khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

I HC C
KHOA THU SN




NGUYN NG PHÁT



KHO SÁT KH  VI KHUN LACTIC KHÁNG
VI KHUN Edwardsiella ictaluri GÂY BNH GAN THN
M TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)





LUT NGHII HC
NGÀNH BNH HC THU SN




2013


i

I HC C
KHOA THU SN

NGUYN NG PHÁT


KHO SÁT KH N LACTIC KHÁNG
VI KHUN Edwardsiella ictaluri GÂY BNH GAN THN
M TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)


LUT NGHII HC
NGÀNH BNH HC THU SN



CÁN B NG DN
Ts. T THANH DUNG



2013


ii


 hoàn thành lui li cn:
C vn hc tp cô T ng dn t tôi có th

 tài này.
Quí Thy, Cô và cán b Khoa Thy si hc Co mi
u kin thun li cho tôi hoàn thành lu
Tôi chân thành c ch dn ht sc nhit tình ca ch  Th Kim
Loan lp cao hc K18.
Cn bo Trung, các bn Trng Phm Hòa
Hip và tp th lp bnh hc thy s tôi, luôn bên tôi khi tôi gp

C
Sinh viên thc hin


Nguyng Phát


iii

TÓM TT
 tài kho sát kh n lactic kháng vi khun Edwardsiella
ictaluri gây bnh gan thn m trên cá tra, nhm tìm ra mt s chng vi khun
lactic có kh i kháng vi khun E. ictaluri. Ngun vt li phân lp
vi khun lactic trong thí nghii mui chua và rut cá rô phi
c thu mua  các ch a bàn Thành ph C, vi khuc
phân lp bng MRS agar và MRS broth. Các dòng vi khuc
chn lc da trên kh i CaCO
3
c thêm vàng MRS
agar và có các ch tiêu sinh hóa 
tính s c chn phân lp. Kt qu là 34 chng vi khuc phân
lp và c kho sát tính kháng vi vi khun E. ictaluri b

ging khuch tán. B9 dòng vi khun lactic sinh ra vòng
kháng khun và có kh n E. ictaluri c tìm
thy, ng vi khun RP11.1 và RP8.1 sinh vòng kháng khun
vng kính ln nht lt là 12 và 10,3 mm. Hai chc
la chn  nh danh bc phân t, gii trình t n
gen 16S ribosomal ARN. Vin bi công ty TNHH
TM và DV Nam Khoa, cho kt qu chng RP11.1 ng hình 100% và chng
ng hình 99% vi vi khun Lactobacillus plantarum.


iv

MC LC

LI C ii
TÓM TT iii
DANH SÁCH BNG vi
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH MC T VIT TT viii
 1
T V 1
1.1 Gii thiu 1
1.2 M tài 2
1.3 N tài 2
 3
TNG QUAN TÀI LIU 3
c v vi khun Edwardsiella ictaluri gây bnh gan thn m trên
cá tra 3
m chung ca vi khun Edwardsiella ictaluri 3
2.1.2 Du hiu bnh lý và ph loài cm nhim 3

2.2 Vi khun lactic (LAB: Lactic acid bacteria) 4
2.2.1 Gii thiu v vi khun lactic 4
2.2.2 Khái quát v phân loi 5
2.2.3 Vi khun lactic trong quá trình lên men 6
2.2.4 Kh n ca vi khun lactic 7
2.3 Mt s nghiên cu v vi khung vt thu sn 8
nh danh vi khun lactic bc phân t 9
 11
VT LIM 11
3.1 Thm 11
3.2 Vt liu thí nghim 11
3.3 u 11
p vi khun lactic t ru
ci mui chua 11
 n E. ictaluri ca các
dòng vi khun lactic 12
3.3.3 nh danh vi khun 13
Trang


v

 14
KT QU VÀ THO LUN 14
4.1 Kt qu quá trình phân lp vi khun lactic 14
4.2 Kt qu kho sát kh i kháng vi khun Edwardsiella ictaluri
bng khuch tán (Well diffusion agar) 16
4.3 Kt qu nh danh bi trình t gen 21
 22
KT LU XUT 22

TÀI LIU THAM KHO 23
PH LC A 26
PH LC B 27
PH LC C 28
PH LC D 31
PH LC E 32





vi

G

Bng 4.1 Kt qu kim tra các ch n ca vi
khuc phân lp 14
Bng 4. 2 Các chng vi khun lactic sinh vòng kháng khun  nghim
thc 1 16
Bng 4. 3 Các chng vi khun lactic sinh vòng kháng khun  nghim
thc 2 19
Bng 7.1 Thành phng MRS. 26
Bng 7.2 Các chng vi khun lactic phân lc t rut cá rô phi 28
Bng 7.3 Các chng vi khun lactic phân lc t i mui chua 29
Bng 7.4 Kt qu ng kính vòng tròn vô trùng ca các mi
chng 30



