phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải lò bún lệ châu, thành phố sóc trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)



PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ
NƢỚC THẢI LÒ BÚN LỆ CHÂU, THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP CHẾ MINH NGỮ
MSSV: 3102760
Lớp: CNSH Tiên Tiến K36



Cần Thơ, tháng 12/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)


PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ
NƢỚC THẢI LÒ BÚN LỆ CHÂU, THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP CHẾ MINH NGỮ
MSSV: 3102760
Lớp: CNSH Tiên Tiến K36




Cần Thơ, tháng 12/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

NGƢỜI HƢỚNG DẪN SINH VIÊN



PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Chế Minh Ngữ



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG





LỜI CẢM TẠ
Trong quá trình học tập tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học-Đại học Cần Thơ,
tôi luôn nhận được sự quan tâm sâu sắc từ gia đình cũng như sự giúp đỡ to lớn từ thầy
cô và bạn bè. Những điều đó đã giúp tôi vượt qua những khó khăn trong hoạc tập và
hoàn thành tốt chương trình học cũng như luận văn của mình. Với lòng biết ơn sâu sắc
tôi xin gửi lời cảm tạ đến:

Cha mẹ, người ngày đêm tảo tần lo cho tôi đầy đủ trong suốt bốn năm đại học.
PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh
vật-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Đại học Cần thơ, người đã tận
tình hướng dẫn tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp cũng như truyền dạy cho tôi những
đạo lý, kiến thức và kinh nghiệm sống quý báo giúp tôi trưởng thành và có ích hơn
trong cuộc sống.
ThS. Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa
36, người luôn quan tâm theo dõi quá trình học tập và rèn luyện của tôi.
Ths. Mai Thi, Giám đốc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc
Trăng, người đã hỗ trợ phần lớn vật tư thí nghiệm cũng như tạo điều kiện thực tập
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Chị Dương Ngọc Thúy, Trưởng phòng Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi
trường tỉnh Sóc Trăng, người giúp tôi có những số liệu quý giá về nước thải của lò bún
Lệ Châu, thành phố Sóc Trăng.
Chị Trần Trà My và chị Nguyễn Thị Thúy Duy, cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh
vật-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Đại học Cần Thơ, những
người luôn nhắc nhở và đôn đúc tôi thực hiện luận văn đúng tiến độ.
Tập thể các anh chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật,
những người cùng tôi chia sẽ những khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng xin gửi đến tất cả lời chúc sức khỏe và an lành!
Cần thơ, ngày 12 tháng 12 năm 2014


Chế Minh Ngữ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT
Từ mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu, Thành phố Sóc Trăng, 24 dòng vi khuẩn
đã được phân lập trên môi trường chuyên biệt với nguồn carbon duy nhất là tinh bột
(1%). Tất cả những dòng vi khuẩn này đều có hoạt tính catalase và chỉ 2 trong số đó

có khả năng sinh acid. Số dòng vi khuẩn có khả năng di động trên môi trường bán
lỏng là 19 dòng và số dòng vi khuẩn Gram (+) là 5 dòng. Tám trong số 24 dòng vi
khuẩn có khả năng tổng hợp amylase. Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
amylase tốt là D2, D15 và D16.

Dòng D15 và D16 được chọn để khảo sát sự tăng
trưởng và giải trình tự vùng gen 16S rRNA. Kết quả giải trình tự được so sánh trên
ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy dòng D15 là Bacillus cereus với độ tương đồng 97%
và dòng D16 là Bacillus flexus với độ tương đồng 89%. Hai loài vi khuẩn này đều có
khả năng phân hủy tinh bột rất tốt và có thể được ứng dụng để xử lý nước thải chứa
tinh bột.
Từ khóa: Amylase, Bacillus cereus, Bacillus flexus, lò bún và tinh bột
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về nƣớc thải công nghiệp 2
2.1.1. Nước thải công nghiệp và ảnh hưởng của nước thải công nghiệp 2
2.1.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp 2
2.2. Các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải (Dƣơng Nguyên Khang, 2014) 2

