Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus

CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG NÔNG NGHIỆP
Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và
tạo cây sạch bệnh virus
Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà
2.Nguyễn Thị Thu Hằng
I. Kỹ thuật nuôi cấy meristem (nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng)
1. Khái niệm
Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân
cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh
sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh
sáng, nó chứa rất nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi
chất rất mạnh
Kỹ thuật nuôi cấy meristem (hay còn gọi là nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng) là sử dụng mô phân sinh ngọn với
3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có
kích thước từ 0,1– 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng.
2. Nuôi cấy
2.1 Mục đích
-
Khử trùng mẫu đỉnh chồi
-
Khảo sát sự tái sinh cây trực tiếp từ nuôi cấy dỉnh
chồi
-
Khảo sát sự thành lập protocorm từ nuôi cấy đỉnh
chồi
2.2 Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp

a, Nguyên vật liệu

Đoạn thân non của cây

b, Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS bổ sung BA 2ppm và NAA
0,2ppm
c, Tiến hành
-
Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm về được cắt bỏ
hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào bécher
-
Rửa sạch cành mẫu bằng nước xà phòng loãng,
sau đó rửa sạch xà phòng bằng nước máy
-
Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm trong cồn
70% trong 2-3 phút
-
Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 1 lần
-
Xử lý mẫu bằng Ca(OCl)
2
6% trong 10 phút sau đó
thay bằng dung dịch Ca(OCl)
2
5% trong 5 phút
-
Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 6-7 lần cho
hết mùi javel
-
Cành mẫu được cắt bỏ cuống lá và 2 đầu của phần
thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng. Chia cành mẫu

thành các đốt 1cm.
-
Cắm các đốt vào môi trường muôi cấy đã chuận bị,
cho phần cuống lá hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm
trên mặt thoáng của môi trường
-
Nuôi mẫu trong điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày ở
25
0
C
Lá mầm
Chóp đỉnh sinh trưởng
Chồi lá nách
Vòm tăng trưởng
Mô phân sinh
Hình: Đỉnh sinh trưởng
3. Nuôi cấy sinh trưởng cây địa lan
Năm 1962 George Morel lần đầu tiên thành công
trong việc nuôi cấy mô địa lan.
Phương pháp nuôi cấy:
-
Chọn cây giống và mô phân sinh
-
Chuẩn bi mô để nuôi cấy
-
Môi trường nuôi cấy
A. Chồi non tách từ cây mẹ ngoài vườn ươm
B. Chồi non tách sơ bộ các lớp lá bao ngoài trước khi khử trùng
Phương pháp lấy mẫu và nuôi cấy invitro cây địa lan

C. Tách đỉnh sinh trưởng dưới kính lúp trong điều kiện vô trùng
D. Protocorm và chồi non hình thành sau 6-8 tuàn nuôi cấy
E. Chồi non phát triển sau 6 tuần nuôi cấy có 2-3 lá, cao khoảng 4cm
F. Chồi non hình thành rễ sau 6 tuần nuôi cấy
4. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây
Morel Martin (1955) là những người đầu tiên dùng
phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu được
cây khoai tây không chứa virus.
Phương pháp nuôi cấy:
-
Trồng khoai tây vào đất, khi mầm cao 15cm lấy
phần ngọn 6-8cm cắm vào đất bùn đã vô trùng.
-
Sau 3-4 tuần cắt bỏ ngọn mầm để thúc các chồi
nách phát triển.
-
Khi cây có nhiều lá,cắt đoạn và nhân lên nhiều cây,
đồng thời đưa ra chuẩn đoán virus trên cây chỉ thị.
-
Sau khi đã chắc chắn không còn virus trên khoai
tây, các ống nghiệm được đưa vào nhân giống
II. Tạo cây sạch bệnh virus
1. Cơ sở khoa học
Làm sạch virus là việc phải giải phóng các
thực vật bị nhiễm virus khỏi virus.
Các phương pháp làm sạch virus
- Xử lí nhiệt và hóa chất.
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng
phương pháp thử virus.
2. Nguyên lý

Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏ
của đỉnh chồi lên môi trường dinh dưỡng thích hợp để
chúng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh. Phần mô
thường được dùng là vòm phân sinh (meristem dome)
cộng thêm cặp lá đầu tiên.
Mức độ hữu hiêu của quá trình làm sạch virus đối
với thực tiễn phụ thuộc vào những yếu tố sau:
-
Khả năng xử lý nhiệt
-
Khả năng nuôi cấy đỉnh phân sinh
-
Phương pháp thử virus có độ chính xác cao
-
Hệ số nhân giống vô tính cây khá cao
-
Trồng các vật liệu sạch bệnh ban đầu dưới điều
kiện cách ly tốt, tránh được tái nhiễm
-
Mức độ (diện tích) cho phép cung cấp đủ cây giống
mới trong mỗi năm
3. Một số phương pháp làm sạch Virus
Có hai phương pháp là xử lý nhiệt và
nuôi cấy đỉnh phân sinh
3.1 Xử lý nhiệt
Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làm
sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Với giả thiết chung là
virus bị ức chế sinh sản ở nhiệt độ từ 34-40
0
C. Quá

trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt
cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận
Vừa được sinh trưởng thường sạch hoặc nghèo virus.
Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử
lý nhiệt độ tới hạn và phụ thuộc vào khả năng chịu
nhiệt của giống. Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số
trường hợp, song đôi khi mô tế bào của cây nhiễm
virus nhưng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủng
virus vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này.
3.2 Nuôi cấy đỉnh phân sinh
Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là
phương pháp rất thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệt
quá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức chế
mạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh
tính sạch virus sẽ được đảm bảo với độ xác suất cao
và sử dụng môi trường Murashige-Skoog hoặc White.

3.3 Biện pháp bổ trợ
Xử lý hóa chất: Là sử dụng hoá chất mà đó là
những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao
đổi chất axit nucleic.
4. Quy trình làm sạch virus
Nuôi cấy mô phân sinh
Cấy trong môi trường thích
hợp
-
Xác định virus
-
Xử lý nhiệt độ cao
-

Xử lý nhiệt độ tiếp
-
Xử lý hóa chất
-
Điều kiện nuôi cấy thích hợp
Tái sinh cây
Trồng trong vườn ươm
Cây sạch bệnh
Xét nghiệm virus bằng:
-
Cây chỉ thị
-
Kính hiển vi điện tử
-
Ghép
-
Huyết thanh, elisa
Người sử dụng
-
Duy trì sự sạch bệnh (thanh lọc, cách ly)
-
Nhân bằng nhiều phương
Cây bị nhiễm bệnh
5. Kết quả trong thực tiễn sản xuất
5.1 Tạo các giống cây sạch bệnh