Trang

vii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Kh n ca mt s chng vi khun lactic 9
Hình 4.1 Quá trình phân lp và tách ròng vi khun lactic:
A, B: Phân lp vi khun lactic
n. 14
Hình 4.2 Kh i CaCO
3
ca vi khun lactic (A), mu nhum
Gram tiêu biu (B) 15
Hình 4.3 Kt qu ng khuch tán nghim thc 1 18
Hình 4.4 Kt qu ng khuch tán nghim thc 2 20
Hình 4.5 Các mi chng 20
Hình 7.1 Mt s nh kt qu ng khuch tán 32
Trang


viii



LAB Lactic Acid Bacteria
RP Rô phi
DC i
E. ictaluri Edwardsiella ictaluri
AMC Amoxicillin-clavulanic acid

BHI-B (A) Brain heart infusion borth (agar)
CFU Colony forming unit
CT Colistin sulphate
CT C
CTX Cefotaxime
 ng bng sông Cu Long
DO Doxycycline
FFC Florfenicol
NV Novobiocin
TSA Tryptone Soya Agar
UB Flumequine


1



1.1 
Cá tra (Pangasianodon hypophthamus) là mt trong nhng mt hàng
thu xut khu ch lc ca Vit Nam. Tng giá tr xut khu 
t 1,74 t USD (www.vasep.com.vn).  m bo cung cp ngun nguyên
li và i ph nâng cao sn
 dch bnh xt hi nhiu
 bin nht là các bn m, trng gan trng mang, phù
u, xut huyet al., 2004). Trong s các bnh trên cá Tra nuôi 
ng bng sông C bin và gây thit hi nhiu nht là
bnh gan thn m do vi khun Edwardsiella ictaluri và bnh xut huyt do vi
khun Aeromonas hydrophila gây ra (Nguyn Chính, 2005). T l xut hin
bnh gan thn m trên cá tra khou so vi các
b m  k (68,3%), bu (51,2%) (Trn Anh

N l cht là cao nht (60 - 80%) (Crumlish et al., 2002).
T l hao ht cao nht  n cá git hi nng nht 
n cá la c 300-500g (T Thanh Dung và ctv., 2005).
Do yêu cu thc tin sn xui nuôi phng thâm canh
ng thi s dng nhiu thuc kháng sinh. Tuy nhiên, do vic chn và s
dng          nhy ca vi khun
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp. i vi các loi thuc kháng sinh ngày
càng giu tr n gn (Nguyc Hin,
2008. Trícn bi Nguyn Ngc Trai, 2012). Theo
nghiên cu ca Nguyn Thin Nam và ctv. (2010), nghiên cu tìm thy 97,5%
chng vi khun Edwarsiella ictaluri có hic (t ba loi
kháng sinh tr c bi chng kháng t 6-10 loi kháng sinh
chim t l khá cao 25% s chng kháng vi 8 loi thuc kháng sinh, 20% s
chng kháng 9 loi thuc kháng sinh và 10% s chng kháng 10 loi thuc
kháng sinh.
Chính t nhng nguyên nhân trên mà vic tìm ra nhng gii pháp hn
ch vic s dng thuc kháng sinh hi bo v ngun thuc kháng sinh
d phòng là mt nhim v vô cùng cp bách và cn thit ca nhng nhà khoa
hc thu sn. Hin nay vic nghiên cu s dng các ch phm sinh hc
bit là probiotics, bacteriocin  phòng và tr bng vt thu s
c nhiu nhà khoa hc nghiên cu (Nguyn Ngc
Trai, 2012). T lâu vi khun lactic mt nhóm vi khun hc con
i áp dng mt s  , chng cho thc


2

phm. ch bin nhiu loi thc ph      
Thi gian gmt s ng dng nhóm vi khun hu ích này
c thu sn  phòng tr bn hình là vic nghiên cu

phân lp mt s chng vi khun lactic t các sn phm lên men i kháng vi
khun Edwarsiella ictaluri gây bnh gan thn m trên các tra nuôi ca Ngô
Th và ctv. (2011); Nguyn Ngc Trai
(2012).
Do v tài Kho sát kh n lactic kháng vi khun
Edwarsiella ictaluri gây bnh gan thn m trên cá tra (Pangasianodon
hypophthamus) c thc hin mong mun s i mt s u
ích na cho vic phòng tr bnh gan thn m.
1.2 
 tài này nhm kho sát và tìm hiu kh  vi khun lactic i
kháng vi vi khun Edwarsiella ictaluri gây bnh gan thn m trên cá tra.
ng thi c b sung cho nhng nghiên c vic
s dng vi khun lactic cho c phòng tr bnh thy sn.
1.3 N
Phân lp vi khun lactic t mt s sn phm lên men và t ru
ci mui chua và rut cá rô phic thu  mt s ch a bàn Thành ph Cn

Tuyn chn vi khun lactic thông qua thí    
kháng khun Edwarsiella ictaluri ca các dòng vi khun lactic vc phân
lp bng khuch tán.
nh danh 2 chng vi khun lactic có kh  i kháng vi khun
Edwarsiella ictaluri cao nht.