2.2.1. Các phương pháp xử lý 2
2.2.2. Phương pháp vi sinh hiếu khí (Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014) 3
2.3. Sơ lƣợc về nƣớc thải từ cơ sở sản xuất bún 5
2.3.1. Giới thiệu về bún và nghề làm bún 5
2.3.2. Quy trình sản xuất bún tươi 6
2.3.3. Nước thải từ cơ sở sản xuất bún 7
2.3.4. Lò bún Lệ Châu 7
2.4. Sơ lƣợc về tinh bột 8
2.4.1.Tính chất vật lý và trạng thái tự nhiên 8
2.4.2. Cấu trúc phân tử của tinh bột 8
2. 5. Hệ enzyme amylase và sự phân hủy tinh bột 10
2.5.1. Hệ enzyme amylase 10
2.5.3. Phân loại enzyme amylase (Marc et al., 2002) 10
2.5.4. Tính chất của emzyme amylase 10
2.5.5. Cơ chế phân hủy tinh bột 11
2.6. Một số chi vi khuẩn phân hủy tinh bột 12
2.6.1. Vi khuẩn Bacillus sp. 12
2.6.2. Vi khuẩn Lactobacillus sp. 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.6.3. Một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột khác 13
2.6.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn phân hủy tinh bột 14
2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 14
2.7.1. Trong nước 14
2.7.2. Ngoài nước 15
2.8. Các phƣơng pháp vi sinh 15
2.8.1. Phương pháp hộp trải (Nguyễn Văn Minh, 2008) 15
2.8.2. Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982) 15
2.8.3. Phương pháp giếng thạch (Umesh et al., 1989) 16
2.8.4. Phương pháp thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 16

2.8.5. Phương pháp thử Methyl red (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 16
2.9. Kỹ thuật PCR và phƣơng pháp giải trình tự 17
2.9.1. Kỹ thuật PCR 17
2.9.2. Giải trình tự 18
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 21
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện 21
3.1.2. Vật liệu 21
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị 21
3.1.4. Hóa chất và môi trường 22
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24
3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu 24
3.2.2. Đo kích thước vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 25
3.2.3. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 26
3.2.4. Nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 26
3.2.5. Kiểm tra catalase 27
3.2.6. Kiểm tra Methyl red 27
3.2.7. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 27
3.2.8. Sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian 29
3.2.9. Khuếch đại vùng gene 16S rRNA 30
3.2.10. Giải trình tự 32
3.2.11. Xử lý kết quả thí nghiệm 32
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái 33
4.1.1. Kết quả phân lập 33
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
4.1.2. Đặc điểm hình thái 34
4.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 39
4.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase 42

4.4. Sự tăng trƣởng của vi khuẩn theo thời gian 44
4.5. Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA 45
4.5.1. Kết quả điện di 45
4.5.2. Kết quả nhận diện 46
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC 54
Phụ lục 1. Các bảng và hình 54
Bảng 10: Đường kính trung bình vòng halo và khuẩn lạc
Bảng 11: Hiệu số trung bình D-d
Bảng 12: Kết quả đếm mật số
Hình 26: Mật số ban đầu của dòng D16
Hình 27: Mật số của dòng D16 sau 12 giờ
Phụ lục 2. Kết quả thống kê
a) Sự tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16
b) Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase
Phụ lục 3. Kết quả giải trìh tự và định danh vi khuẩn
a) Trình tự gene 16S rRNA dòng D15
b) Trình tự gene 16S rRNA dòng D16
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Kết quả phân tích mẫu nước thải lò bún Lệ Châu 8
Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định mật số vi khuẩn 29
Bảng 3: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR 31
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR 31
Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập được 34
Bảng 6: Đặc điểm tế bào vi khuẩn của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập được 36
Bảng 7: Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa 39
Bảng 8: Những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase 43

Bảng 9: Kết quả nhận diện vi khuẩn 46

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn 3
Hình 2: Chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp 4
Hình 3: Chất ô nhiễm bị biến đổi gián tiếp 5
Hình 4: Quy trình sản xuất bún tươi từ gạo tẻ 6
Hình 5: Nước thải từ làng bún gây ô nhiễm kênh rạch xung quanh 7
Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973) 8
Hình 7: Cấu trúc phân tử amylopectin (French, 1973) 9
Hình 8: Cơ chế phân hủy tinh bột (Marc et al., 2002) 11
Hình 9: Vi khuẩn Bacillus cereus 12
Hình 10: Vi khuẩn Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981) 13
Hình 11: Sự chuyển hóa glucose bởi vi khuẩn 16
Hình 12: Khoảng đổi màu của Methyl red 16
Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trường kiểm tra hoạt tính amylase 28
Hình 14: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được 33
Hình 15: Khả năng chuyển động của vi khuẩn trong môi trường bán lỏng 37
Hình 16: Hình nhuộm Gram vi khuẩn với độ phóng đại 1000 lần 38
Hình 17: Hoạt tính catalase của dòng D10 (+) 40
Hình 18: Hoạt tính catalase của dòng D8 (++) 40
Hình 19: Hoạt tính catalase của dòng D20 (+++) 40
Hình 20: Kết quả kiểm tra Methyl red 41
Hình 21: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42
Hình 22: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42
Hình 23: Mật số của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 ở các thời điểm 44
Hình 24: Đường tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 theo thời gian 45
Hình 25: Phổ điện di DNA của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 45

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
16S rRNA 16S ribosomal Ribonucleic Acid
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BOD Biochemical Oxygen Demand
CFU Colony forming unit
COD Chemical Oxygen Demand
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
HCM Hồ Chí Minh
LB Luria Broth
PCR Polymerase Chain Reaction
QCVN Quy chuẩn Việt Nam
TP. Thành phố
VK Vi khuẩn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nghề làm bún là một nghề sản xuất thực phẩm thuộc nhóm nghề truyền thống có
mặt ở nhiều nơi trên cả nước. Nghề làm bún giữ vai trò cung cấp thực phẩm cho xã hội,
góp phần làm đa dạng văn hóa ẩm thực và giải quyết việc làm cho người dân.
Bên cạnh đó, nghề này đã và đang gây ô nhiễm môi trường nước xung quanh nơi
sản xuất. Nước thải từ việc sản xuất bún có hàm lượng tinh bột cao và việc thải trực
tiếp loại nước thải này vào môi trường đã gây ra ô nhiễm nặng nề môi trường nước
xung quanh một số cơ sở, làng nghề sản xuất bún ở nước ta. Nguyên nhân ô nhiễm là
do tinh bột bị các vi sinh vật trong môi trường lên men yếm khí sinh ra những chất

độc hại như metan, hydro sunfua, v.v Việc ô nhiễm này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe con người và vật nuôi, hệ thủy sinh và mạch nước ngầm. Do đó, việc xử lý
nước thải ở các cơ sở sản xuất bún rất bức thiết.
Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải nhưng khi xét về cơ sở khoa học
thì gồm có phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Vì
nước thải của các cơ sở sản xuất bún chứa nhiều tinh bột (chất hữu cơ dễ phân hủy)
nên sử dụng phương pháp sinh học-vi sinh (bioremediation) để xử lý là phù hợp nhất.
Phương pháp vi sinh có các ưu điểm như thân thiện với môi trường, rẻ tiền và hiệu quả
xử lý cao. Để có thể ứng dụng phương pháp vi sinh vào xử lý nước thải ở cơ sở sản
xuất bún thì bước đầu tiên là phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh
bột mạnh từ chính nước thải đó. Vì vậy đề tài “Phân lập và nhận diện một số dòng vi
khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải lò bún Lệ Châu, Thành phố Sóc
Trăng” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Phân lập và nhận diện được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột
từ nước thải lò bún Lệ Châu, TP. Sóc Trăng.




Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về nƣớc thải công nghiệp
2.1.1. Nƣớc thải công nghiệp và ảnh hƣởng của nƣớc thải công nghiệp
Nước thải công nghiệp là nước được thải ra sau khi đã sử dụng hoặc được tạo ra
trong một quá trình công nghệ và không còn giá trị trực tiếp đối với quá trình đó hay
nước thải công nghiệp là nước được thải ra từ các hoạt động sản xuất công nghiệp.
Nước thải công nghiệp là một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường
nước.

Công cuộc công nghiệp hóa đất nước đã và đang xúc tiến các hoạt động sản xuất
công nghiệp. Điều đó kéo theo sự gia tăng lượng nước thải công nghiệp vào môi
trường nước khiến sự ô nhiễm môi trường nước ngày càng trầm trọng. Ô nhiễm môi
trường nước đã và đang ảnh hưởng tiêu cực đến khỏe con người và vật nuôi, hệ thủy
sinh và nguồn nước ngầm, v.v Điển hình nhất là vụ ô nhiễm sông Thị Vải do nước
thải không qua xử lý của nhà máy Vedan-Đồng Nai năm 2009, khiến hoạt động nuôi
trồng, đánh bắt thủy sản của người dân trong phạm vi 2.000ha bị thiệt hại nặng nề (Vũ
Thị Hương Lan, 2010).
2.1.2. Đặc điểm của nƣớc thải công nghiệp
Nước thải công nghiệp khác nhau về thành phần và lượng phát thải tùy thuộc vào
loại hình và quy mô sản xuất. Nước thải công nghiệp thường chứa ion kim loại nặng
(trong sản xuất và khai thác kim loại), chất hữu cơ (trong sản xuất thực phẩm) hoặc
chất độc (sản xuất thuốc trừ sâu, phân bón, v.v.). Thành phần và lượng phát thải cũng
là hai tiêu chí để lựa chọn phương pháp và quy mô xử lý phù hợp.
2.2. Các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải (Dƣơng Nguyên Khang, 2014)
2.2.1. Các phƣơng pháp xử lý
Vì nước nước thải công nghiệp rất đa dạng nên có cũng nhiều phương pháp xử lý
phù hợp với các loại nước thải đó. Tuy nhiên, căn cứ vào cơ sở khoa học ta có thể chia
làm ba nhóm như sau: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh
học.
Phương pháp vật lý sử dụng các lực vật lý như trọng trường, ly tâm để tách các
hóa chất không hòa tan ra khỏi nước thải. Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, hiệu quả
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
xử lý chất lơ lửng cao. Các công trình xử lý cơ học được sử dụng rộng rãi trong xử lý
nước thải là: lắng, lắng cao tốc, lọc, bay hơi, tách khí , v.v
Phương pháp hóa học sử dụng hóa chất để xử lý nước thải như keo tụ, clo javel,
thuốc sát trùng, v.v Các công trình xử lý hóa học thường kết hợp với các công trình
xử lý vật lý. Mặc dù có hiệu quả cao, nhưng phương pháp xử lý hóa học thường đắt
tiền và tạo thành các sản phẩm phụ độc hại cho môi trường.

Phương pháp sinh học gồm có phương pháp vi sinh hiếu khí (bioremediation),
phương pháp thực vật (phytoremediation) và phương pháp ủ kỵ khí metan
(bioconversion). Trong đó phương pháp vi sinh hiếu khí liên quan mật thiết với đề tài
đang nghiên cứu. Mục đích của phương pháp vi sinh hiếu là lên men phân hủy các chất
hữu cơ nhờ hoạt động của vi sinh vật hiếu khí. Sản phẩm cuối cùng là là chất khí (CO
2
,
N
2
,CH
2
, v.v.), các chất vô cơ và tế bào mới. Phương pháp này khi áp dụng sẽ cho hiệu
quả cao, tận dụng được các sản phẩm phụ làm phân bón (bùn hoạt tính) và thân thiện
với môi trường.
2.2.2. Phƣơng pháp vi sinh hiếu khí (Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)

Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn
(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)
Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn cần có nguồn dinh dưỡng và nguồn năng
lượng từ môi trường chúng sống. Nguồn năng lượng của vi khuẩn thường là các chất
cho điện tử (e
-
) và nguồn dinh dưỡng là những chất cung cấp các nguyên tố thiết yếu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
như C, O, N, P và những nguyên tố vi lượng. Sau khi tham gia vào quá trình sinh tổng
hợp, những chất này được chuyển hóa thành chất nhận điện tử.
Một số quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn gây ô nhiễm khi chất nhận điện tử là
các chất gây ô nhiễm.
Vi khuẩn được dùng để xứ lý nước thải khi chúng sử dụng các chất có trong nước

thải làm nguồn dinh dưỡng (nguồn carbon) hoặc nguồn năng lượng hoặc sản phẩm
sinh ra từ quá trình sinh tổng hợp của chúng có thể tác dụng làm biến đổi chất ô
nhiễm.
Trong quá trình xử lý, chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp hoặc gián tiếp. Biến đổi
trực tiếp là những chất ô nhiễm bị biến đổi bên trong tế bào thông qua quá trình sinh
tổng hợp. Biến đổi gián tiếp diễn ra bên ngoài tế bào vi khuẩn khi những chất ô nhiễm
tác dụng với các chất nhận điện tử.

Hình 2: Chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp
(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 3: Chất ô nhiễm bị biến đổi gián tiếp
(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)
2.3. Sơ lƣợc về nƣớc thải từ cơ sở sản xuất bún
2.3.1. Giới thiệu về bún và nghề làm bún
Bún là một loại thực phẩm truyền thống phổ biến trong cả nước chỉ sau cơm, phở
(wikipedia). Bún được làm từ gạo tẻ qua những công đoạn rất công phu. Bún gồm có
hai loại là bún tươi và bún khô, trong đó bún tươi phổ biến hơn. Các món ăn từ bún
tươi rất đa dạng và được phân thành hai loại là bún nước và bún khô. Một số món bún
nước nổi tiếng như bún nước lèo ở Sóc Trăng, bún cá ở An Giang, bún thang ở Hà Nội,
v.v
Nghề làm bún thuộc nhóm ngành nghề truyền thống có từ lâu đời. Những cơ sở
sản suất bún có mặt hầu hết ở các tỉnh thành trong cả nước với những quy mô lớn nhỏ
khác nhau. Vai trò của nghề làm bún là cung cấp nguồn thực phẩm cho xã hội, làm đa
dạng văn hóa ẩm thực Việt Nam và góp phần giải quyết việc làm cho người dân. Tuy
nhiên, hiện nay nghề làm bún cũng gặp phải một số khó khăn trong vấn đề an toàn
thực phẩm và ô nhiễm môi trường.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.2. Quy trình sản xuất bún tƣơi

Hình 4: Quy trình sản xuất bún tƣơi từ gạo tẻ
(Tống Thành Trung, 2010)
Quá trình ngâm nhằm làm mềm hạt gạo để quá trình nghiền bột được dễ dàng
hơn. Quá trình ngâm còn là giai đoạn để vi khuẩn lactic lên men sinh acid.
Quá trình nghiền ướt làm cho hạt gạo nhuyễn hơn và tinh bột không bị biến tính.
Làm ráo là để tách bớt nước chuẩn bị cho quá trình hồ hóa.
Quá trình hồ hóa sơ bộ nhằm hồ hoá một phần tinh bột nhằm tạo cho khối bột
một độ đặc nhất định khi tiến hành nhào.
Nhào nhằm phá vỡ khối hạt, tạo điều kiện cho hạt tinh bột liên kết với nước làm
cho khối bột trở nên đặc và chắc hơn.
Quá trình ép đùn nhằm định hình cho bún, đồng thời làm chín một phần bún do
tác động của nhiệt độ sau khi ra khỏi khuôn ép.
Quá trình luộc nhằm làm bún chín hoàn toàn.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Quá trình làm nguội nhằm làm các sợi tinh bột sắp xếp lại và ổn định chất lượng
tạo sợi của chúng.
Quy trình làm bún khô cũng tương tự như làm bún tươi nhưng có thêm giai đoạn
tái hấp, sấy khô và đóng gói.
2.3.3. Nƣớc thải từ cơ sở sản xuất bún
Từ quy trình sản xuất, ta thấy rằng nước thải từ việc sản xuất bún sẽ chứa phần
lớn chất hữu cơ là tinh bột hòa tan. Nếu không được xử lý trước khi thải ra môi trường
thì sẽ gây ô nhiễm do tinh bột hòa tan bị lên men yếm khí. Hiện nay, một số làng nghề,

cơ sở sản xuất bún đã gây ô nhiễm nặng môi trường xung quanh nơi sản xuất, chẳng
hạn như lò bún Ô Sa (Thừa Thiên Huế), làng bún Phú Đô (Hà Nội), v.v

Hình 5: Nƣớc thải từ làng bún gây ô nhiễm kênh rạch xung quanh
(
2.3.4. Lò bún Lệ Châu
Đây là là lò bún nổi tiếng ở TP. Sóc Trăng vì bún ở đây dai ngon đặc biệt. Lò
Bún cũng là nguồn cung ứng chủ yếu lượng bún sĩ và lẻ cho người dân trong địa bàn
thành phố. Vì được ưa chuộng nên lượng bún được sản xuất và bán ra của lò hằng
ngày là khá lớn. Do lượng bún được sản xuất lớn nên lượng nước thải phát ra của lò
bún cũng khá lớn trong khi lò bún chưa có hệ thống xử lý nước thải và thải trực tiếp ra
sông thông qua hệ thống cống. Theo kết quả phân tích của Trung tâm Quan trắc Tài
nguyên và Môi trường TP. Sóc Trăng 4/2014 thì mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu có
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
nồng độ chất hữu cơ cao, thể hiện qua giá trị BOD
5
và COD. Trong đó giá trị BOD
5

cao gấp khoảng 40 lần còn COD cao gấp khoảng 15 lần so với giá trị giới hạn B đối
với nước thải công nghiệp (QCVN 40: 2011) (Bảng 1). Với nồng độ chất hữu cơ cao
như vậy thì khả năng gây ô nhiễm môi trường nước khi thải trực tiếp nước thải ra sông
là rất lớn. Vì vậy việc xử lý nước thải của lò bún Lệ Châu là rất cần thiết.
Bảng 1: Kết quả phân tích mẫu nƣớc thải lò bún Lệ Châu
Chỉ tiêu
Hàm lƣợng
QCVN 40: 2011 (cột B)
BOD
5

(mg/l) (20
o
C)
1655,4
50
COD (mg/l)
2287,2
150
- COD là lượng oxy cần để oxy hoá toàn bộ các chất hoá học trong nước
- BOD là lượng oxy cần thiết để oxy hoá các hợp chất hữu cơ dễ phân huỷ bởi vi sinh vật)
(Nguồn: Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường Tp. Sóc Trăng, 14/4/2014)
2.4. Sơ lƣợc về tinh bột
2.4.1.Tính chất vật lý và trạng thái tự nhiên
Tinh bột là chất rắn vô định hình, màu trắng, không tan trong nước nguội.
Trong nước nóng từ 65
o
C trở lên tinh bột chuyển thành hồ tinh bột. Tinh bột có nhiều
trong các loại hạt (gạo, mì, ngô, v.v.), củ (khoai, sắn, v.v.) và quả (táo, chuối, v.v.).
2.4.2. Cấu trúc phân tử của tinh bột

Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973)
a) Các gốc α-glucose nối với nhau bởi lien kết α-1,4-glycoside
b) Mô hình phân tử amylose
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tinh bột là hỗn hợp của hai polisaccarit: amylose và amylopectin. Cả hai đều có
công thức phân tử là (C
6
H
10

O
5
)
n
trong đó C
6
H
10
O
5
là gốc α-glucose và n nằm trong
khoảng 1000- 4000 (đối với amylose) và 2000 – 20000 (đối với amylopectin)(French,
1973). Trong các loại tinh bột thương mại (gạo, ngô, v.v.) amylose chiếm khoảng 25%
và amylopectin chiếm khoảng 75% khối lượng tinh bột (French, 1973).
Trong phân tử amylose các gốc α-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-
glicoside (Hình 6a) tạo thành một chuỗi dài không phấn nhánh và xoắn thành hình lò
xo (Hình 6b) (French, 1973).
Amylopectin có cấu trúc phân nhánh (Hình 7). Cấu trúc này được giải thích bởi
sự liên kết giữa C1 của chuỗi này với C6 của chuỗi kia qua nguyên tử O (gọi là liên
kết α-1,6-glycoside) (French, 1973).

Hình 7: Cấu trúc phân tử amylopectin (French, 1973)
a) Liên kết α-1,4-glycoside và liên kết α-1,6-glycoside
b) Mô hình phân tử amylopectin
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2. 5. Hệ enzyme amylase và sự phân hủy tinh bột
2.5.1. Hệ enzyme amylase
Theo Taniguchi và Honda (2009), amylase là tên gọi của một nhóm enzyme có
tác dụng cắt đứt liên kết α-1,4-glycoside và α-1,6-glycoside trong tinh bột và glycogen.

Amylase có nhiều trong thực vật, động vật và vi sinh vật (Vidyalakshmi et al.,
2009). Theo Das et al. (2011), amylase là enzyme đầu tiên được phát hiện và đã được
chiết tách bởi Anselme năm 1833. Enzyme đầu tiên được sản xuất theo quy mô công
nghiệp vào năm 1894 cũng là một loại amylase có nguồn gốc từ nấm và được sử dụng
trong y học như một loại thuốc chữa rối loạn tiêu hóa. Biodin và Effront là những
người đầu tiên dùng B. subtilis và B. mesentericus cho việc sản xuất α-amylase cho
mục đích kinh tế bằng việc sử dụng những sinh vật lên men lớn và LSF (Liquid State
Fermentation – sự lên men trong trạng thái lỏng).
Amylase được ứng dụng rộng rãi trong đời sống. Trong ngành công nghiệp thực
phẩm, amylase được sử dụng trong sản xuất bánh mì, tương, mạch nha, bột ngọt, v.v
Trong ngành dệt, các chế phẩm amylase được dùng để tẩy lớp hồ bột trên mặt vải làm
cho vãi mềm, mịn. Trong sản xuất rượu bia, amylase được dùng trong giai đoạn đường
hóa tinh bột. Ngoài ra amylase còn được dùng trong chế biến dược phẩm.
2.5.3. Phân loại enzyme amylase (Marc et al., 2002)
Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào hai nhóm: endoamylase và exoamylase.
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử
nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase và khử gián tiếp là
oligo-1,6-glucosidase và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là
những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
2.5.4. Tính chất của emzyme amylase
*Tính đặc hiệu: enzyme amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside và α-1,6-
glycoside trong quá trình phân hủy tinh bột hoặc glycogen (dạng dự trữ của tinh bột ở
động vật). Amylase chỉ xúc tác phân hủy tinh bột và glycogen mà không thủy phân các
cơ chất khác kể cả cellulose (cũng có liên kết 1,4-glycoside).
*Tính chất vật lý và hóa học: enzyme amylase dễ tan trong nước, trong dung
dịch muối và rượu loãng. Các amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
acid khác nhau, mỗi loại amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. Hoạt động

của enzyme amylase chịu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và nồng độ muối. Amylase hoạt
động trong vùng pH 3.5-8.5 và phần lớn amylase hoạt động tối ưu ở pH=6 (Agić et al.,
2009). Các amylase không bị biến tính với nhiệt độ ≤ 70
O
C và đa số hoạt động tối ưu ở
30
o
C (Amutha et al., 2011). Amylase có thể giữ lại 100% hoạt tính trong 24 giờ khi ủ
với dung dịch muối NaCl 0,5M (Robyt, 2005).
*Chất ức chế: Hầu hết các enzyme amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại
nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ (Tapan, 2006). Nguyên nhân là do các kim loại này làm
thay đổi cấu trúc phân tử của các emzyme amylase làm mất đi chức năng của chúng.
2.5.5. Cơ chế phân hủy tinh bột

Hình 8: Cơ chế phân hủy tinh bột (Marc et al., 2002)
Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-
glycoside từ đầu khử trong phân tử tinh bột tạo thành các dextrin hoặc glucose.
Enzyme này phân hủy cả tinh bột thô nhưng rất chậm.
Khác với α-amylase, tiến trình phân cắt liên kết α-1,4-glycoside của enzyme β-
amylase bắt đầu từ đầu không khử tạo thành maltose. Trong quá trình phân cắt liên tục
nếu gặp liên kết α-1,4-glycoside kế cận liên kết α-1,6-glycoside thì nó sẽ ngưng cắt. Vì
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vậy sản phẩm của quá trình phân hủy tinh bột bởi β-amylase thường là hỗn hợp của
các dextrin có chứa liên kết α-1,6-glycoside (gọi là β-dextrin) và maltose.
Tương tự β-amylase, γ-amylase phân cắt liên kết α-1,4-glycoside từ đầu không
khử. Quá trình này lặp lại nhiều lần cho ra sản phẩm cuối cùng là β-glucose. γ-amylase
cũng có thể phân cắt các liên kết α-1,6-glycoside nhưng rất chậm.
Enzyme pullulanase tham gia vào giai đoạn dextrin hóa với vai trò phân cắt liên
kết α-1,6-glycoside trong phân tử tinh bột.

Transglucosidase có tác dụng thủy phân maltose thành glucose. Ngoài ra
transglucosidase còn có thể tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose (tức
chuyển gốc glucose gắn vào phân tử glucose khác hoặc phân tử maltose bằng liên kết
α-1,6-glycoside để tạo thành panose và izomaltose).
Oligo-1,6-glucosidase phân cắt liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose
và các dextrin thành các phân tử đường có thể lên men được.
2.6. Một số chi vi khuẩn phân hủy tinh bột
Trong môi trường tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột
thuộc các chi như như Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, v.v (Nguyễn Hữu Hiệp
và Nguyễn Thị Hải Lý, 2012). Những loài vi khuẩn này tiết ra các loại enzyme trong
hệ enzyme amylase để phân hủy tinh bột thành những hợp chất đơn giản hơn (như
glucose) để đáp ứng quá trình sinh tổng hợp của chúng.
2.6.1. Vi khuẩn Bacillus sp.

Hình 9: Vi khuẩn Bacillus cereus
(
Hầu hết các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu
khí, Gram dương và hình dạng que dài. Ví dụ như Bacillus cereus (Hình 9) là một loại
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vi khuẩn có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng có khả năng phân hủy tinh bột
tốt (Sanjoy et al., 2009. Một số loài vi khuẩn khác thuộc chi này cũng có khả năng
phân hủy tinh bột như Bacillus subtilis (Konsula et al., 2003), Bacillus megaterium
(Mary et al., 1980) và Bacillus flexus (Jian et al., 2009) .
2.6.2. Vi khuẩn Lactobacillus sp.
Lactobacillus sp. là những loài vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc
hoặc vi hiếu khí, hình que, di chuyển thụ động và không tạo bào tử. Lactobacillus sp.
có mặt trong các thực phẩm lên men (như sữa chua, phó-mat, dưa cải, v.v.), trong dạ
dày, đường sinh dục của người và động vật có vú…Ngoài khả năng lên men lactic,
một số loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng phân hủy tinh bột mạnh.

Trong số đó phải kể đến Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981 )(Hình 10),
Lactobacillus rnanihotivorans (Morlon-Guyot et al., 1998), và Lactobacillus
amylophilus (Vishnu et al., 2000), v.v Chúng có khả năng tiết ra enzyme α-amylase
và một số enzyme khác để chuyển hóa tinh bột thành những sản phẩm có chứa acid
lactic.

Hình 10: Vi khuẩn Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981)
2.6.3. Một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột khác
Ngoài những loài vi khuẩn kể trên, những loài vi khuẩn sau đây cũng có khả
năng tiết ra hệ enzyme amylase phân hủy tinh bột. Actinomyces sp. là những loài vi
khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc (trừ A. meyeri làm một vi khuẩn kỵ khí bắt
buột), không tạo nội bào tử, hình que (wikipedia). Cytophaga sp. là những loài vi
khuẩn Gram âm, kỵ khí bắt buộc, dạng que, cũng có khả năng tiết amylase để phân
hủy tinh bột (Rong-Jen Shiau et al., 2003). Planococcus donghaensis là loài vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, di chyển tích cực, dạng tròn, tìm thấy nhiều ở đất trồng (Jeong-
Hwa Choi, 2007). Dyadobacter soli là loài vi khuẩn Gram âm, không di chuyển, hiếu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
khí, dạng que, được tìm thấy ở các bãi rác ở Biển Đông (Myungjin Lee et al., 2010).
Một số loài xạ khuẩn cũng có khả năng phân hủy tinh bột (wikipedia).
2.6.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn phân hủy tinh bột
Trong đời sống, vi khuẩn phân hủy tinh bột được ứng dụng từ rất lâu trong chế
biến các thực phẩm hằng ngày như sữa chua, cải muối, v.v Một số vi khuẩn phân giải
tinh bột cũng góp phần phần trong quá trình lên men rượu từ chính cơ chất đó.
Trong việc bảo vệ môi trường, những vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh được
dùng để tạo các chế phẩm xử lý rác thải hoặc nước thải có chứa cơ chất tinh bột (như
nước thải ở những cơ sở sản xuất bột, lò bún, lò bánh, v.v.).
Trong sản xuất, vi khuẩn phân giải tinh bột có tiềm năng rất lớn trong việc sản
xuất enzyme amylase, hệ enzyme có giá trị về kinh tế lẫn khoa học. Ưu điểm của việc
sản xuất enzyme amylase từ vi khuẩn là rẻ, sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và thân thiện

với môi trường.
2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Việc xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh đã và đang được các nhà khoa
học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Hầu hết những nghiên cứu đều có điểm
chung trong việc phân lập là tìm kiếm những dòng vi sinh vật có khả năng phân hủy
các chất hữu cơ từ chính nguồn nước thải chứa nhiều chất hữu cơ đó. Những nghiên
cứu đó cũng cho kết quả rất khả quan vì đa phần đã tìm được những vi sinh vật mong
muốn.
2.7.1. Trong nƣớc
Năm 2012, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý đã thực hiện thành công
trong nghiên cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng
nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp. Nghiên cứu cho kết quả 4
dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh trong đó dòng 9
35
và VD2 có khả năng xử lý
đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ.
Năm 2010, Vũ Thị Hương Lan phân được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột
mạnh từ nước thải sản xuất nui. Các dòng này đều xử lý tốt nước thải từ nhà máy sản
xuất nuôi. Sau khi xử lý, giá trị COD của nước thải sản suất nuôi giảm từ 76-88% so
với giá trị ban đầu.