Nghiên cứu tách chiết ergosterol từ sinh khối các chủng nấm cordyceps sp. phân lập tại VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
  



ĐOÀN MINH QUÂN




NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ERGOSTEROL
TỪ SINH KHỐI CÁC CHỦNG NẤM
CORDYCEPS SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM



KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HÓA


Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐINH MINH HIỆP

TP.HCM – Tháng 7 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
  
Lời đầu tiên, con xin chân thành gửi đến ba mẹ đã tạo mọi điều kiện cũng như
không ngừng động viên cho con, là chỗ dựa vững chắc để con yên tâm học tập và
hoàn thành khóa luận
Em xin chân thành cảm ơn:
- Các thầy cô Khoa Sinh Học trường Đại Học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
đã tận tụy dạy dỗ em trong suốt những tháng năm học tập và nghiên cứu tại trường.
- Thầy TS. Đinh Minh Hiệp là người đã tận tình hướng dẫn, tập cho em
những bước đi đầu tiên trong con đường nghiên cứu khoa học, đã cho em những lời
khuyên, những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong học tập cũng như trong
cuộc sống.
- Cô ThS.DS. Dương Thị Mộng Ngọc đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời
gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quý giá và tạo
mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này.
- Cô Nguyễn Thị Hoa, anh Bùi Thế Vinh, chị Lâm Bích Thảo, chị Nguyễn
Thị Ngọc Đan và anh chị trong Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM đã hết lòng
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian em thực hiện khóa luận của
mình. Đặc biệt là chị Nguyễn Thị Ngọc Đan đã chỉ bảo tận tình cho em về mặt kỹ
thuật trong quá trình làm đề tài.
- Các thầy cô và các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Hóa Trường Đại Học
Khoa học Tự Nhiên, các bạn sinh viên trường Đại Học Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo
điều kiện cũng như chia sẻ kinh nghiệm học tập trong quá trình làm khóa luận của
em tại trung tâm.

Sinh viên thực hiện
Đoàn Minh Quân
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU CORDYCEPS 4
1.1.1. Nguồn gốc 4
1.1.2. Phân bố 5
1.2. CÁC HỢP CHẤT CHÍNH TRONG CORDYCEPS 5
1.2.1. Thành phần hóa học 5
1.2.2. Các hợp chất có giá trị dược tính cao 7
1.3. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TRONG CORDYCEPS 10
1.3.1. Kháng ung thư 10
1.3.2. Apoptosis 11
1.3.3. Một số hoạt tính khác 12
1.4. ERGOSTEROL - TỔNG QUAN VÀ SỰ KHÁNG PHÂN BÀO 13
1.4.1. Ergosterol 13
1.4.2. Cơ sở phân tử cho quá trình kháng phân bào của ergosterol 16
1.4.3. Một số nghiên cứu về tác dụng của ergosterol 17
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
ii
2.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 20
2.3. Hóa chất và thiết bị 21
2.3.1. Hóa chất 21
2.3.2. Thiết bị 21
2.4. Phương pháp nghiên cứu 22
2.4.1. Quy trình nghiên cứu 22
2.4.2. Phương pháp nhận danh, phân tách ergosterol 23
2.4.2.3. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột 24
2.4.2.6. Nạp dung môi vào cột sắc ký 27
2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 28
2.4.4. Xác định hàm lượng ergosterol trong cao PE 28
2.4.5. Thử nghiệm hoạt tính của ergosterol trên tế bào ung thư 29
2.4.5.1. Thử nghiệm SRB 30
2.4.5.2. Xử lý kết quả 31
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33
3.1. Kết quả định lượng ergosterol 34
3.1.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại của ergosterol chuẩn trong MeOH 34
3.1.2. Kết quả dựng đường chuẩn esgosterol 34
3.2. Nhận danh, phân tách ergosterol 38
3.2.1 Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột 38
3.2.2 Tiến hành sắc ký cột hở 38
3.2.3. Phân tách, tinh chế chất từ phân đoạn 9 (phân đoạn có chứa ergosterol) 42
3.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch của chất E9 43
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp

iii
3.4. Khảo sát cấu trúc của chất E9 đã tinh chế 46
3.5. Khảo sát khả năng gây độc tế bào và xác định IC
50
48
3.5.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào 48
3.5.2. Xác định giá trị IC
50
49
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
4.1. Kết luận 54
4.2. Kiến nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
Phụ Lục 1. Biểu đồ Phổ 1H-NMR của chất E9 58
Phụ Lục 2. Kết quả Phổ
1
H-NMR dãn rộng của chất E9 59
Phụ Lục 3. Kết quả xác định độc tính tế bào 60
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADP adenosine diphotphat
DNA deoxiribonucleotide
ED
50
effective dose (liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử)
EtOAc ethyl acetat