3




2.1  Edwardsiella ictaluri h ga

cá tra
Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri là loài thuc h Enterobacteriaceace, vi khun
Gram âm, c bii (0,75-ng
hong yu, lên men, cho phn 
tính, phn ng indole và H
2
S âm tính. Vi khun E ictaluri phát trin tt 
28
0
C sau 24-48 gi to thành nhng khun lc nh, tròn có màu
trng, không nhân, rìa và có dng nht (T Thanh Dung và ctv.,
2004).
Edwardsiella ictaluri phát trin t   ng chn lc
Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (pH=7,0-7,2) sau 48 gi  nhi 28-
30°C. Khun lc có dng nh li ti, không trong suc 0,5-1,0 mm
(Shotts et al., 1990). Ngoài ra, khi phân lp vi khun Edwardsiella ictaluri
gây bnh trên cá tra  Vit Nam bng TSA sau 48 gi  28°C cho
thy khun lc có dng pinpoint (nh li ti) có rìa xung quanh, màu trng nht,
c t 0,11-0,17 mm (Crumlish et al., 2002).
Theo Plump (1999), vi khun này tn ti trong môc thi
gian ngn hay dài còn tu thuc vào nhi c, nu nhit 
cc là 5
o
C thì vi khun có th tn t 
lên 25
o
C thì thi gian sng ca vi khun này khong 10 ngày. Mt khác, trong
l nhi 5
o

C vi khun tn ti khong 15 ngày, 18
o
C vi khun
tn ti khong 45 ngày và 95 ngày  25
o
C.
2.1.2  
Edwardsiella ictaluri l   c phân lp bi Hawke (1976)
trên cá nheo M (Ictalurus punctatus). Trên cá trê trng (Clarias batrachus) 
Thái Lan (Kasornchandra 1987).  Vit Nam bnh xut hin ch yu trên cá
tra, thnh thong xut hin trên cá basa. Xut hin trên tt c n ca
cá tra. (T Thanh Dung và ctv., 2005).
Tuy nhiên, kh  i ca Edwardsiella ictaluri trên cá nheo
M ph thuc vào nhi c,  18°C gây ch
25°C t l t n 77%. Trên cá nheo M, Edwardsiella ictaluri gây
ra các du hiu b       ng xut huyt trên da 


4

thân, mang, bi, nhng t xut hin trên da,
lan rng ra  n sau ca bnh, phng mang, li mt, bnh mãn tính
vt loét m r phu gia 2 mt gây t l t vong cao
(Plumb et al., 1995). Ngoài ra vi khun E. ictaluri còn gây bnh trên mt s
loài khác cùng gi(I. furcatus), cá sc nga lam (Danio
devario), và cá trê trng (Clarias batrachus) gây thit hi ln v kinh t trong
ngh nuôi cá công nghip  M (Keskin et al., 2002).  Vit Nam t 
1998, bnh gan thn m do vi khun E. ictaluri gây ra lu tiên phát hin
trên cá tra nuôi  ng bng sông Cu Long và gi là bnh BND (Bacillary
Necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001).

Theo Ferguson (2001), du hiu bnh lý  n mi chm bnh cá
gim t s ng hp cá biu hi , da nht nht, có
biu hin xut huyt trên da và hu môn. Du hiu bc thù nht là các
ni quan gan thn t tng xut hin nh m trng vng kính t 1-
3mm biu hi thn. Theo T Thanh
Dung và ctv.(2003) thì bm trng có th xy ra  tt c n phát
trin cng nht là  gin 300-500 g vi nhng du hiu
. Tuy nhiên, cn chú ý là  u ca bnh nhm trng
ch xut hin trên thn hoc t tng ca cá (T Thanh Dung và ctv., 2005).
2.2 Vi lactic ( LAB: Lactic acid bacteria)
2.2.1 
Vi khun lactic là nhóm vi khun Gram (+) (Fooks et al., 1999. 
bi Shea Beasley, 2004) lên men hidrat cacbon khi có hoc không có oxy
và to nên sn phm chính cui cùng là axcid lactic (Jay, 2000). Hu h
u hô hp k khí tùy tin hoc vi hiu khí (Endang, 2010). LAB là nhng
vi khun hình cu hoc hình que thc tìm thy trong s phân hu thc
vt, các sn phm lactic, sn xut phn ca quá trình
i cht ca chúng và là sn phm cc tính này
gn bó vi lch s ca các th, vì s acid hoá còn là nhân t km
hm s phát trin ca các nhân t gây hng.
(theo
c bit LAB có nhu cu ch ng phc tp, không có kh
phát tring thun khit cha khoáng, glucoza và NH
4
+
. 
s vi khun lactic cn các vitamin nhóm B, biotin, axit folic, axit nicotinic và
các acid amin khác. Trong t nhiên vi khun lactic sng hoi sinh, chúng s
d  ng thc vt. Nhi  thích
hp cho vi khun lactic t 10 - 40

