khảo sát ảnh hưởng của chất điều hõa sinh trưởng và nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo măng tây xanh (asparagus officinalis l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÕA
SINH TRƢỞNG VÀ NƢỚC DỪA LÊN SỰ SINH TRƢỞNG
VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO MĂNG TÂY XANH
(Asparagus officinalis L.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN HOÀNG KHUYÊN
MSSV: 3102822
LỚP: CNSH K36


Cần Thơ, tháng 05/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÕA

SINH TRƢỞNG VÀ NƢỚC DỪA LÊN SỰ SINH TRƢỞNG
VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MĂNG TÂY XANH
(Asparagus officinalis L.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ LIÊN NGUYỄN HOÀNG KHUYÊN
MSSV: 3102822
LỚP: CNSH K36






Cần Thơ, tháng 05/2014




PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN





Nguyễn Thị Liên Nguyễn Hoàng Khuyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN









Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG




LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi
còn nhận được sự hướng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ của rất nhiều người.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh
đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Trường Đại học Cần Thơ đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng
dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Xin gửi lời cám ơn đến các thầy cô, cán bộ của Viện, đặc biệt là cô Nguyễn Thị
Liên hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài.
Xin cảm ơn cha mẹ, anh chị và các bạn đã khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập.
Tôi xin kính chúc quý thầy cô, anh chị cùng các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe
và công tác tốt.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Hoàng Khuyên

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
i
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

TÓM LƢỢC


Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa lên sự
sinh trường và phát triển mô sẹo măng tây xanh (Asparagus officinalis L.)” được tiến
hành nhằm xác định các môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của mô
sẹo măng xanh góp phần làm cơ sở cho công tác nhân giống và cải thiện giống. Các
mô sẹo được cấy vào môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (BA 0-2
mg/l kết hợp NAA 0-1 mg/l), môi trường có bổ sung nước dừa (0-200 ml/l) và môi
trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (BA 0,5 mg/l kết hợp IBA 0-0,3 mg/l).
Kết quả thí nghiệm cho thấy ở thời điểm 30 ngày sau khi cấy môi trường MS có bổ
sung BA 0,5mg/l và NAA 0,5 mg/l được chọn để nhân cụm mô sẹo măng tây xanh với

đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo 200,67%. Mô sẹo phát triển tốt nhất trên
môi trường MS có bổ sung nước dừa 200ml/l. Tuy nhiên, nghiệm thức cho hiệu quả
kinh tế là nghiệm thức có bổ sung nước dừa 150 ml/l cho đường kính gia tăng tương
đối của mô sẹo là 162%. Ở thời điểm 60 ngày sau khi cấy, môi trường MS có bổ sung
BA 0,5 mg/l và IBA 0,1 mg/l cho số chồi nhiều nhất đạt 33,67 chồi/cụm với chiều dài
13,52 mm/chồi.
Từ khóa: Chất điều hòa sinh trưởng, mô sẹo măng tây xanh , nước dừa, phát triển, tái sinh chồi.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
ii
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2. 1. Nguồn gốc và đặc tính thực vật của măng tây 2
2.1. 1. Nguồn gốc của măng tây xanh 2
2.1. 2. Đặc tính thực vật của măng tây xanh 3
2. 2. Phân loại 3
2. 3. Giá trị dinh dƣỡng và giá trị dƣợc liệu 4

2.3.1. Giá trị dinh dưỡng 4
2.3.2. Giá trị dược liệu 5
2. 4. Phƣơng pháp nhân giống măng tây truyền thống 5
2. 5. Phƣơng pháp nuôi cấy mô 6
2.5.1. Đôi nét về nuôi cấy mô 6
2.5.2. Thành phần môi trường nuôi cấy 7
2. 6. Sơ lƣợc về mô sẹo 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
iii
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