EtOH ethanol
E9 chất ergosterol ở phân đoạn thứ 9
R
f
ratio of flow (hệ số di chuyển)
RSD độ lệch chuẩn tương đối
IC
50
inhibitory concentration ( nồng độ ức chế 50% đối tượng thử)
IFN interferon
IL interleukine
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
MeOH methanol
NMR nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
PE ether dầu hỏa
SD độ lệch chuẩn
SKLM sắc ký lớp mỏng
SRB Sulforhodamine B
TB trung bình
TNF tumor necrosis factor
UV ultraviolet (bức xạ tử ngoại)

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
v
DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang

Bảng 1.1. Tỉ lệ (mg/g) của các chất chính trong Cordyceps 7
Bảng 2.1. Các thông số sau khi nạp mẫu vào cột sắc ký 27
Bảng 3.1. Kết quả OD của ergosterol chuẩn ở bước sóng 282 nm 34
Bảng 3.2. Hàm lượng ergosterol cao PE của 10 mẫu sinh khối Cordyceps 36
Bảng 3.3. Kết quả Rf cho các hệ dung môi thử nghiệm 38
Bảng 3.4. Kết quả hệ dung môi cho quá trình chạy cột. 39
Bảng 3.5. Tổng kết các phân đoạn trong quá trình tách chiết 41
Bảng 3.6. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE06 48
Bảng 3.7. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE67 48
Bảng 3.8. Kết quả IC
50
trên tế bào ung thư vú của cao PE06 50
Bảng 3.9. Kết quả IC
50
trên tế bào ung thư vú của cao PE67 50
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1 Quả thể một số loài nấm Cordyceps 4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất đã được phân lập từ Cordyceps 6
Hình 1.3. Cấu trúc mạch C của nhóm sterol 13
Hình 1.4. Phân loại các nhóm chất của steroid 14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ergosterol 14
Hình 1.6. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp ergosterol 16
Hình 2.1. 10 mẫu cao PE của sinh khối nấm Cordyceps 20
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu tổng quát 22
Hình 2.3. Thực hiện sự nạp cột sắc ký 25

Hình 2.4. Quy trình nạp mẫu và chất hấp thu (silicagel) vào cột sắc ký 26
Hình 2.5. Cột sắc ký sau khi chuẩn bị xong 27
Hình 3.1. Độ hấp thu cực đại của ergosterol chuẩn trong MeOH 34
Hình 3.2. Đường biểu diễn tuyến tính của ergosterol chuẩn ở nồng độ 10-50 g/ml 35
Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn hiển thị dưới đèn UV 254nm 40
Hình 3.4. Sắc ký đồ các phân đoạn hiển thị dưới thuốc thử H
2
SO
4
10%/EtOH 40
Hình 3.5. Tinh thể chất cần phân lập thu ở phân đoạn thứ 9 42
Hình 3.6. Sơ đồ phân lập cao PE bằng qua sắc ký cột hở 42
Hình 3.7. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi 43
Hình 3.8. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi 44
Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi 45
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hoạt tính gây độc tế bào của 2 mẫu cao trên dòng tế bào ung
thư vú MCF-7 49
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị IC
50
của 2 cao PE trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 51




Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
2
Nấm là nguồn thiên nhiên sản sinh nhiều hợp chất steroid có cấu trúc đa
dạng cả về khung carbon và nhóm chức. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh
học quý như kháng viêm, ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, kháng virus,
kháng sinh…. Trong đó, ergosterol là một chất thuộc nhóm steroid, có vai trò quan
trọng trong việc hình thành vitamin D dưới tác dụng của tia cực tím, cấu thành
màng tế bào của nấm, vi sinh vật và một số loài thực vật…… Ergosterol và dẫn
xuất của chúng tách chiết từ một số loại nấm có khả năng kháng ung thư, tăng
cường hệ miễn dịch cho cơ thể, giúp điều trị các bệnh nấm kí sinh trên cơ thể động
vật.
Các nghiên cứu cho thấy trong nấm Cordycpes chứa ergosterol có giá trị
dược tính cao, được chứng minh qua các thí nghiệm lâm sàng trên các dòng tế bào
ung thư gan, ung thư vú, ung thư cổ tử cung…. và cho kết quả khả quan. Ở Việt
Nam, nấm Cordyceps mới được tìm thấy vài năm trở lại đây, và các nghiên cứu tại
Việt Nam về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của ergosterol trong nấm chưa
được chú ý nhiều, nhất là các loài nấm Cordyceps phân lập tại Việt Nam. Nhằm tạo
tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của ergosterol trong
sinh khối nấm Cordyceps, chúng tôi thực hiện đề tài này với nội dung như sau:
- Định lượng ergosterol trong cao phân đoạn
- Nghiên cứu hệ dung môi tách chiết bằng sắc kí cột
- Nghiên cứu công đoạn tinh sạch hiệu quả
- Xác định cấu trúc hóa học của ergosterol đã tinh sạch.
- Thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào.