0
C (Nguy  t và Nguyn Duy


5

Tho, 1986).         , khu 

, LABsn xut các hp cht hcung
cp   cho các sn phm lên men (Caplice and Fitzgerald,
1999Beasley, 2004).
2.2
Vi khu  c phân l u tiên trong sa (Carr et al., 2002;
Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) sn pht, các sn
phm sa, rau quc ung và bánh mì lên men (Aukrust and Blom, 1992;
Caplice and Fitzgerald, 1999; Harris et al., 1992; Gobbetti và Corsetti, 1997;
Jay, 2000; Liu, 2003; Lonvaud-   et al., 2002). LAB
xut hin t nhiên trong các thc phm lên men (Caplice and Fitzgerald, 1999)
c, phân bón và cht thi (Holzapfel et al.,
2001). Ngoài ra chúng còn tn ti (Boris et al., 1998; Carroll et
al., 1979; Eideman và Szilagyi, 1979; Elliott et al., 1991; Martín et al., 2003;
Ocaña et al., 1999; Reid, 2001; Schrezenmeir and dng vt
(Fujisawa and Mitsuoka, 1996; Fuller and Brooker, 1974; Gilliland et al.,
1975; Klijn et al., 1995; Sandine et al., 1972; Schrezenmeir and de Vrese,
2001) Beasley, 2004).
LAB ch yu thuc các ging Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Lactococcus, và Streptococcus. Ngoài ra còn có  các ging
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus,
Tetragenococcus, Vagococcus, và Weisella. Chúng thuc b Lactobacillales.
i ta chia vi khun lactic thành hai nhóm: nhóm lên men lactic

ng hình (sn phm lên men ch thun axít lactic) và nhóm lên men lactic d
hình (sn phm lên men ngoài axít lactic còn có êtanol, CO
2
hoc axít axêtic).
ng hình bao gm ba nhóm: cu khun (Streptococcus lactic, S.faecalis,
Pediococcus cerevisia), trc khut (Lactobacillus lactic, L. helvetcus,
L. bulgaricus), trc khu  m (Lactobacillus casei, L. plantarum)
(Fugelsang and Edwards, 2007; Caplice and Fitzgerald, 1999; Jay, 2000;
Kuipers et al., 2000). Vi khun lactic lên men d hình (heterofermentaires): s
dng bng pentose phosphate to sn phm cui cùng không
ch acid lactic mà còn các sn ph
2
, ethanol, axit acetic Các
i din cho nhóm vi khun lactic lên men ng hình Leuconostoc,
Oenococcus, Weissella, và lactobacilli nhóm III (L. brevis, L. buchneri, L.
fermentum, L. reuteri) ( .


6

2.2.3 Vi 
Theo Nguyt (2001), vic s dng vi khu mui
chua rau, qu,  chua thc bo qun thc phm bng
công ngh lên men vi sinh vt. Các vi khun lên men lactic ch yu thuc các
ging: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus. Khi mui rau
qu lên men lactic, s to ra sn pht yêu cu sau: (1) Tng
sinh khi vi khun có ích, át ch các vi sinh vt gây thi. (2) Gây chua, to
 n phm. (3) Chuyn rau qu v dng chín sinh hc
du sun hóa sinh hc trong mui
chua rau qu gm n:

 n 1: Mu   i n  2.5-3% s làm cho môi
ng và các cht t t bào rau qu mt phn s khuch tán
ng, do  khun lactic và các loi vi sinh v
trin.
Gn 2: Do vi khun lactic phát trin mng
gim còn 3-3.5, làm c ch các vi khun khác, rau qu tr nên chua, ngon.
Tuy nhiên, ny kín tng k khí cho vi khun lactic phát
trin hoc cho mui quá 5 - 6% s c ch c vi khun lactic, ni 3% thì
nhiu tp khun l.
G n 3: Khi rau qu    m xung 3, thì ngay c vi
khu    c ch, nm mc s b u phát trin, phân gii axit
lactic thành CO
2
và H
2
O, sn phm bu có váng và môi tng gim chua,
có mùi mc, có nhiu bt khí.
    ng 5 - 10mg acid lactic/ml và có
khong 10
9
t bào vi khun, không có vi khun gây bnh, có kháng sinh
Nisine, Diplococcine nên ru chnh h vi sinh vt
ng rut. Ngoài ra, vi khuc ng dng trong vic sn xut
sc bit, sn phm axit lactic ca quá trình lên men ngô,
khoai, sc dùng rng rãi trong công nghip nhum, thuc da,
trong y hc, ch to cht d   s hin din ca vi khun
Lactobacillus delbruskii.
Tuy nhiên, vi khu gây ra nhng tác dng có hi
cho sn xut công nghii sng, khi s phát trin ca chúng không theo
ý mun cu vc ngt b nhim khun lactic

s gây hing vc, b y
u kin bt li cho s phát trin ca ni thun li cho vi
khung c u kém cht
ng, vi khung thy  Lactobacillus manitopocrum.


7

Theo Ringø et al. (1998), vi khun lactic thuc các ging 
Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, và Carnobacterium thuc h vi
sinh vng trong rut cá khe. Và m ca vi khun lactic liên
ng tiêu hóa b ng bi yu t ng
   mn. Tuy
nhiên, mt s chng cng vt thy sch
bp k qua  các trang tri Nht
Bn nuôi cá hi vân (rainbow trout)      
(yellowtail) (Kusuda et al., 1976). Các tác nhân gây bc xác
nh là Streptococcus sp.    c phân loi li là Enterococcus
(Kusuda, 1992), tip theo là Lactococcus garvieae (Domenech et al., 1993;
Eldar et al., 1996). Ngày nay, s xut hin bnh trong nuôi trng thy sn
   n rng có th do các vi khun khác nhau thuc các
ging ca vi khu   Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và
Carnobacterium.
2.2.4  vi 
i cht vi khun lactic sinh các sn phm có tác
dng c ch s ng ca các vi sinh vt có h
.
(theo:
Theo Ngô Th  và ctv (2011), kt qu nghiên cu nhng
y vi khun lactic không ch có th lên men rau qu mà

còn có th sinh các cht kháng khun bacteriocin chng li vi khun gây bnh
c s dng trong bo qun thc phm.
Hu ht vi khuu có th tng hp bacteriocin nên thành phn
kháng khun r       rt lâu các
   c s dng rt r    c bo qun thc
phn hình là Nism Nisaplin xut hin trên th
  t cht bo qun thc ph      
nhn sn ph    t cht bo qun thc phm an toàn sinh hc
(Ngô Th và ctv., 2011) và
ctv (2011) trong 46 dòng vi khun phân lp t si mui chua,
i 23 dòng có kh i 7 dòng
có kh   n mnh v ng kính vòng vô khun l 
11mm, 11 chng kháng khun trung bình vng kính vòng kháng khuân
5-10mm, 5 chng kháng khun yu vi 
5mm. (vi dòng vi khun ch th la B. suptilis).


8

Theo Ouwehand et al. (2004), trong vi khun lactic có sn các hp cht
có tính kháng khu     -pyrrolydone-5-
carboxylic và khi chúng sinh   o ra nhng thành phn có tính
kháng khuacid lactic, bacteriocin, CO
2
, H
2
O
2
và c diacetyl.
2.3 

u ra mt loi môi
ng nhân t nghiên cu LAB mang tên MRS theo tên ca 3 tác gi này.

Brachionus plicutilisLactobacillus plantarum
Carnobacteriurn sp  
(Scophthalmus maximus)
Vibrio  ngày
th 9. Và n  t  a vi khun lactic khi giàu hóa là 10
7
- 2 x 10
7

CFU/ml/ngày, t l sng ca u trùng là 53% sau 72 gi tip xúc vi mm
bnh so vi chng t l sng ch u này cho thy vi khu
 kháng ca ng li mm bnh vibrio.
Mt s chng vi khun Lactobacillus sp. c phân lp t rut và
d dày ca cá tra và cá rô phi có kh c ch c vi khun E. ictaluri và
Aeromonas hydrophila gây bnh trên cá tra. Tuy nhiên ch có mt chng Lb12
to ra bacteriocin có kh c ch c 2 loài vi khun gây bnh trên. Kt qu
gii trình t n gen 16S rRNA cho th  ng hình 100% vi
Lactobacillus suntoryeus LH5 (Nguyn Ngc Trai, 2011). Nghiên c
v kh    n gây bnh ca chng vi khun lactic CC4K và
chng vi khun Bacillus sp c phân lp t c
 ci bc ký bn mng và ph hng ngoi cho thy cht
kháng khun do chng CC4K tit ra là axit lactic, còn chng HY1 có kh 
kháng vi sinh vt là do cht kháng sinh ngoi bào không có bn cht
polypeptide. Gii trình t n gen 16S rRNA cho thy ch
ng 99,1% vi Lactococcus lactis CC4K, chng 99% vi
Bacillus subtilis ctv., 2007).
Ngoài ra, Talpur et al. (2012)t hn hp vi

khun lactic bao gm: Lactobacillus plantarum, L. salivarius và L. rhamnosus
c phân lp t rut ca Gh xanh (Portunus pelagicusc thêm vào
u trùng Gh xanh (Portunus pelagicus) hàng ngày vi
s ng 10
6
, 5 x 10
6
và 10
7
cfu/ml. Kt qu cho thy t l sng là 10,3%,
ng theo s ng vi khun b ng
c, so vi 2.2%, 3.3% và 2.8%  i chng. Hong ca các enzyme tiêu


9

c bit là protease ng và pH i
i chng.
c bit vi vi khun E. ictaluri có mt s nghiên c n hình và
mang tính kh thi bng vic ng dng kh n c 
ng ng dng i kháng vi vi khun này. Theo nghiên cu ca Nguyen
Thanh Tam et al. (2011) t 80 chng LAB thu thp t 100 mu cá lên men 
bn thành ph  ng bng Sông Cu Long thì hiu qu kháng khun
th hiên  tt c các dòng LAB phân lc vi E. ictaluri và 2 dòng vi
khun ch th: B. coagulans, P. pentosaceus bng khuch
tánng kháng vi E. ictaluriB. coagulans
và 20 dòng kháng P. pentosaceus, Trong 39 dòng th hin kh  
khun E. ictaluri thì 15 dòng kháng khun vng kính vòng vô trùng ln
2,5-ng kính vòng vô trùng trung bình 1,5-2,5mm, 9 dòng
còn li có ng kính vòng vô trùng th   (theo p 

ging khuch tán).









Hình 2.1 Kh kháng khun ca mt s chng vi khun lactic
(Ghi chú:2 vòng tròn vô trùng với vi khuẩn chỉ thị P. pentosaceus (A, 1A, 2A, 3A-
dịch vi khuẩn chưa qua lọc; 4A, 5A, 6A-dịch vi khuẩn qua lọc), B. coagulans (B)
and E. ictaluri (C); 1C vòng kháng khuẩn lớn; 2C-trung bình và 3C-nhỏ) của những
dòng vi khuẩn lactic theo phương pháp giếng khuếch tán (Nguyen Thanh Tam et al,
2012).)

Vi khun lactic có th nh danh bn thng bng
vic kim tra các ch tiêu sinh hóa, tuy nhiên  thm hin ti vinh


10

dang vi khun bc phân t s cho kt qu chính xác,
   u. nh danh b   c phân t
(gii trình t gen 16S-ARN). nh trình t rARN 16S ca các chng vi
khu    a Sakiyama et al. (2009). n gen 16S rRNA
gm khong 1542 nucleotid, 16S ribosomal RNA (16S rRNA) là b phn cu
 30S ca ribosomes  prokaryote. c
s dng cho nghiên cu v ngun gc phát sinh loài bi vì nó có tính bo toàn

cao gia các loài khác nhau ca vi khun và archaea. Vic phân tích trình t
cc thc hin bng vic gii trình t n gen này
và dùng mt s cp mc g thc hin phn ng
PCR. Mc tiêu cùa các primer này là nhng vùng bn gen 16S
rRNA và khu i chúng thành nhiu phn khác nhau. Cui cùng nhng
phc khu i này có th c ni v  có toàn b trình t
amino acid c bin nhc
thit k bc s dng hip primer 27F và
1492R. Tuy nhiên, vic phát trin mt s   to sn phm PCR vi
chiu dài gen ng  c v cho nhng m     c
nghiên cu (
Dubernet et al       ng ca các trình t
nucleotid thuc vùng gin gen 16S rRNA và 23S rRNA ca nhiu
dòng Lactobacillus và thit k nên primer LbLMAl-rev (5 -CTC AAA ACT
AAA CAA AGT TTC-3). Nh vào primer chuyên bit này cùng vi
-] (5-CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA-3 ) thông
qua phn nh danh Lactobacillus  m ging. Cp primer
 c nhiu tác gi s d    nh danh nhiu loài thuc
ging Lactobacillus et al., (2005), Klayraung et al., (2008); trích
dn bi: Nguyn Ngc Trai và Nguy (2011).
Phòng thí nghim NK- R&D c
phát hic cp mt tên là 16s-F và NK16s-R, cp mi này
khun DNA dài 527 bps cha các trình t phân bit ging và
loài các vi khung thành công qui trình PCR cho gen 16S
rDNA và qui trình gii trình t trc tip sn ph nh danh vi
khun .


11



3.1 
Thi gian thc hin t tháng 9/12n 12/12/2013. m tin
hành thí nghim: B môn Bnh hc Thu sn, Khoa Thu si hc Cn
.
3.2 
Dng c: ng nghiu nhit,
que cu col, pipet 10-100µl, pipet 100-1000µl,
: ly tâm,
Hóa chng: Mô s dng trong thí nghim gm có:
ng
             
   (NB) hoc BHIB (Brain-Heart Infusion Broth). Môi
ng BHIA (Brain-Heart Infusion Agar). Hóa cht nhum Gram, test
oxidase, catalase, CaCO
3.
Cn tuyi, ct, NaCl, parafin lng, parafin
giy.
Vt liu: Cá rô phi,  i mui chua    
pháp thu mu. Ngun vi khun E. ictaluri c cung cp t Bnh hc Thy
sn, Khoa Thy si hc C.
3.3 
3.3vi khurô phi 

thu mu: Sn phi mui chua) và cá
c thu  a bàn Thành ph Cu cho mi loi
sn phm ti mm). Thu tt c 12 mu.
ng pháp phân lp vi khun lactic t i chua và rut cá
rô phi (c thc hin d nghiên cu ca Ngô th 

và ctv., 2011; Nguyvà Nguyn Ngc Trai, 2011).
Cá  phòng thí nghic tit trùng bên ngoài bng
cn 70
0
u thut ly phn vt cht bên trong d dày và mn rut
sau ca cá. Nghin mu ruc ct tit trùng .  lng dung dch va
nghin, thu phn dch trong  bên trên. Ly phn dch trong cho vào môi


12

ng MRS broth,  u kin k khí  37
0
C, 48 gi. Cy ria mu lên
ch MRS có b sung 0.5% CaCO
3
 k khí  37
0
C, 48 gi.
i vi mu i chua, mu s c nghin (ly c phc và
phn cái ca mu) và làm các thao tác   mu rut cá rô phi và
   trong 48 giy ria vi khun t ng MRS broth
 48 gi  ng MRS agar có b sung 0.5% CaCO
3
 k
khí  37
0
C, 48 gi.
Các chng vi khun s c chn khi khun lc ca chúng có dng
trc, không màu, b láng, li, bìa nguyên hoc chia thu. Các khun lc

này phi nng cy và không ln vi nhng khun lc có hình dng
và màu sc l. Chúng s     tin hành nhum Gram, th
catalase, th oxidase, và kim tra kh i CaCO
3
. Vi khun lactic
c xác nhn khi các dòng phân lp có hình tròn hoc hình que, không sinh
bào t, catalase âm tính, oxidase âm tính và phân gic CaCO
3
(Ngô th
và ctv., 2011). Nhng dòng vi khun lactic này s c nuôi
ng M  lc thí
nghim tip theo.
Vì vic thêm CaCO
3
  ng phân lp vi khu  i
không phc tp nên trong quá trình phân lp CaCO
3
c thêm vào môi
y ch nhng khun lng cha CaCO
3
thì
mc chn cho nhc tip theo.
 nh mt s m sinh hoá ca vi khun (
xem chi tit  ph lc B)
3.3E. ictaluri 

Tính kháng khun ca vi khuc kim tra b
khuych tán trên ging thch (well diffusion agar).
Chun b dch huyn phù vi khun ch th : Vi khun E. ictaluri c
nh danh và tr trong t âm (-80

o
c phc hng TSA 
28
o
C. Sau 48 gi, quan sát hình dng khun lc, nhum Gram ki  
thun vi khu    n thun ly khun l  c
muc dung dch vi khun có m khong 10
8
cfu/ml
i ng Macfarlan s 3)
Cho 0,1ml dung dch vi khun ch th  agar ru. Tr
l 4
o
o nhng ging trên thch vng
kính 6mm bu típ vô trùng.


13

Vi khuc nuôi trong ng MRS lng  u kin
k khí trong 48 và 72 gi,  u kin nhi 37
0
y 1ml dung dch
nuôi  ly tâm 8000 rpm trong thi gian 15 phút  nhi 4
0
C thu
phn dch trong bên trên.
Ly 100µl phn dch trong sau khi li tâm nh vào mi ging c 
th  a dòng vi khun ch th, ging th c to b u col có
t trùngc  lnh vi nhi

4
0
 khuch tán các cht trong dch trong  các ging
trong 60 phút r   28-30
o
C cho vi khun ch th phát trin.
nh tính kháng khun ca vi khung kính vòng vô
khun quanh ming ging. Tính kháng khuc biu hing kính
vòng vô khun l sau khi tr a ging (Ngô Th
ctv, 2011), hoc ln 1mm theo Nguy
Nguyn Ngc Trai, 2012. So sánh kh   n ca các dòng và
chn lc nhng dòng vi khun lactic có kh n cao.
3.3.3  
Hai dòng vi khun ln nht s c ly
trích ARN ti Khoa Thy sn, i hc Ci mn công ty
TNHH TM và DV Nam Khoa  nh danh bi trình t
gen 16S- rARN.


14

4
T  VÀ 
 
i và cá rô phi còn sng c thu mua và vn chuyn t các ch
thua bàn Thành ph C phòng thí nghim Khoa Thy sn, i
hc Cng thi gian ngn không quá mt gi. Ngay sau khi
 phòng thí nghim mc x lý và phân lp vi khun lactic, sau 2
ngày nhng khun lm khác nhau v ngun gc, hình dng,
màu sc s c tách ròng tip tc my ròng, và

s c tin hành kim tra các ch a vi khun lactic
m Gram, Catalase, oxidase, ghi nhn l nc các
ch i.













Hình 4.1 Quá trình phân lp và tách ròng vi khun lactic: A, B: Phân lp vi
khun t mi và run.

C
D
A
B


15

Hình 4.2 Kh ni CaCO
3
ca vi khun lactic trên MRS agar
b sung 0,5% CaCO
3
(A), mu nhum Gram (Gram (+)) tiêu biu (B).
Trong quá trình thí nghim, 34 chng vi khun lactic c phân lp
ng t i mui chua và 20 chng t rut cá rô phi (xem
ph lc C). Các chng phân lc quan sát hình thái khun lc, quan sát t
i kính hin vi. Kt qu nhuu âm tính
u có kh i CaCO
3
da theo các ch  cp trong
nghiên cu ca Dung et al. (2011)ng chi nhn thông tin chung
v các dòng vi khun phân lc.
Bng 4.1 Kt qu kim tra so sánh các ch n ca vi khun
c phân lp.

Lactobacillus sp. (*)
V(**)
Gram
+
+

Que

Catalase

-
-
Oxidase
-
-

-
+/-
Phân 
3

+
+
Ghi chú:* Dòng Lactobacillus sp. được phân lập bởi Nguyễn Văn Thành và
Nguyễn Ngọc Trai (2012).** Vi khuẩn lactic phân lập từ đề tài này.
B
A


16

Qua s liu t bng trên cho thy có s khác bit v hu 2 ch tiêu 
bn là hình dng t bào và kh ng mà các dòng vi khuc
phân lp t  tài này so vi nghiên cu ca Nguyn
Ngc Trai (2012). Trong khi tt c các dòng vi khun Lactobacillus sp mà
nghiên cu ca Nguyn Ngu có dng
t bào hình que không có kh  tài này li phân lc
nhiu chng vi khun lactic hình cu ln hình que, và mt s chng có kh
ng. Vì vy có th nhnh nhng dòng vi khu tài
này phân l c có th bao gm nhng dòng vi khun thuc ging

Lactobacillus sp và còn có thêm nhng dòng vi khun khác ging
Lactobacillus sp.
 Edwardsiella ictaluri
 tán (Well diffusion agar)
    kt qu có 9 chng vi khun lactic to vòng
kháng khun vi vi khun ch th Edwardsiella ictaluri (xem Bng 4.1 và 4.2).
Chim 26% tng s chng phân lc.
, 2 chng vi khun ng kính vòng vô
khun ln nht lt là 12 mm và 10,3 mm có kh cao vi vi
khun ch th ng kính vòng vô khun lc
trong nghiên cu ca Ngô Th  , 2011 ). Hai chng RP312 và
ng kính vòng vô khun nh nht lt là 0,3 mm và 0,7 mm
c coi là không có kh i kháng vi vi khun ch th ng kính
vòng vô trùng nh c ca Galindo (2004); trích dn bi
Nguyguyn Ngc Trai, 2012).
ging khuch c thc hin vi 2 nghim thc và ba
ln lp li  mi nghim thc. Vi khun ch th Edwardsiella ictaluri trong thí
nghic cung cp t B môn Bnh hc thy sn, Khoa Thy si hc
C  c khi tin hành thí nghim chng vi khun E. ictaluri c
kim tra các ch alase, oxidase và nhum Gram.
Nghim thc th nht
Tin hành ly tâm dung dch vi khun sau 2 ngày nuôi  8000 vòng/phút,
trong 15 phút  nhi 4
0
C. Thu 100µl phn dch trong bên trên cho
vào ging thc to bng kính 6 mm, trên môi trng
 thc hing khuch tán.