2. 7. Các nghiên cứu liên quan 14
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 16
3. 1. Phƣơng tiện 16
3.1. 1. Thời gian và địa điểm 16
3.1. 2. Dụng cụ, thiết bị 16
3.1. 3. Nguyên vật liệu thí nghiệm 16
3.1. 4. Hóa chất 16
3.1. 5. Điều kiện thí nghiệm 17
3. 2. Phƣơng pháp 17
3.3. Bố trí thí nghiệm 17
3.3.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp BA-NAA lên sự sinh trưởng của mô
sẹo măng tây xanh 17
3.3.2. Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô
sẹo măng tây 18
3.3.3. Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nước dừa lên sự sinh trưởng của mô sẹo măng
tây xanh 19
3.4. Xử lý số liệu 20
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp giữa BA-NAA lên sự sinh trƣởng của

mô sẹo măng tây xanh 21
4.2. Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô
sẹo măng tây 24
4.3. Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nƣớc dừa lên sự sinh trƣởng của mô sẹo măng
tây xanh 27
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
iv
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng trong nghiên cứu
Phụ lục 2: Kết quả thí nghiệm
Phụ lục 3: Kết quả thống kê

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
v
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Giá trị dinh dưỡng trong chồi măng tây tươi (100 g) 4
Bảng 2: Nhu cầu các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy 11
Bảng 3: Một số chất dinh dưỡng có trong nước dừa (100 g) 13
Bảng 4: Tỉ lệ nồng độ BA-NAA bổ sung trong môi trường 18
Bảng 5: Tỉ lệ nồng độ BA-IBA trong môi trường 19
Bảng 6: Hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường 20
Bảng 7: Hiệu quả của sự kết hợp tỉ lệ BA-NAA lên đường kính gia tăng tương 22
đối của mô sẹo măng tây xanh 22
Bảng 8: Kết quả khảo sát hiệu quả của sự kết hợp BA- IBA lên sự tái sinh chồi ở
thời điểm 60 ngày sau khi cấy 25
Bảng 9: Hiệu quả của nước dừa lên đường kính gia tăng tương đối (%) mô sẹo măng
tây xanh 28

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
vi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 1. Măng tây xanh 2
Hình 2. Mô sẹo măng tây 16
Hình 3. Màu sắc mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy 24
Hình 4. Chồi măng tây trên môi trường có BA-IBA 26


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
vii
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

TỪ VIẾT TẮT
2,4-D: 2,4- diclorophenociacetic acid
ATP: Adenosine triphosphate
BA: 6-benzyl adenin
CAM: Crassulacean acid metabolism
DNA: Deoxyribonucleic acid
IAA: Indoacetic acid
IBA: indole-3-butyric acid
MS: Skoog & Murashige (1962)
NAA: α-Naphthalene acetic acid
NSKC: Ngày sau khi cấy
NT: Nghiệm thức
TDZ: Thidiazuron
RNA: Ribonucleic acid

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
1
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Măng tây là một loại rau được dùng làm thức ăn và dược liệu. Theo Phạm Hoàng
Hộ (2000), măng tây được trồng để lấy măng ăn, còn lá măng tây dùng để trang trí.
Ngoài ra, măng tây còn có vai trò dược liệu, giúp cơ thể lợi tiểu, phục sức cho tim, trị
tê thấp, ung thư và chữa một số bệnh khác.
Trên thế giới, măng tây được trồng nhiều vùng trên thế giới như ở châu Âu (Đức,
Tây Ban Nha, Ý, ), châu Á (Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, ), châu Mỹ (Hoa Kỳ,
Peru, Mexico, ), châu Úc và châu Phi.
Ở nước ta măng tây được trồng ở nhiều địa phương như ở Nghệ An, Bình Thuận,
thành phố Hồ Chí Minh, Bến Tre và một số địa phương khác. Mặc dù đây là loại cây
trồng còn khá mới so với những giống cây trồng khác nhưng măng tây đang góp phần
giúp tăng thu nhập cho nông dân. Ngày nay, nhu cầu giống cây để mở rộng diện tích
canh tác của nhiều người tăng nhưng giá cả hạt giống còn cao. Vì thế việc sử sụng các
hạt từ các cây lai để làm giống là khó tránh khỏi. Điều này làm cho cây con tạo ra
không đồng đều về mặt di truyền và có thể mang mầm bệnh. Kết quả là năng suất của
măng tây giảm đáng kể. Trong khi đó, việc nhân giống măng tây bằng phương pháp
nuôi cấy mô có thể khắc phục tình trạng trên vì đây là phương pháp cho hệ số nhân

giống cao, tạo được số lượng lớn cây con sạch bệnh trong thời gian ngắn.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài “Khảo sát hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa lên sự sinh
trưởng và phát triển của mô sẹo măng tây xanh (Asparagus officinalis L.)” nhằm tìm
ra môi trường thích hợp để nhân mô sẹo măng tây xanh. Từ đó làm nguyên liệu cho
công tác tạo giống măng tây xanh.