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
3



Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
4
1.1. GIỚI THIỆU CORDYCEPS
1.1.1. Nguồn gốc [1]
Theo Holliday và cộng sự (2008) đã phân loại Cordyceps thuộc :
Giới Fungi
Ngành Ascomycota
Lớp Ascomycetes
Bộ Hypocreales
Họ Clavicipataceae
Chi Cordyceps

Hình 1.1 Quả thể một số loài nấm Cordyceps

A. C. militaris; B. C. ophioglossoides; C. C. sinensis; D. C. takaomontana



B

C

D
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
5
Quả thể nấm Cordycpes thường dài khoảng 4 inch (10 cm) và chiều ngang
khoảng 0,2 inch (0,5 cm) rộng. Tất cả các loài Cordyceps là nấm kí sinh trên côn
trùng. Một trong những loài phổ biến nhất là Trong đó Cordyceps sinensis là một
trong những loài được nghiên cứu nhiều nhất.
Đến nay, có trên 350 loài Cordyceps đã được tìm thấy như Cordyceps militaris
(L) Link, C. martialis Speg., C. hawkesii Gray, C. liangshanensis Zang, Liu & Hu,
C. barnesii Thwaites, C. cicadicola, C. gracilis (Grav.) Dur. & Mont, C. ramose
Teng, C. ophioglossoides (Ehrh. Fr) Link và C. gunnii (Berk.) ….[19]. Các chủng
của chi Cordyceps đã được tìm thấy trên sáu lục địa và trong nhiều vùng khí hậu và
môi trường sống, ký sinh trên nhiều loại vật chủ, bao gồm côn trùng, nhện, và thậm
chí cả các loại nấm khác.[8]
Năm 2010, một nhóm các nhà nấm học của Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc đã
phối hợp nghiên cứu và sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps. Theo kết
quả nghiên cứu này, toàn bộ các loài thuộc nhóm nấm Cordyceps được phân chia lại
thuộc về 3 họ: họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella,
Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; họ
Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps.[20]
1.1.2. Phân bố [5]

Cordyceps phân bố trên toàn thế giới và nhiều loài đã được mô tả ở châu Á
(đặc biệt là Nepal, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan và tỉnh Tứ Xuyên,
Cam Túc, Hồ Bắc, Chiết Giang, Sơn Tây, Thanh Hải, và Vân Nam Trung Quốc),
đặc biệt phong phú và đa dạng trong rừng ôn đới và nhiệt đới ẩm.
1.2. CÁC HỢP CHẤT CHÍNH TRONG CORDYCEPS
1.2.1. Thành phần hóa học
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps có 17 acid
amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid. Nhiều hoạt chất này có giá trị dược liệu
cao. Trong đó phải kể đến axít cordiceptic, cordycepin, adenosin, hydroxyethyl-
adenosin, nhóm sterol. Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy-Etyl-
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
6
Adenosin-Analogs). Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) còn có chứa nhiều
loại vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B
12
; 29,19 mg
vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B
2
(riboflavin), vitamin E,
vitamin K ), các nguyên tố vi lượng và đa lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn,
Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, và Zr).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất đã được phân lập từ Cordyceps [12]

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
7
Bảng 1.1. Tỉ lệ (mg/g) của các chất chính trong Cordyceps

1.2.2. Các hợp chất có giá trị dược tính cao
1.2.2.1. Nucleosid
Các nucleosid là thành phần có hoạt tính sinh học trong Cordyceps, hiện có
hơn 10 nucleosid và các hợp chất liên quan đã được tách chiết từ chi nấm này bao
gồm adenin, adenosin, uracil, uridin, guanidin, guanosin, hypoxanthin, inosin,
thymin, thymidin, deoxyuridin, một số cấu trúc chuyên biệt của deoxyuridin,
adenosin, 2',3'-dideoxyadenosin (thành phần của thuốc kháng virus Didanosine
TM
,
Videx
TM
cho điều trị nhiễm HIV), hydroxyethyladenosin, cordycepin [3'-
deoxyadenosin], cordycepin triphosphat, deoxyguanidin, và một số nucleosid đã
được biến đổi.[12]
Nucleosid liên quan đến sự điều hòa và vận chuyển của các quá trình sinh lý

khác nhau trong hệ thống thần kinh trung ương. Ví dụ, adenosin làm suy giảm sự
kích thích của hệ thống tế bào thần kinh trung ương và ức chế giải phóng các chất
dẫn truyền thần kinh khác nhau. Các bằng chứng dược lý trên một số mô hình rối
loạn co giật ở động vật cho thấy adenosin có hoạt tính chống co giật. Adenosin đã
được sử dụng như một chất đánh dấu để kiểm tra chất lượng của C.sinensis. Inosin,

