn được
kháng thể của AFP và DKK1 lên bề mặt thanh dao động. Thanh có 2 mặt là Au (mặt
trên) và SiNx (mặt dưới). Hai mặt này không phản ứng với các phân tử sinh học như
protein, DNA v.v. do đó khơng gắn với kháng thể được, mà cần phải trải qua biến đổi
hóa học để trên bề mặt xuất hiện các nhóm chức có thể gắn với protein. Có hai hướng
biến đổi bề mặt để cố định các phần tử sinh học là: liên kết giữa vàng với các hợp chất
thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane.
1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng tới hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở
thanh dao động.
Dựa vào cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học thanh dao động, hiệu
quả của cảm biến được quyết định bởi hai yếu tố cơ bản nhất đó là hiệu quả bắt giữ chất
phân tích và hiệu quả truyền dẫn.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
11
Hiệu quả bắt giữ chất phân tích được quyết định bởi quá trình biến đổi bề mặt của
thanh dao động. Nếu quá trình biến đổi bề mặt thanh dao động đạt hiệu quả cao thì khả
năng cố định các phần tử sinh học sẽ cao sẽ làm tăng độ nhạy của cảm biến. Do đó, vấn
đề biến đổi bề mặt thanh dao động có ý nghĩa rất quan trọng quyết định hiệu quả sử dụng
của cảm biến.
1.2. Ung thƣ gan
Ung thư gan là một bệnh ác tính của gan do sự tăng sinh ồ ạt tế bào gan hoặc tế
bào đường mật gây hoại tử và chèn ép trong gan.
Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư.
Ung thư gan được chia làm bốn giai đoạn phát triển chính:
Giai đoạn 1: khối u đơn lẻ chưa xâm lấn vào bất kỳ mạch máu nào. Nếu phát hiện ở
giai đoạn này thì sẽ có nhiều cơ hội kéo dài sự sống.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Nguyễn Trung Thành