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 2
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2. 1. Nguồn gốc và đặc tính thực vật của măng tây
2.1. 1. Nguồn gốc của măng tây xanh








Hình 1. Măng tây xanh
( 4/8/2013)
Trên thế giới
Trên thế giới, măng tây được trồng đầu tiên ở khu vực Địa Trung Hải.
Vào đầu thế kỷ XI, măng tây cũng được nhắc đến như một loại rau trong tu viện

ở Pháp và sau đó được trồng ở Đức.
Thế kỷ XVI, măng tây được trồng nhiều ở Anh và Pháp.
Thế kỷ XVII, măng tây được trồng ở Hoa Kỳ.
Thế kỷ XIX, măng tây trắng được biết đến ở Hà Lan.
Ngày nay, măng tây được trồng phổ biến trên thế giới như châu Âu, châu Á, châu
Phi, châu Úc, châu Mỹ. Một số quốc gia có sản lượng măng tây cao như: Trung Quốc,
Pháp, Hoa Kỳ, Tây Ban Nha,…
Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, măng tây được trồng ở một số tỉnh (thành phố) như: Nghệ An, Bình
Thuận, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có hai giống măng tây được trồng ở
nước ta là măng tây xanh (giống F California 500) và măng tây trắng (giống F
MaryWashington) (px?ID=45&LangID=1ID, 4/8/2013).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
3
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

2.1. 2. Đặc tính thực vật của măng tây xanh
Theo Đặng Minh Quân (2009) măng tây là cây thân cỏ. Thân măng tây đứng, cao
khoảng 1-2 m, có mang các cành hình lá biến đổi thành lá kim. Măng tây sinh sản hữu
tính. Hoa măng tây đơn tính, có cả hoa đực và hoa cái trên cùng một cây. Hoa rất nhỏ,
có màu vàng và mọc thành cụm 1-4 hoa ở nách lá. Theo Caborali et al. (1993) hoa
măng tây xanh ở giai đoạn đầu là lưỡng tính nhưng sau đó trở thành đơn tính. Hoa cái
hình thành do nhị hoa bị tiêu biến, còn ở hoa đực nhụy hoa ngừng phát triển nhưng
không tiêu biến .
Quả có màu đỏ, nhỏ và có đường kính 6-10 mm. Mỗi quả có 3 ngăn, mỗi ngăn
có 5-6 hạt màu đen. Hạt có vỏ cứng. Quả măng tây độc hại đối với con người.
Thân rễ măng tây là nơi dự trữ chất dinh dưỡng, có nhiều chồi và nhiều rễ con
giúp cây hấp thụ hơi nước.
Cây măng tây thích hợp với vùng khí hậu nhiệt đới có nhiệt độ trung bình 25-
33

o
C và có thể sống 25-30 năm trong điều kiện pH thích hợp nhất là 6,5 hoặc cao hơn
một chút. Đất trồng thích hợp là đất thịt pha sét, giàu chất hữu cơ, lớp đất mặt sâu và
ẩm vừa (Võ Văn Chi, 2003).
2. 2. Phân loại
Vị trí của măng tây trong hệ thống phân loại thực vật như sau:
Giới (Kingdom): Thực vật
Ngành (Division): Magnoliophyta
Lớp (Class): Liliopsida
Bộ (Order): Asparagales
Họ (Family): Asparagaceae
Chi (Genus): Asparagus
Loài (Species): Asparagus officinalis L.
( 4/8/2013)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
4
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

2. 3. Giá trị dinh dƣỡng và giá trị dƣợc liệu
2.3.1. Giá trị dinh dƣỡng
Măng tây được thu hoạch khi măng nhô lên khỏi mặt đất. Nếu măng mọc lên cao
thì măng sẽ cứng, khó ăn. Măng tây có thể thu hoạch quanh năm.
Măng tây là loại rau chứa nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe. Do đó
măng tây được dùng làm thức ăn hàng ngày.
Bảng 1: Giá trị dinh dƣỡng trong chồi măng tây tƣơi (100 g)

Thành phần
Đơn vị tính
Giá trị trung bình
Giá trị nhỏ nhất

Giá trị lớn nhất
Nước
%
93,5
93
94
Đạm tổng
%
1,91
1,5
2,2
Chất béo
%
0,16
0,1
0,21
Cacbonhydrat
%
2,04
_
_
Chất xơ
%
1,31
1,27
1,47
Nito tổng
%
0,31
_

_
Phosphor
mg
45
35
62
Potassium
mg
202
145
280
Sulfur
mg
32
_
_
Calcium
mg
26
19
26
Magiesium
mg
17
8
22
Ferric
µg
684
442

1520
Zinc
µg
397
200
800
Mangan
µg
103
100
300
Copper
µg
153
70
160
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
5
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Vitamin C
mg
20
5
38
Vitamin A
µg
30
_
_

Vitamin E
mg
2
_
_
Glutathion
mg
26
10
45
(Nguồn: Saito và Souci, 2001, trích dẫn bởi Tarek, 2004)
2.3.2. Giá trị dƣợc liệu
Ngoài giá trị dinh dưỡng, măng tây còn được sử dụng như dược liệu do măng tây
có nhiều đặc tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống tổn
thương gan (Negi et al., 2010). Người Hy Lạp và La Mã đã biết dùng măng tây trị đau
răng và ngừa ong chích.
Ngoài ra, măng tây có chứa chất asparagine là một chất lợi tiểu khá tốt, có khả
năng phân cắt các sạn từ acid oxalic và acid urid tồn đọng tại bắp thịt và thận để loại ra
khỏi cơ thể theo đường tiểu nên tốt cho người bị sạn thận. Lượng nước và chất xơ giúp
nhuận trường và trị được táo bón.
Tại Trung Hoa, rễ măng tây được dùng trị ho ngứa cổ, ho ra máu, sưng cổ họng
và táo bón. Theo Trung dược, rễ măng tây có vị đắng, tính ấm có tác dụng nhuận phế,
trấn khái, khử đàm và sát trùng. Các hợp chất trong măng tây có khả năng ngăn ngừa
suy tĩnh mạch, bảo vệ tim, phòng ung thư, ngăn ngừa những bệnh liên quan đến đường
tiêu hóa. Tuy nhiên những người bị viêm khớp cấp tính và bệnh thần kinh không nên
ăn măng tây. ( 4/8/2013)
2. 4. Phƣơng pháp nhân giống măng tây truyền thống
Măng tây thường được nhân giống bằng hạt. Hạt măng tây được ngâm trong nước
lạnh sau đó ủ trong tro trấu. Sau khoảng 5 ngày hạt sẽ nảy mầm sau đó chuyển hạt
sang bịch ươm có đất và phân hữu cơ. Sau khi ươm 3 tháng, cây cao khoảng 25-30 cm

thì có thể đem trồng.
Măng tây cũng có thể nhân giống bằng rễ. Rễ giống được chọn từ những cây
trưởng thành khỏe mạnh từ một năm tuổi trở lên. Sau khi trồng khoảng 4-6 tháng là có
măng thu hoạch. Phương pháp này thích hợp cho việc nhân giống ở quy mô nhỏ nhưng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
6
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

khi ở quy mô lớn rất tốn kém vì tiền vốn mua măng tây giống.
( 4/8/2013)
2. 5. Phƣơng pháp nuôi cấy mô
2.5.1 Đôi nét về nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các mô các tế bào, mô và
cơ quan trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ thành phần. Việc nuôi cấy được
duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được Haberlant (1902) nghiên cứu đầu tiên. Từ đó
đến nay, lĩnh vực này phát triển nhanh chóng, đóng góp vào sự phát triển của sinh học
và nông nghiệp hiện đại.
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đã được nghiên cứu hơn 30 năm. Nhiều phòng thí
nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ sinh học với các trang thiết bị
hiện đại ở các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên
cứu, sở khoa học và công nghệ của tỉnh, thành phố. Nuôi cấy mô ở nước ta đã đạt
được một số thành tựu chủ yếu trong vi nhân giống cây cảnh, cây nông nghiệp, cây
lâm nghiệp và dược liệu. Hiện nay có nhiều vấn đề trong nghiên cứu nuôi cấy mô và tế
bào thực vật như vi nhân giống, tạo phôi soma, tạo hạt tổng hợp, sản xuất các chất biến
dưỡng thứ cấp,…đang được quan tâm nhằm tạo ra những giống mới đáp ứng những
yêu cầu khác nhau.
Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật :
 Tính toàn năng của tế bào: mỗi tế bào đều mang lượng thông tin di truyền đầy

đủ của cơ thể và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện
thuận lợi.
 Khả năng biệt hoá: sự biến đổi một tế bào từ trạng thái tế bào phôi thành tế bào
thể hiện một chức năng riêng biệt nào đó.
 Khả năng phản biệt hóa: khả năng một tế bào đã biệt hóa có thể quay lại tế bào
ban đầu sinh ra chúng-tế bào phôi.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) phương pháp này có một số ưu điểm như:
 Cho hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian nhân giống.
 Tạo ra những cây con sạch bệnh.
 Tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền.
2.5.2 Thành phần môi trƣờng dùng trong nuôi cấy mô
Khoáng đa lƣợng
Nitrogen
Theo Bùi Trang Việt (2002) nitrogen là thành phần của các acid amin, nucleotide,
coenzyme. Nitrogen có trong môi trường nuôi cấy ở dạng hữu cơ và vô cơ. Nitrogen
vô cơ được tìm thấy dưới dạng NO
3
-
và NH
4
+
. Trong quá trình tạo phôi vô tính ở
Medicago sativa cần sự bổ sung NH
4
+

bên ngoài với lượng nhỏ nhất là 12,5 mM
(Walker and Sato, 1981). Trong khi đó nitrogen hữu cơ có thể gặp ở dạng amino acid
hoặc các polyamine. Theo Vũ Văn Vụ (1999) sự kết hợp hai nguồn nitrogen giúp mẫu
giảm được sự thiếu hụt nitrogen và giúp mẫu sinh trưởng tốt hơn.
Phosphor
Phosphor là thành phần của một số đường phosphate, acid nucleic, nucleotide,
coenzyme. Phosphor trong nuôi cấy mô thường dùng ở dạng H
2
PO
4
-
, HPO
4
2-
và PO
4
3-
(Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh, 2008).
Potassium
Potassium có vai trò trong sự cân bằng ion, cử động khí khẩu (Bùi Trang Việt,
2002). Potassium cũng làm tăng tính thấm của thành tế bào đối với các chất khác, làm
tăng cường độ quang hợp và ảnh hưởng mạnh đến hô hấp (Vũ Văn Vụ et al., 1998).
Potassium được cây hấp thụ dưới dạng K
+
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Magnesium
Magnesium là thành phần của chlorophyll có chức năng hoạt hóa các enzyme
trong hô hấp, quang hợp và sinh tổng hợp acid nucleic (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Cây
hấp thụ magnesium dưới dạng Mg
2+

(Bùi Trang Việt, 2002).
Calcium
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
8
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Calcium là thành phần của vách tế bào, màng tế bào, cofactor cho một số enzyme
liên quan đến sự thủy phân ATP và phospholipids. Cây hấp thụ calcium dưới dạng
Ca
2+
(Bùi Trang Việt, 2002).
Sulfur
Sulfur là thành phần của một số acid amin như cystein, methionin, biotin. Sulfur
được cây hấp thu dưới dạng SO
4
2-
(Bùi Trang Việt, 2002).
Sodium
Sodium liên quan đến sự tái sinh phosphoenolpyruvat trong thực vật C
4
và CAM
và thay thế kali trong một số chức năng (Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh, 2008).
Chloride
Chloride cần cho sự phân chia tế bào của lá và rễ, điều hòa quá trình đóng mở
khí khẩu và đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang phân ly nước (Nguyễn Bảo
Toàn, 2010).
Khoáng vi lƣợng
Bor
Bo liên quan đến quá trình tổng hợp acid nucleic, sự vận chuyển carbohydrate
(Bùi Trang Việt, 2002), điều hòa hoạt động của enzyme phenolase, biến dưỡng acid

phenolic và tổng hợp lignin (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Mangan
Mangan là thành phần porphyrin diệp lục tố có chức năng hoạt hóa nhiều enzyme
trong hô hấp và quang hợp. Cây hấp thu mangan dưới dạng Mn
2+
(Bùi Trang Việt,
2002).
Zinc
Zinc cần cho hoạt động của nhiều enzyme, tổng hợp auxin và diệp lục tố. Cây
hấp thu zinc dưới dạng Zn
2+
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Molypden
Molypden là thành phần của một số enzyme như nitrogenase, nitrat reductase.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
9
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Cây hấp thu molypden dưới dạng MoO
4
2-
(Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh,
2008).
Copper
Copper tham gia hoạt hóa một số enzyme trong hô hấp và trong vận chuyển điện
tử (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Cobalt
Cobalt là thành phần vitamine B13 có liên quan đến sự tổng hợp acid nhân. Cây
hấp thu cobalt dưới dạng Co
2+

(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Ferric
Ferric là thành phần của nhiều enzyme có vai trò quan trọng trong tổng hợp diệp
lục tố, thành phần của các cytochrome và protein liên quan đến quang hợp (Nguyễn
Bảo Toàn, 2010).
Ferric thường tạo phức hợp với các thành phần khác khi pH môi trường thay đổi.
Phức hợp này thường mất khả năng giải phóng ferric cho các nhu cầu trao đổi chất
trong tế bào. Trong nuôi cấy mô ferric dùng dưới dạng phức hợp với Ethylene Diamin
Tetraacetic Acid vì các phức chất này giải phóng ferric trong một phạm vi pH khá
rộng (Lê Trần Bình et al., 1997).
Nguồn carbonhydrate
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng
nhưng một số trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng
nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Do đó cần đưa vào môi trường nguồn
cacbon hữu cơ. Lượng chất hữu cơ cao sẽ hạn chế việc hấp thu nước của mô cây.
Ngược lại, hàm lượng chất hữu cơ thấp sẽ gây ra hiện tượng thủy tinh thể (Vũ Văn Vụ
et el. , 2006). Nguồn cacbon thường dùng là sucrose với nồng độ là 1-6%, tùy mục
đích nuôi cấy (Lâm Ngọc Phương và Lê Minh Lý, 2012). Ngoài sucrose có thể dùng
thêm một số nguồn cacbon khác như glucose, maltose, lactose, galactose và cả những
dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrin. Các loại rượu như ethanol,
methanol hoặc acid hữu cơ thì rất độc không phù hợp cho tế bào.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Vitamin
Các loại mô và tế bào thực vật có khả năng tổng hợp các loại vitamin nhưng thường
không đủ về lượng do đó cần bổ sung từ bên ngoài (Lê Trần Bình et al., 1997).

Vitamin B1 (Thiamin)
Là chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy. Khi bị hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt
độ cao vitamin B1 sẽ bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol nhưng tế bào có khả
năng tổng hợp lại .
Nicotinic acid
Nicotinic acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết
đối với một số mẫu cấy. Nồng độ nicotinic acid thường dùng trong nuôi cấy là 0,1-
5mg/l
Vitamin B6 (Pyridoxin, Adernin)
Vitamin B6 là tiền chất của pyrdoxalphosphat, cofactor của nhóm enzyme như
carboxylase và transaminase.
Myo-inositol
Myo-inositol có vai trò trong tổng hợp thành tế bào. Myo-inositol thường được
sử dụng ở nồng độ 100 ppm.
Chất điều hòa sinh trƣởng
Auxin
Theo Hoàng Đức Cự (2006) auxin có tác dụng làm tăng độ dẻo của tế bào thực
vật, kích thích hoạt động của tầng phát sinh mạch và mô mạch, kích thích quá trình tạo
rễ. Auxin có khả năng tương tác với các hormone khác kích thích hoạt động của mô
phân sinh mạch và sự tăng trưởng của chu vi thân cây. Auxin có thể dùng để kích thích
ra hoa ở một số loại cây trồng, ngăn chặn sự rụng hoa và quả, khắc phục hiện tượng ra
quả cách năm và làm chậm quá trình chín của thực vật (Nguyễn Văn Đính và Nguyễn
Như Khanh, 2011). Auxin cũng đóng vai trò quan trọng trong tạo mô sẹo (Nguyễn
Đức Thành, 2000).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
11
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) có nhiều loại auxin tổng hợp được sử dụng trong
nuôi cấy mô hiện nay như: α-Naphthalene acetic acid (NAA), indoacetic acid (IAA),

2,4- diclorophenociacetic acid (2,4-D), indole-3-butyric acid (IBA),
Cytokinin
Theo Hoàng Đức Cự (2006) cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào.
Cytokinin kích thích hình thành cành nhánh và ức chế sự hình thành rễ. Ngoài ra,
cytokinin cũng có tác dụng kìm hãm sự vàng của lá.
Theo Vũ Văn Vụ et al. (2006) một số loại cytokinin có thể dùng trong nuôi cấy
mô là 6-benziaminopurin (BA), Thidiazuron (TDZ), kinetin,…
Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin giúp tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo. Nồng độ
auxin tăng và nồng độ cytokinin giảm sẽ tạo rễ ở mô sẹo (Mineo, 1990; Vũ Văn Vụ,
1999). Khi sử dụng auxin và cytokinin cần tuân theo liều lượng cho phép. Sự vượt quá
mức có thể gây ra biến dị về dòng cây, khác biệt về kiểu hình hoặc gây ra hiện tượng
thủy tinh thể. Hậu quả là cây con khó sống khi thuần dưỡng ở môi trường bên ngoài
(Lâm Ngọc Phương và Lê Minh Lý, 2012).
Bảng 2: Nhu cầu các chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô
Chất điều hòa sinh trƣởng
Nồng độ sử dụng (mg/l)
Auxin
2,4 D
NAA
IBA
0,2-5
0,1-5
5-20
Cytokinin
Kinetin
BA
0,1-2
0,1-2
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2000)
Agar

Agar được sử dụng làm chất tạo đông cho môi trường nuôi cấy. Agar không phản
ứng với các chất trong môi trường nên được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy. Nồng độ
agar thường dùng là 6-8 g/l khi pH môi trường đạt 5,6-5,8. Nếu nồng độ agar cao sẽ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
12
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

làm cho môi trường cứng và hạn chế sự phát triển của mô sẹo hay bộ phận thực vật
được nuôi cấy. Tuy nhiên, nồng độ agar cao lại hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể
(Lâm Ngọc Phương, 2010).
Than hoạt tính
Than hoạt được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để hấp thụ các hợp chất màu,
các hợp chất phenol nhằm hạn chế sự ức chế của các chất này lên mẫu cấy, kích thích
sự hình thành và sinh trưởng của rễ và chống oxy hóa. Nồng độ than hoạt tính sử dụng
khoảng 0,2%-0,3% (Vũ Văn Vụ et al., 2006). Tuy nhiên, than hoạt tính lại làm giảm
hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
pH
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) pH ảnh hưởng đến sự hòa tan khoáng trong môi
trường và ảnh hưởng đến sự tạo gel của agar. pH thường nằm trong phạm vi từ 5,5-6,0.
pH<5,5 thì môi trường khó chuyển sang dạng gel. Ngược lại, pH>6 thì môi trường rất
cứng (Vũ Văn Vụ et al., 2006). Ngoài ra, sự hấp thu và bền vững của một số chất cũng
phụ thuộc vào pH môi trường như NAA, vitamin, hợp chất sắt (Nguyễn Đức Thành,
2000).
Thành phần bổ sung không xác định
Nhằm kích thích sự phát triển của mẫu cấy, môi trường nuôi cấy có thể được bổ
sung một số thành phần dinh dưỡng không xác định như nước dừa, dịch khoai tây,
dịch chiết nấm men, chuối nghiền (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Những thành phần
không xác định được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp thêm acid amin, peptide,
carbonhydrate, acid béo, chất điều hòa sinh trưởng và vitamin. Nồng độ chất hữu cơ
không xác định bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào loài thực vật nuôi cấy.

Nước dừa rất phổ biến, giá cả tương đối thấp nên được dùng để bổ sung vào môi
trường nuôi cấy một số chất hữu cơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Nước dừa có chứa các acid amin, đường, RNA, DNA, myo-inositol, auxin, cytokinin
( 4/8/2013). Thể tích nước dừa
thường dùng bằng 15-20% thể tích môi trường (Nguyễn Đức Lượng, 2001).


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
13
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Bảng 3: Một số chất dinh dƣỡng có trong nƣớc dừa (100 g)

Thành phần
Hàm lƣợng
Cacbonhydrat
Fat
Protein
Folate
Niacin
Pantothenic acid
Riboflavin
Pyridoxin
Thiamine
Vitamin C
Sodium
Potassium
Calcium
Iron
Magiesium

3,71g
0,2 g
0,72 g
3 µg
0,08 mg
0,043 mg
0,057 mg
0,032 mg
0,03 mg
2,4 mg
105 mg
250 mg
24 mg
40 mcg
0,29 mg
( Nguồn: 4/8/2013)

2. 6. Sơ lƣợc về mô sẹo
Mô sẹo là tế bào vô tổ chức có hình dạng không xác định, được hình thành từ vết
thương hay xử lý chất điều hoà sinh trưởng như auxin và cytokinin. Mô của nhiều loài
thực vật có khả năng tạo mô sẹo. Một số mô có khả năng phân chia nhanh hơn những
mô khác (Nguyễn Đức Lượng, 2000; Rhitu, 2007).
Theo cấu trúc, mô sẹo được chia làm hai loại: mô sẹo xốp và mô sẹo cứng. Mô
sẹo xốp có các tế bào với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to. Ngược lại, mô
sẹo cứng gồm các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm và không bào nhỏ (Vũ Văn
Vụ, 1999; Nguyễn Đức Lượng, 2000). Khả năng tái sinh là đặc tính khác nhau quan
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT
14
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

trọng giữa hai loại mô sẹo này. Ở mô sẹo xốp, khả năng này mất đi sớm hơn so với mô
sẹo cứng (Vũ Văn Vụ, 1999).
Theo màu sắc, mô sẹo có nhiều màu khác nhau như vàng, trắng, xanh (Nguyễn
Bảo Toàn, 2010; Nguyễn Đức Lượng, 2000).
Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi
hoặc phôi để tạo cây hoàn chỉnh. Sự phân chia mô sẹo chịu ảnh hưởng của chất điều
hoà sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy.
Nuôi cấy mô sẹo phải chú ý đến thời gian cấy chuyển, thường là 3-5 tuần vì lúc
này chất dinh dưỡng trong môi trường đã hết và môi trường cũng bị khô (Rhitu, 2007).
Tuy nhiên, khi cấy chuyển mô sẹo nhiều lần thì xu thế tạo cơ quan sẽ giảm. Nguyên
nhân có thể là do hình thành các tế bào đa bội, lệch bội hoặc mất các yếu tố di truyền
(Nguyễn Đức Thành, 2000).
Mô sẹo có nhiều ứng dụng trong nuôi cấy mô như nghiên cứu quá trình tạo cơ
quan ở thực vật, nhân giống in vitro cho hiệu quả hơn các phương pháp khác, thu nhận
các hoạt chất sinh học, nuôi cấy huyền phù tế bào và làm nguyên liệu nuôi cấy tế bào
đơn cho chọn lọc dòng tế bào (Hoàng Thị Thu, 2007).
Phương pháp nuôi cấy mô sẹo cho hệ số nhân giống cao hơn các phương pháp
khác. Ngoài ra trong quá trình nuôi cấy mô sẹo có thể tạo biến dị soma. Đây là cơ sở
để nghiên cứu, áp dụng cải thiện giống (Nguyễn Đức Lượng, 2000).
2. 7. Các nghiên cứu liên quan
Ngoài nƣớc
Theo Dipak và Sumitra (1985) khi nuôi cấy A. racemous trên môi trường MS+1
mg/l BA+ 0,5 mg/l NAA cho chiều dài chồi 5 cm sau 40 ngày cấy. Mẫu cấy tạo rễ trên
môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 25 ngày nuôi cấy.
Theo Rafail và Khitam (2012) cho biết môi trường MS+BA 0,5 mg/l + NAA 0,2
mg/L thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo của A. densiflorus với số chồi là
28,13 chồi/mẫu và chiều dài chồi là 6,9 cm/chồi. Nồng độ IBA 1,25 mg/l cho hiệu quả
tạo rễ cao nhất với trung bình 12,4 rễ và chiều dài trung bình 4,98 cm