C. sinensis tự nhiên
C. sinensis nuôi cấy
C. militaris nuôi cấy
Thanh
Hải
Tây
Tạng
Giang
tây
Hoa
Đông
Quảng
Đông
Tế
Ninh
Oli
Ergosterol
3,65
10,34
1,31
1,10
0,38
6,33
a

Adenosin
0,31
0,25
3,23
2,31
5,09
0,86
0,22
Cordycepin
0.04
0,06
b
b
b
9,22
5,71
Guanosin
0,20
0,18
2,80
1,82
4,45
0,69
0,17
Inosin
0,33
0,20
0,12
0,01
0,03

0,03
0,02
Uridin
0,66
0,83
3,11
1,54
8,14
1,96
0,51
Mannitol
38,64
35,42
10,24
12,83
13,41
a
a
Polysaccharid
4,75
8,22
5,83
7,51
5,96
a
a
a: không có dữ liệu; b: không phát hiện
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
8

chất chuyển hóa chính của adenosin, kích thích sự phát triển của sợi thần kinh in
vitro và hệ thống thần kinh trung ương ở người lớn. Ngoài ra, nucleosid còn có vai
trò quan trọng trong sự biệt hóa và tăng trưởng của hệ thống tiêu hóa, cũng như
trong duy trì đáp ứng miễn dịch.[12], [13]
Đặc biệt, cordycepin [3'-deoxyadenosin] và acid cordycepic [D-mannitol] là
những hợp chất có hoạt tính sinh học đầu tiên tách chiết từ Cordyceps militaris nuôi
cấy. Cordycepin là một đồng phân nucleosid có nhiều hoạt tính sinh học. Trong tế
bào, cordycepin được chuyển đổi thành 5’- mono, di và triphosphat và chúng ức chế
hoạt động của ribose-phosphat pyrophosphokinase và 5-phosphoribosyl-1-
pyrophosphat amidotransferase trong quá trình sinh tổng hợp purin và/hoặc tổng
hợp các acid nucleic, dẫn đến hoạt tính kháng khối u, kháng di căn và kháng
khuẩn.[8], [14]
Ngoài ra, một số nucleosid như 6-hydroxyethyl-adenosin và 3-amino-3–
deoxyadenosin cũng được tìm thấy trong C. sinensis và C. militaris nuôi cấy.[12]
1.2.2.2. Polysaccharide
Trong giới nấm, đặc biệt là Cordyceps, các polysaccharid là hợp chất có dược
tính được biết đến nhiều nhất. Một số lớn polysaccharid và các dẫn xuất đường khác
như acid cordycepic [D-mannitol] đã được xác định và nghiên cứu dược tính. Kết
quả cho thấy nhiều loại polysaccharid Cordyceps có tác dụng điều hòa miễn dịch,
kháng ung thư, kháng oxy hóa, hạ cholesterol và giảm lượng đường trong máu. [16]
D-mannitol là một trong những hợp chất chính trong Cordyceps tự nhiên và
chiếm hơn 3,4% tổng khối lượng khô. D-mannitol (hay còn gọi acid cordycepic)
được chiết từ C. sinensis vào năm 1957 có tác dụng: lợi tiểu, trị ho và chống các
gốc tự do. Hiện nay, D-mannitol được sử dụng để chữa nhiều loại bệnh và hàm
lượng mannitol trong Cordyceps tự nhiên cao hơn so với Cordyceps nuôi cấy. [8]
1.2.2.3. Sterol
Nhiều hợp chất sterol được tìm thấy ở Cordyceps gồm ergosterol, ∆-3-
ergosterol, ergosterol peroxid, -sitosterol, daucosterol, và campesterol. [23]
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp

9
Ergosterol là một trong những thành phần hóa học trong tế bào hệ sợi. Chúng
là sterol chiếm ưu thế trong hầu hết các loại nấm. Trên thực tế, trong suốt quá trình
nuôi cấy Cordyceps, hàm lượng ergosterol thay đổi tùy vào thời gian nuôi cấy; hàm
lượng ergosterol ổn định khi gây đột biến hệ sợi Cordyceps. Một số sterols khác
như ∆
3
-ergosterol, ergosterol peroxid, ergosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid,
cereisterol, 22,23-dihydrobreassicasterol, β-sitosterol, daucosterol, cholesterol,
cholesteryl palmitat, campesterol và dihydrobrassicasterol cũng có trong Cordyceps.
Ergosterol tồn tại ở dạng tự do và kết hợp trong Cordyceps. Lượng ergosterol tự do
cao trong Cordyceps tự nhiên và lượng ergosterol có thể phản ánh chất lượng hệ sợi
Cordyceps. Các đồng dạng ergosterol có dược tính khá đa dạng như độc tính tế bào,
kháng virus và chống loạn tim.[13]
1.2.2.4. Peptid
Hơn 20% acid amin có thể có trong Cordyceps. Năm 1988, 6 hợp chất cyclo-
dipeptid được chiết xuất từ Cordyceps nuôi cấy và trong đó, cyclo-(L-glycyl-L-
prolyl) có hoạt tính chống ung thư và tiềm năng miễn dịch. Ngoài ra, nghiên cứu ở
chuột cho thấy cordycepeptid A chiết xuất từ C. militaris có thể làm tăng khả năng
“thực bào” của đại thực bào.[13]
Sự khác nhau trong hàm lượng acid amin giữa sâu và thể quả Cordyceps tự
nhiên, cũng như trong sinh khối sợi nấm được thể hiện trong nghiên cứu của Tai-
Hao Hsu (2002). Theo thống kê, không có sự khác biệt đáng kể về mức độ acid
amin tổng số, ngoại trừ isoleucin và phenylalanin, giữa phần sâu và phần quả thể
trong nấm. Ba acid amin chính và nồng độ của chúng trong sâu - quả thể là acid
glutamic 2,64-2,66%, acid aspartic 1,70-1,84% và arginin 1,53-1,60%. Tổng acid
amin trong sợi nấm nuôi cấy là 9,23% thấp hơn so với 18,1% trong quả thể nấm. Ba
acid amin chính và nồng độ của chúng trong sợi nấm nuôi cấy là acid glutamic
1,12%, acid aspartic 1,05% và lysin 0,80%.[11]

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
10
1.2.2.5. Các nhóm hoạt chất khác
Hai mươi tám loại acid béo bão hòa và không bão hòa và các dẫn xuất của
chúng đã được phân lập từ C. sinensis. Các hợp chất phân cực của các cao chiết từ
Cordyceps bao gồm nhiều hợp chất hydrocarbon, rượu và aldehyd. Đặc biệt các
hydrocacbon thơm đa vòng được tạo ra bởi Cordyceps sinensis là chất chuyển hóa
thứ cấp. Những hợp chất hydrocacbon thơm đa vòng này phản ứng với
polypropylen được sử dụng trong các túi nuôi trồng nấm thông thường, dẫn đến
việc tạo ra các sản phẩm phụ độc hại đối với Cordyceps, làm chậm sự phát triển của
chúng.[8]
1.3. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TRONG CORDYCEPS
1.3.1. Kháng ung thư
Cordyceps đang được nhiều bác sĩ đề nghị sử dụng như thuốc hỗ trợ cho hóa
trị, xạ trị và điều trị ung thư truyền thống do chúng có hiệu quả trong ức chế tăng
trưởng một số loại khối u và tăng cường hệ miễn dịch.[8]
Trong nghiên cứu liên quan, phân đoạn CO-1 của β-(1-3)-D-glucan, phân
đoạn CO-N của galactosaminoglycan, chiết xuất từ C. ophioglossoides đều cho thấy
khả năng ức chế sự tăng trưởng của bướu người, đồng thời tăng cường chức năng
miễn dịch. Trong một nghiên cứu khác, phân đoạn CO-1 của C. ophioglossoides có
tác dụng đối với dòng tế bào sarcoma 180. Một liều duy nhất chỉ 0,5mg/kg, tiêm
vào chuột đã ức chế sự tăng trưởng khối u tỷ lệ cao. Sự ức chế gần như hoàn toàn
khối u này báo hiệu tiềm năng tích cực trong sự phát triển của các loại thuốc kháng
ung thư và phương thức điều trị mới.[17]
Nhiều nghiên cứu lâm sàng thực hiện tại Trung Quốc và Nhật Bản sử dụng
Cordyceps trên bệnh nhân ung thư đã có kết quả tích cực. Nghiên cứu trên 50 bệnh
nhân bị ung thư phổi được dùng Cordyceps, liều dùng 6g/ngày kết hợp với hóa trị,
khối u đã giảm kích thước trên 46% bệnh nhân.

Bên cạnh cơ chế điều hòa miễn dịch, tài liệu “On the Trail of the Yak” (2005)
của John C. Holliday đã đưa ra cơ chế diễn ra trong các phản ứng kháng ung thư
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
11
của Cordyceps. Cơ chế này có liên quan đến cấu trúc của một trong số các dẫn xuất
nucleosid trong Cordyceps, đó là cordycepin [3'-deoxyadenosin]. Đây là một phân
tử gần giống như adenosin bình thường, nhưng thiếu một nguyên tử oxy trên phần
ribose của phân tử tại vị trí 3. Cấu trúc của DNA phụ thuộc vào phân tử oxy này để
tạo ra sự liên kết giữa vị trí 3' và 5' này trên các phần ribose của nucleosid, tạo thành
“cấu trúc bậc thang”. Trong quá trình nhân đôi tế bào, các phân tử DNA tách ra, sau
đó chèn các nucleosid mới hình thành liên kết hydro giữa các cặp bổ sung, và liên
kết đường phosphat ở vị trí 3' và 5' giữa các ribose. Các nucleosid mới liên tục được
thêm vào trong quá trình tổng hợp. Nhưng khi một phân tử 3'-deoxyadenosin
(cordycepin) được kéo vào, oxy không có mặt ở vị trí rất quan trọng để hình thành
liên kết 3'-5', sự nhân đôi DNA dừng lại. Khi DNA ngừng tổng hợp, các tế bào
không thể tiếp tục phân chia và tế bào mới không được hình thành. Trong tế bào
động vật có vú bình thường, sự chèn các adenosin deoxygenate không quan trọng,
vì các tế bào khỏe mạnh có một cơ chế sửa chữa DNA. Khi lỗi này xảy ra, các dẫn
xuất nucleosid (cordycepin) bị lấy ra khỏi các chuỗi nucleosid, và một adenosin
được chèn vào. Trong khi tế bào ung thư, vi khuẩn và virus đều thiếu cơ chế sửa
chữa DNA.[8]
1.3.2. Apoptosis
Apoptosis hoặc tế bào chết theo chương trình là một quá trình sinh lý bình
thường nhằm loại bỏ những tế bào không mong muốn và duy trì sự nội cân bằng
trong các mô khỏe mạnh. Sự tăng trưởng khối u được kiểm soát bởi sự cân bằng
giữa tăng sinh của tế bào và quá trình apoptosis. Hầu hết các loại thuốc hóa trị ung
thư tác dụng gây độc tế bào trên các tế bào ác tính bằng cách gây apoptosis. Một
hợp chất sterol H1-A phân lập từ C.sinensis đã ức chế bệnh tự miễn dịch ở chuột,
thúc đẩy quá trình apoptosis để ngăn chặn sự tăng sinh tế bào khối u ở người.

Nghiên cứu của Qiaoxia Zhang (2004) thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của
sợi nấm C. sinensis trên tế bào HL-60, nghiên cứu quá trình apoptosis, sự ngưng tụ
nhiễm sắc thể, sự phân mảnh DNA, sự kích hoạt hoạt động của caspase-3 và sự
phân cắt của ADP-ribose polymerase của các cao chiết từ sợi nấm. Kết quả là cao
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
12
ethyl acetat từ sợi nấm C. sinensis gây độc mạnh tế bào HL-60 với ED
50
≤ 25
µg/ml. Phân tích hóa học cho thấy cao EtOAc chứa ergosterol, glycosid và
polysaccharid, không có alkaloid, acid hữu cơ, acid amin, peptid, tuy nhiên chưa
xác định thành phần hoạt chất nào gây độc tế bào và apoptosis.[22]
1.3.3. Một số hoạt tính khác
Cordyceps thường được dùng ở Trung Quốc để điều trị mệt mỏi, chảy mồ hôi
đêm, điều hòa đường huyết, suy nhược sau bệnh nặng, bệnh phổi, bệnh gan, rối loạn
chức năng thận và suy thận, loạn nhịp và các bệnh lý tim khác. Các nghiên cứu
dược lý còn cho thấy Cordyceps có lợi đối với hệ tuần hoàn, miễn dịch, gan mật,
tim mạch, hô hấp và hệ tuyến trong cơ thể con người. [7]
Năm 2008, Zhou và cộng sự cho thấy cordycepin, adenosin từ Cordyceps làm
tăng biểu hiện interleukin (IL)-10, giảm biểu hiện IL-2 và ngăn chặn hoạt động tế
bào lympho T, có ảnh hưởng điều hòa các tế bào miễn dịch ở người. Cụ thể,
cordycepin từ Cordyceps điều hòa tăng IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, đồng thời
ngăn chặn phytohemagglutinin cảm ứng sự sản xuất IL-2, IL-4, IL-5, IFN- và IL-
12.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng Cordyceps làm tăng ATP
(adenosine triphosphat) di động và sử dụng oxy [18]. ATP là các phân tử giải phóng
năng lượng trong tế bào. Sự gia tăng ATP tế bào là tăng năng lượng thực có sẵn để
sử dụng. Điều này trái ngược với sự gia tăng năng lượng xảy ra từ việc sử dụng các
chất kích thích thần kinh trung ương như ephedrin, caffein và các chất kích thích.

Do đó, trong y học cổ truyền Trung Quốc cũng sử dụng Cordyceps như một thực
phẩm để gia tăng năng lượng cho vận động viên hoặc người cao tuổi.[8]
Trong một nghiên cứu lâm sàng dùng giả dược trên những bệnh nhân cao tuổi
bị mệt mỏi mãn tính, kết quả cho thấy hầu hết bệnh nhân được điều trị với
Cordyceps sinensis có cải thiện lâm sàng về mặt mệt mỏi, chịu lạnh, chóng mặt, ù
tai và mất trí nhớ, trong khi nhóm dùng giả dược không có cải thiện.
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
13
1.4. ERGOSTEROL - TỔNG QUAN VÀ SỰ KHÁNG PHÂN BÀO
1.4.1. Ergosterol
1.4.1.1. Định nghĩa
Ergosterol là chất thuộc nhóm sterol. Sterol là các steroid mang nhóm
hydroxyl. Các steroid có nguôn gốc từ một trong các dẫn xuất của triterpene, được
biến đổi từ lanosterol, có đặc điểm chung là khung C gồm 4 vòng
(cyclopentanoperhydrophenanthrene) hoặc là dẫn xuất từ khung C ở trên. Các
steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với vùng lõi. Steroid có ở
hầu hết các sinh vật từ động vật, thực vật và nấm.







Hình 1.3. Cấu trúc mạch C của nhóm sterol
Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol), là một tiền chất sinh học của vitamin
D
2
. Ergosterol, một sterol được tìm thấy trong màng tế bào nấm, được chuyển đổi

thành vitamin D
2
bằng tia cực tím, và sau đó được thay đổi thành ergocalciferol, mà
là một dạng của vitamin D. Ergosterol lần đầu được tìm thấy ở chi nấm Claviceps,
có chức năng tương tự như cholesterol trong các tế bào động vật. Ergosterol không
có trong tế bào thực vật và động vật.
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
14
1.4.1.2. Phân loại
Người ta phân loại các nhóm của steroid dựa vào sự xuất hiện các nhóm
chức tại C10, C13, C17 và vòng cycloanken trong 4 vòng, theo cách gọi tên thông
thường của IUPAC dựa trên khung sườn C. thì steroid có 5 nhóm chất dược hiển thị
ở hình 1.4. Ergosterol thuộc nhóm cholestane của steroid. [15]












Hình 1.4. Phân loại các nhóm chất của steroid
1.4.1.3. Cấu trúc và tính chất
Tên IUPAC: ergosta-5,7,22-trien-3β-ol
Công thức phân tử : C

28
H
44
O
Khối lượng phân tử :396,65 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy : 160,0
o
C
Điểm sôi : 250,0
0
C
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ergosterol
Một số tên gọi khác của ergosterol: ergosta-5,7,22-trien-3-ol, (3β,22E)-;
ergosterin; provitamin D; provitamin D2; (3β)- ergosta-5,7,22-trien-3-ol;
(3β,22E)-ergosta-5,7,22-trien-3-ol.

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
15
Là một chất rắn hữu cơ kết tinh màu trắng. ergosterol được chuyển đổi bằng
cách chiếu xạ tia cực tím vào ergocalciferol, hoặc vitamin D2, một yếu tố dinh
dưỡng nhằm thúc đẩy phát triển xương thích hợp trong con người và động vật có vú
khác. Mối liên hệ với vitamin D được thành lập vào năm 1927, khi người ta thấy
rằng một mẫu chiếu xạ của ergosterol có thể được sử dụng để làm giảm bớt bệnh
còi xương, một căn bệnh thiếu xương do thiếu vitamin D trong chế độ ăn uống.
1.4.1.4. Quá trình sinh tổng hợp
Ergosterol được tổng hợp chủ yếu từ Acetyl CoA theo đường HMG-CoA
reductase (là con đường tạo ra cholesterol từ acetyl-CoA) ở nhiều tế bào. Quá trình
chuyển hóa tạo ergosterol được thể hiện ở hình 1.6. Trong đó, isopentenyl
pyrophosphate kí hiệu là IPP, dimethylallyl pyrophosphate kí hiệu là DMAPP.

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
16

Hình 1.6. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp ergosterol
1.4.2. Cơ sở phân tử cho quá trình kháng phân bào của ergosterol
1.4.2.1. Miễn dịch trị liệu
Miễn dịch trị liệu ung thư là sử dụng cơ chế miễn nhiễm chống lại khối u.
Chúng được dùng trong các dạng ung thư khác nhau, như ung thư vú và leukemia.
Các chất đó là kháng thể đơn dòng nhằm chống lại các protein đặc trưng cho các tế
bào ung thư, hay các cytokine điều hoà đáp ứng của hệ miễn dịch. Miễn dịch trị
liệu là kích hoạt và làm tăng số lượng của các tế bào miễn dịch của cơ thể gọi là
macrophage và tế bào giết tự nhiên (NK cell). Macrophage là hàng rào miễn dịch
đầu tiên bảo vệ và chống lại bất cứ yếu tố ngoại lai nào xâm nhập cơ thể, kể cả các
tế bào ung thư. NK cell là một tế bào miễn dịch đặc hiệu có chức năng nhận biết và
tiêu diệt tế bào ung thư.[1]
1.4.2.2. Cơ chế kháng phân bào của ergosterol
Trong số các phương pháp điều trị ung thư nêu trên thì ergosterol có ảnh
hưởng nhiều về phương pháp miễn dịch trị liệu. Các nghiên cứu đã chứng minh
ergosterol có ảnh hưởng đến việc hỗ trợ và tăng cường các tế bào T, tế bào giết tự
nhiên, đại thực bào…. kích thích các IL-2, IL-4 để hỗ trợ trong việc ức chế các tế
bào ung thư. Đa phần các chất này thuộc dẫn xuất ergosterol là ergosterol peroxide.
Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Huber (2003) thì ergosterol còn có khả năng
Ergosterol
Ergosterol
ergosterol
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp
17
gắn với các thụ thể estrogen, góp phần ức chế quá trình phân bào của tế bào ung thư
vú MCF-7.[10]
1.4.3. Một số nghiên cứu về tác dụng của ergosterol
1.4.3.1. Trong nước
Năm 2012, phòng hóa hữu cơ thuộc khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

đã xác định cấu trúc 4 hợp chất khung steroid bao gồm ergosta-4,6,8,22-tetraen-3-
on, ergosterol peroxid, senexonol và acid trame-tenolic B từ ba loài nấm ở Việt
Nam là Xylaria sp., Amauroderma subresinosum, Phellinus sp. Trong đó, chất 2 và
3 (là ergosterol peroxide và senexonol) kháng cả bốn dòng tế bào ung thư, bao gồm
dòng ung thư cổ tử cung, ung thư gan, ung thư dạ dày, ung thư ruột.
2 chất ergosta-5, 7, 22-trien- 3-ol (ergosterol) và 5,8-epidioxy-5, 8-ergosta-
6,22-e-dien-3-ol (ergosterol peroxid) được phân lập từ nấm nội sinh trên cây khổ
sâm (Croton tonkinensis Gagnep). 2 hợp chất này có hoạt tính kháng từ 1-7 vi sinh
vật kiểm định. Hợp chất ergosterol peroxide biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh với
dòng tế bào ung thư gan, ung thư cơ vân và ung thư tử cung.
1.4.3.2. Ngoài nước
Một glycosylat ergosterol peroxid được cô lập từ sợi nấm C. sinensis đã thể
hiện ức chế mạnh mẽ lên một số tế bào ung thư (ức chế 10-40% ở nồng độ 10
mg/ml) [12]. Ở nghiên cứu của Jian Yong Wu và cộng sự (2007), ergosterol và các
hợp chất liên quan cũng có thể ức chế các tế bào ung thư ở cao chiết EtOAc có hàm
lượng ergosterol cao hơn, gấp 4 lần trong cao chiết PE và 80 lần trong cao chiết
EtOH hoặc nước, và ức chế các tế bào ung thư mạnh hơn so với tất cả các cao chiết
khác của sợi nấm C. sinensis.[21]
Năm 1998, Jin Woo Bok và cộng sự đã tách chiết được hai hợp chất kháng ung
thư 5α,8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,22-dien-3β-D-glucopyranosid và 5,6-
epoxy-24(R)-methylcholesta-7,22-dien-3β-ol từ cao chiết MeOH của Cordyceps
sinensis. Hai hợp chất trước đây được biết, ergosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid và