Thử nghiệm tạo bột sữa chua synbiotic

L
Trong suốt ba năm rưỡi học tập tại Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, nửa
năm làm đề tài khóa luận tại PTN Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Bách
Khoa, tôi đã được trang bị những kiến thức chuyên ngành và những kỹ năng sống
cần thiết. Khóa luận tốt nghiệp là thành quả làm việc nghiêm túc từ những tri thức
quý báu mà Quý Thầy Cô đã truyền đạt trong suốt bốn năm qua.
Để hoàn thành Khóa luận, ngoài sự cố gắng, nổ lực của bản thân là sự giúp lớn
lao từ Quý Thầy Cô, Gia Đình và Bạn Bè.

i



Trang
Lời cảm ơn
Mục lục i
Danh mục từ viết tắt iv
Danh mục hình ảnh v
Danh mục bảng vi
Danh mục đồ thị vii
Mở đầu 1
 TNG QUAN TÀI LIU
1.1. Sữa chua 2
1.1.1. Các giá trị của sữa chua 2
1.1.2. Phân loại sữa chua 3
1.1.3. Nguyên liệu và vi sinh vật trong sản xuất sữa chua 5
1.1.4. Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men sữa chua 7
1.2. Probiotic và các sản phẩm lên men từ sữa 9
1.2.1. Giới thiệu về probiotic 9
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu probiotic 12
1.2.3. Ứng dụng của probiotic trong thực phẩm chức năng 13
1.3. Bifidobacterium và sữa chua probiotic 15
1.3.1. Giới thiệu về Bifidobacterium 15
1.3.2. Sữa chua probiotic 24
1.4. Bột sữa chua và phương pháp sấy phun 24
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của Bifidobacterium 27
1.6. Các biện pháp cải thiện khả năng sống của Bifidobacterium 29

ii

1.6.1. Tương tác sinh học 29
1.6.2. Đáp ứng stress 30
1.6.3. Bổ sung chất hỗ trợ 30
 VT LIU VÀ 
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và môi trường 32
2.1. Nguyên vật liệu 32
2.2. Môi trường, hóa chất 32
2.3. Thiết bị và dụng cụ sử dụng 33
2.2. Nội dung nghiên cứu 33
2.2.1. Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống 34
2.2.2. Chuẩn bị giống cho quá trình lên men 34
2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến pH, độ chua và mật độ B.
bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic 35
a. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ
B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic 35
b. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B.bifidum
trong quá trình lên men sữa chua synbiotic 37
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến sữa chua synbiotic theo thời gian
bảo quản 38
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của WPC mật độ B. bifidum khi áp dụng phương
pháp sấy phun tạo sữa chua synbiotic 39
2.3. Phương pháp phân tích 40
2.3.1. Phương pháp vi sinh 40
2.3.2. Phương pháp hóa lý 40
 KT QU VÀ BIN LUN
3.1. Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống 41
3.1.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể 41
3.1.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của B. bifidum 43

iii

3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum
trong quá trình lên men sữa chua probiotic 44
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B.
bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic 44
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B.bifidum
trong quá trình lên men sữa chua synbiotic 48
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản 51
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của WPC mật độ B. bifidum khi áp dụng phương pháp
sấy phun tạo sữa chua synbiotic 54
KT LUN VÀ KIN NGH
4.1. Kết luận 57
4.2. Kiến nghị 59
Tài liệu tham khảo 62
Phụ lục

iv

DANH 
FOS: Fructose oligosaccharide
WPC: Whey protein concentrate
Giống khởi động: Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus
B. bifidum: Bifidobacterium bifidum

v


Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa đường thành acid lactic
Hình 1.2. Hình thái vi khuẩn Bifidobacteria
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và độ
B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Hình 3.1. Hình thái đại thể của giống khởi động và B. bifidum trên các môi
trường đặc trưng
Hình 3.2. Hình thái vi thể của giống khởi động và B. bifidum (X100)
Hình 4.1. Quy trình tạo sản phẩm sữa chua synbiotic

vi


. Một số tính chất của vi khuẩn lactic được sử dụng trong sản xuất sữa
chua
. Các loài Bifidobacteria tồn tại trong hệ ruột người
. Các loài Bifidobacteria tồn tại trong hệ đường ruột động vật
. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ
chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật
độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn sử dụng lên men sữa
chua
. Sự thay đổi mật độ của B. bifidum trên môi trường MRS dịch thể theo
thời gian
 Mật độ tế bào B. bifidum dưới sự ảnh hưởng của thứ tự cấy giống
 Mật độ tế bào B. bifidum dưới sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC
 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng sữa chua synbiotic
 Mật độ, tỷ lệ sống của B. bifidum và độ ẩm của bột sữa chua sau sấy
phun

vii


 Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS
 Sự thay đổi pH dưới ảnh hưởng của thứ tự cấy giống
Sự thay đổi độ chua dưới ảnh hưởng của thứ tự
 Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến pH trong sữa chua synbiotic
theo thời gian lên men
   Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến độ chua trong sữa chua
synbiotic theo thời gian lên men
 Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến pH trong sữa chua synbiotic
theo thời gian bảo quản
   Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến độ chua trong sữa chua
synbiotic theo thời gian bảo quản
 Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến mật độ B. bifidum trong sữa
chua synbiotic theo thời gian bảo quản

Khóa luận cử nhân khoa học Đặt vấn đề
1


Sữa chua là sản phẩm lên men từ sữa có giá trị dinh dưỡng cao và có lợi cho
sức khỏe, cung cấp cho cơ thể một lượng lớn protein, vitamin A, B, D và nhiều
khoáng chất cần thiết khác. Hơn nữa sữa chua còn giúp kích thích tiêu hóa, tăng
hiệu quả hấp thu dưỡng chất từ thực phẩm. Sữa chua từ lâu đã được công nhận là
một sản phẩm với nhiều tác dụng mong muốn cho người tiêu dùng. Hầu hết người
tiêu dùng xem sữa chua là tốt cho sức khỏe [15].
Sự xuất hiện sữa chua probiotic, loại sữa chua bổ sung lợi khuẩn probiotic, làm
gia tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị sức khỏe cho sản phẩm này [9]. Với tính năng
ưu việt này, sữa chua probiotic không chỉ dừng lại ở các dạng sản phẩm thường
gặp (sữa chua truyền thống, sữa chua uống) mà đã được nghiên cứu tạo sản phẩm
bột sữa chua nhằm tăng thời gian bảo quản sản phẩm, thuận tiện vận chuyển, sử
dụng bằng kỹ thuật sấy phun. Sản phẩm bột sữa chua probiotic bằng phương pháp
sấy phun không cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh, thời gian bảo quản dài, khi vận
chuyển không cần những điều kiện bảo quản đặc biệt và góp phần đa dạng hóa
dòng sản phẩm thực phẩm probiotic.
Tuy nhiên thất thoát giống cao khi đi qua kỹ thuật sấy phun còn là một vấn đề
cần khắc phục trong quá trình tạo ra bột sữa chua probiotic. Do đó việc tìm hiểu

các biện pháp cải thiện khả năng sống của vi khuẩn probiotic trong quá trình sản
xuất là một việc làm cấp thiết. Đề tài “Thử nghiệm tạo bột sữa chua synbiotic”
nhằm thăm dò các chất bảo vệ vi khuẩn probiotic.
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

2

1.1 
Sữa chua là sản phẩm lên men từ sữa rất giàu protein. Nó được những người du
mục vùng Mount Elbus phát hiện từ xưa. Ngày nay, sữa chua được tiêu thụ mạnh
tại các nước vùng Địa Trung Hải, trung tâm Châu Âu và Châu Á.
Khả năng sống sót và hoạt tính của vi khuẩn sữa chua là đặc điểm quan trọng
giúp chúng có thể sống sót trong sản phẩm qua thời hạn bảo quản, đồng thời giúp
chúng vượt qua điều kiện acid ở dạ dày cũng như ảnh hưởng của các enzyme và
muối mật ở ruột non. Các chuyên gia cho rằng các sản phẩm chỉ chứa một lượng
nhỏ giống khởi động hoặc các sản phẩm chỉ có hương sữa chua, không có vi
khuẩn sống mà vẫn dán nhãn là sữa chua rất dễ gây nhầm lẫn cho người tiêu dùng.
Do vậy, cần có luật cho tất cả các sản phẩm, bao gồm cả sữa chua, để đạt mức tối
thiểu giống khởi động hoạt động [11].
Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, sữa chua còn sở hữu giá trị đối kháng và chữa
bệnh. Các đặc điểm cảm quan có giá trị của sữa chua phụ thuộc vào lượng
carbonyl chủ yếu là acetaldehyde, acetone, diacetyl và ethanol được tạo ra do
giống khởi động, pH thấp của sữa chua tạo môi trường không mong muốn cho sự
phát triển của hầu hết các vi sinh vật gây thối.
1.1.1 Các giá trị của sữa chua
Giá trị dinh dưỡng
Theo Hargrove và Alforrd (1980), McDonough và cộng sự (1982), sử dụng sữa
chua có liên quan đến sự gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng cho người tiêu dùng do
khả năng tiêu hóa protein tăng. Chất béo của sữa chua cũng tiêu hóa dễ dàng hơn
phụ thuộc vào các phản ứng tiền tiêu hóa nhất định trong quá trình lên men. Sữa

chua cung cấp lượng protein, carbonhydrate, calcium và các vitamin B cao hơn
sữa, lượng amino acid tự do của sữa chua (213,5mg/100g) cao hơn của sữa đã
được acid hóa đến pH 4,6 (80mg/100g) [11].


Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

3

Giá trị đối kháng
Lactobacilli có thể tạo ra các hợp chất kháng khuẩn như acidolin, acidophin,
bacteriocin. Các chất này có ảnh hưởng bất lợi đến vi sinh vật gây bệnh. Kilara và
Shahani (1967) cho biết sữa chua chứa lactose ít hơn sữa và có hoạt tính lactase,
điều này có ích cho việc tiêu hóa lactose ở ruột non. Giống khởi động có tác dụng
đối kháng đến vi sinh vật không mong muốn. Theo Gilliland (1990), một số chất
chuyển hóa cũng được tạo ra do các giống khởi động trong quá trình lên men, các
chất này có tác dụng kiềm chế các vi sinh vật ở ruột [11].
Giá trị chữa bệnh
Sự kết hợp Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium spp. Với giống khởi
động làm cho sữa chua có giá trị chữa bệnh. Sữa chua còn được báo cáo có tác
dụng hypocholesterolaemic và tác dụng chống ung thư. Ở những người thử
nghiệm sử dụng lượng lớn sữa chua thì lượng cholesterol giảm. Người ta mặc định
rằng điều này là do một nhân tố được tạo ra hoặc được tăng cường bởi hoạt động
lên men của giống khởi động. Việc giảm cholesterol là do hydroxymethyl
glutarate kiềm chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể, vì vậy làm giảm lượng
cholesterol trong cơ thể. Hoạt chất chống chất gây ung thư hoặc chống ung thư
được biểu lộ bởi nhiều chủng vi khuẩn sinh acid lactic. Theo Gilliland (1991), hoạt
tính chống ung thư được duy trì ngay cả khi xử lý nhiệt thì nó kết hợp với thành tế
bào giống khởi động [11].
1.1.2 Phân loại sữa chua

Trên thị trường hiện nay, sản phẩm sữa chua rất đa dạng về chủng loại. Cấu
trúc và mùi vị sữa chua luôn được các nhà sản xuất thay đổi phù hợp với thị
trường và thói quen sử dụng của khách hàng tại các nước khác nhau.
Dựa vào giá trị dinh dưỡng, theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới – WHO và Tổ Chức
Nông Lương – FAO, sản phẩm sữa chua có thể chia thành 3 nhóm là sữa chua béo
(fat yogurt) có hàm lượng chất béo trong sản phẩm không thấp hơn 3,0%; sữa
chua bán gầy (partially skimmed yogurt) có hàm lượng chất béo nằm trong khoảng
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

4

0,5 - 3,0%; sữa chua gầy (skimmed yogurt) có hàm lượng chất béo không lớn hơn
0,5% [3].
Dựa vào công nghệ, sản phẩm sữa chua được phân loại bao gồm có sữa chua
truyền thống (set type): sản phẩm có cấu trúc gel mịn, trong quy trình sản xuất sữa
chua truyền thống, sữa nguyên liệu sau khi được xử lý, cấy giống rồi được rót vào
bao bì, quá trình lên men diễn ra trong bao bì làm xuất hiện khối đông và tạo cấu
trúc đặc trưng cho sản phẩm; sữa chua dạng khuấy (stirred): khối đông xuất hiện
trong sản phẩm sau quá trình lên men bị phá hủy một phần do sự khuấy trộn cơ
học, trong quy trình sản xuất sữa chua dạng khuấy, sữa nguyên liệu được xử lý và
cấy giống rồi lên men trong thiết bị chuyên dùng, tiếp theo là quá trình làm lạnh và
rót sản phẩm vào bao bì, sữa chua dạng khuấy sẽ không có cấu trúc gel mịn và
đồng nhất như sữa chua truyền thống; sữa chua uống (drinking type) hay sữa chua
dạng lỏng: khối đông xuất hiện trong quá trình lên men bị phá hủy hoàn toàn, sản
phẩm có dạng lỏng khi sử dụng, người tiêu dùng không cần dùng muỗng, điểm
khác biệt là sau quá trình lên men, người ta sử dụng phương pháp khuấy trộn hoặc
phương pháp đồng hóa áp suất cao để phá hủy cấu trúc gel của khối đông và làm
giảm độ nhớt của sản phẩm; sữa chua lạnh đông ( frozen type); sản phẩm có dạng
tương tự như kem, quá trình lên men sữa được thực hiện trong thiết bị chuyên
dùng, tiếp theo hỗn hợp sau khi lên men sẽ được đem đi xử lý và lạnh đông để làm

tăng độ cứng cho sản phẩm rồi bao gói; sữa chua cô đặc (concentrated yogurt):
quy trình sản xuất bao gồm các công đoạn quan trọng như lên men sữa, cô đặc,
làm lạnh và bao gói sản phẩm, trong quá trình cô đặc, người ta tách bớt huyết
thanh sữa ra khỏi sản phẩm.
Ngày nay, để đa dạng hóa hơn nữa sản phẩm sữa chua trên thị trường, người ta
có thể bổ sung thêm hương liệu, chất màu thực phẩm hoặc purée trái cây cho vào
sản phẩm [3].


Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

5

1.1.3 Nguyên liệu và vi sinh vật trong sản xuất sữa chua
Sữa chua có thể được sản xuất từ sữa tươi, sữa cô đặc, sữa bột dưới dạng sữa
hoàn nguyên hoặc sữa tái chế. Sữa tươi sử dụng trong sản xuất sữa chua phải có
chất lượng tốt.
Các yêu cầu quan trọng cho nguyên liệu sữa tươi như sau:
+ Tổng số tế bào vi sinh vật trong sữa chua càng thấp càng tốt
+ Không chứa thể thực khuẩn
+ Không chứa các enzyme
+ Không chứa dư lượng hóa chất có nguồn gốc từ quá trình tẩy rửa và vệ sinh
hoặc thiết bị đựng sữa [3].
Hai chỉ tiêu hóa lý quan trọng của sữa nguyên liệu là hàm lượng chất béo và
hàm lượng chất khô không béo. Lượng chất béo trong sữa sẽ được hiệu chỉnh nhờ
quá trình chuyển hóa để phù hợp theo yêu cầu của sản phẩm. Còn lượng chất khô
không béo - theo quy định của WHO/FAO - không được thấp hơn 8,2%. Các kết
quả nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng khi ta tăng hàm lượng chất khô
trong sữa nguyên liệu, đặc biệt là tăng hàm lượng casein và protein huyết thanh
sữa thì sẽ làm cho cấu trúc khối đông trở nên bền và ổn định hơn, tránh được hiện

tượng tách huyết thanh trong sản xuất sữa chua truyền thống [3].
Để thực hiện quá trình lên men sữa chua, người ta sử dụng nhóm vi khuẩn
lactic đồng hình. Hai loài phổ biến nhất là cầu khuẩn Streptococcus thermophilus
và trực khuẩn Lactobacillus bulgaricus. Một số tính chất của 2 loài này thể hiện
trong bảng 1.1.
Các nhà khoa học cho rằng khi cùng nuôi cấy Streptococcus thermophilus và
Lactobacillus bulgaricus trong môi trường sữa thì hiện tượng tương tác sinh học
sẽ làm cho sự tăng trưởng của cả hai loài trở nên tốt hơn khi so sánh với trường
hợp nuôi cấy từng loài trong môi trường riêng lẻ. Thông thường, tỷ lệ giữa cầu
khuẩn và trực khuẩn trong canh trường giống là 1:1 hoặc 2:1. Tuy nhiên, tỷ lệ này
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

6

có thể thay đổi phụ thuộc vào hoạt động của chủng sử dụng và những yêu cầu về
chỉ tiêu chất lượng sản phẩm.
 Một số tính chất của vi khuẩn lactic được sử dụng trong sản xuất sữa
chua
Tính cht
Streptococcus
thermophilus
Lactobacillus
bulgaricus
- Nhiệt độ sinh trưởng (
o
C)
+ Tối thiểu
20
22
+ Tối ưu

40
40 - 45
+ Tối đa
50
52
- Sinh tổng hợp acid lactic
+ Nồng độ lactate (%) trong sữa sau 24h
lên men ở nhiệt độ tối ưu
0,9
2,5
+ Dạng đồng phân của acid lactic
L (+)
D (-)
- Chuyển hóa citrate
Không
Không
- Sinh tổng hợp acetaldehyde
Vết
Có
- Sinh tổng hợp diacetyl
Vết
Vết
- Sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào
Có
Có
[3]
Trong quá trình lên men, đầu tiên vi khuẩn Streptococcus thermophilus phát
triển một cách nhanh chóng, sử dụng các amino acid do Lactobacillus bulgaricus
tạo ra, thông qua đó tạo acid lactic. Theo Hamann và Marth (1983), pH của yaourt
thương mại thường trong khoảng 3.7 - 4.3. Mặc dù Streptococcus thermophilus

hình thành nên acetaldehyde như là một sản phẩm trao đổi chất, nhưng con đường
hình thành ít chủ động ở nhiệt độ lên men bình thường khi được so sánh với
Lactobacillus bulgaricus, loài tạo ra acetaldehyde tạo mùi vị đặc trưng cho sản
phẩm [15].

Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

7

1.1.4. Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men sữa chua
Bản chất của quá trình lên men sữa chua là quá trình lên men lactic đồng hình.
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactic tạo ra
chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ thuộc về acid acetic,
acetone, diacetyl…
Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
C
6
H
12
O
6
2 CH
3
CHOHCOOH + 21,8.10
4
J
Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu
trình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho chu trình này tất cả các loại
enzyme aldolase, còn hydro tách ra khi đề hydro hóa triozophosphate và được
chuyển đến pyruvate. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có

enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không phân hủy nữa mà tiếp tục khử
thành acid lactic theo sơ đồ chuyển hóa hình 1.1.
Trong quá trình lên men lactic, ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình)
ethanol, trong dịch lên men xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học khác acetaldehyde,
acid acetic, acetone, diacetyl… chúng là sản phẩm trung gian hoặc là sản phẩm
phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất
thấp. Một số hợp chất trong nhóm này thường rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò
quan trọng trong việc hình thành nên mùi, vị đặc trưng cho sản phẩm lên men
lactic. Đáng chú ý nhất là diacetyl và acetaldehyde [3].
Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, diacetyl trong môi trường sẽ tăng dần
rồi sau đó sẽ giảm dần vào giai đoạn cuối, đặc biệt khi hàm lượng citrate giảm
dần. Một phần diacetyl sẽ được chuyển hóa thành acetoin và 2,3 butanediol. Quá
trình sinh tổng hợp diacetyl liên quan đến sự chuyển hóa citrate.
Acetaldehyde được tổng hợp từ các sản phẩm của quá trình chuyển hóa
glucose và một số amino acid như alamine, lysine và serine. Riêng Lactobacillus
bulgaricus có thể chuyển hóa threonine thành acetaldehyde nhờ enzyme threonine
aldolase.
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

8



Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa đường thành acid lactic
Nhiều loại vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp acetaldehyde. Ngược lại,
một số chủng thuộc giống Leuconostoc lại có khả năng sử dụng và chuyển hóa
acetaldehyde. Đây là hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng của các
sản phẩm lên men từ sữa như sữa chua, bơ…
Tỷ lệ hàm lượng diacetyl/ acetaldehyde ảnh hưởng lớn đến giá trị cảm quan
của sữa chua và bơ. Tỷ lệ này phụ thuộc vào thành phần các chủng vi sinh vật sử

dụng trong tổ hợp giống và các thông số kỹ thuật của quá trình lên men như nhiệt
độ, pH đầu, lượng cấy giống
Glucose – 6 – phosphate
Fructose – 6 – phosphate
Fructose – 1,6 – phosphate
Acid – 1,3 – diphosphoglyceric
Glucose
[3]
Phosphoglyceraldehyde

Phospho dioxyaceton

Acid pyruvic

Acid lactic

Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

9

1.2 
1.2.1. Giới thiệu về probiotic
Sự quan tâm đến vai trò của probiotic đối với sức khỏe con người bắt đầu vào
khoảng 1908 khi Metchnikoff đề nghị rằng mọi người nên sử dụng sữa lên men
với Lactobacilli để tăng tuổi thọ. Tuy nhiên chỉ mới đây các mối tương quan giữa
các vi sinh vật đường ruột và lợi ích sức khỏe bắt đầu được hiểu rõ. Hiện nay mọi
người công nhận sự cân bằng lượng vi khuẩn trong đường tiêu hóa sẽ đi kèm với
sự tiêu hóa tốt và khỏe mạnh. Các vi sinh vật chủ yếu liên quan đến sự cân bằng
này là Lactobacilli và Bifidobacteria. Những yếu tố tích cực ảnh hưởng đến sự
tương tác giữa các chủng vi sinh vật đường ruột, như căng thẳng và chế độ ăn

kiêng, dẫn đến tác động có hại cho sức khỏe. Trong những năm gần đây, vi khuẩn
probiotic ngày càng được tích hợp vào các loai thực phẩm làm từ sữa như là thực
phẩm cho người ăn kiêng. Một trong những sản phẩm làm từ sữa phổ biến nhất có
chứa các tế bào Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium bifidum còn sống
gọi là sữa chua sinh học (bio-yogurt). Số lượng vi sinh vật sống thích hợp, thường
gọi là “lượng tối thiểu có giá trị chữa bệnh”, cần sử dụng thường xuyên để duy trì
hiệu quả của probiotic cho người tiêu dùng. Rybka và Kailasapathy (1995) cho
rằng nên sử dụng hơn 100g sữa chua sinh học mỗi ngày có chứa hơn 10
6
CFU/ml.
Do đó, sự sống sót của vi khuẩn này trong suốt thời hạn sử dụng và cho đến khi
tiêu thụ là vấn đề quan trọng cần quan tâm [15].
Lịch sử đã ghi nhận các tính chất có lợi của thực phẩm bổ sung vi sinh vật sống
như sữa lên men từ nhiều thế kỷ trước. Công dụng của chúng trong điều trị các
bệnh cơ thể đã được đề cập ngay cả trong Kinh Thánh. Các nhà khoa học ở thời kỳ
sơ khai, chẳng hạn như Hippocrates và những người khác coi sữa lên men không
chỉ là một sản phẩm thực phẩm mà còn là một loại thuốc. Họ mô tả sữa chua trong
việc trị bệnh rối loạn ở dạ dày và ruột. Vào đầu thế kỷ XX, nhà vi khuẩn học
người Nga, Eli Metchnikoff (Viện Pasteur, Pháp), là người đầu tiên đưa ra một lời
giải thích khoa học cho các tác dụng có lợi của vi khuẩn sinh acid lactic có trong
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

10

sữa lên men. Ông cho rằng sức khỏe tốt và tuổi thọ cao của người Bulgaria là do
tiêu thụ một lượng lớn sữa lên men, được gọi là sữa chua. Năm 1908, ông đưa ra
nguyên lý “trường sinh bất tử”. Nội dung chính trong lý thuyết của ông là các vi
khuẩn sinh acid lactic đã xuất hiện trong quá trình đào thải các vi sinh vật có hại
thường có trong ruột và làm tăng tuổi thọ. Metchnikoff đã giải thích rằng do acid
lactic và các sản phẩm khác được sản xuất bởi vi khuẩn sinh acid lactic trong sữa

chua đã ức chế sự tăng trưởng, độc tính và bào tử của vi khuẩn kỵ khí trong ruột
già. Vào năm 1899, Tissier (Viện Pasteur, Pháp), đã phân lập Bifidobacteria từ
phân của trẻ bú sữa mẹ và thấy rằng chúng là một thành phần chủ yếu của các vi
khuẩn đường ruột ở người. Tissier đề nghị sử dụng Bifidobacteria sẽ thay thế các
vi khuẩn thối rửa liên quan đến chứng đầy hơi trong khi phát triển thành vi sinh
đường ruột [15].
Các nghiên cứu về việc sử dụng các chủng lactic trong thực phẩm vẫn tiếp tục
trong suốt thế kỷ. Nhiều báo cáo kể từ đó đã mang lại kết quả khác nhau với các
lợi ích của việc tiêu thụ các loại thực phẩm probiotic. Nghiên cứu trước đây liên
quan đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị nhiễm trùng đường ruột. Các nghiên
cứu gần đây đã tập trung vào các khía cạnh khác của lợi ích sức khỏe mà còn có
thể được bắt nguồn từ những sinh vật này, cũng như chọn lọc giống để đảm bảo sự
tồn tại của các vi khuẩn ở đường tiêu hóa và thực phẩm mang (thực phẩm chứa
probiotic).
Từ “probiotic”, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “sự sống” và đã có
nhiều định nghĩa trong quá khứ. Các định nghĩa như là “các chất được sản xuất bởi
nguyên sinh động vật kích thích sự tăng trưởng của các loài khác” hoặc “sinh vật
và các chất có tác dụng có lợi trên động vật chủ bằng cách góp phần cân bằng vi
khuẩn đường ruột” đã được sử dụng. Nhưng các định nghĩa trên là không thỏa
đáng bởi vì “chất” sẽ bao gồm các hóa chất như thuốc kháng sinh. Định nghĩa
probiotic kể từ đó được mở rộng để nhấn mạnh tầm quan trọng của các tế bào sống
như là một thành phần thiết yếu của sản phẩm probiotic. Gần đây nhất, Huis in‟t
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

11

Veld và Havenaar (1991) mở rộng định nghĩa của probiotic như là một hoặc nhiều
chủng vi sinh vật sống trộn với nhau, được sử dụng cho người hoặc động vật (ví
dụ như các tế bào khô hay như một sản phẩm lên men), hiệu ứng có lợi cho vật
chủ bằng cách cải thiện các tính chất của các vi sinh vật đường ruột. Định nghĩa

này hàm ý rằng các sản phẩm probiotic, ví dụ như sữa chua sinh học, có chứa vi
sinh vật sống và cải thiện tình trạng sức khỏe của vật chủ bằng cách tạo các hiệu
ứng có lợi trong đường tiêu hóa [15].
Tác động có lợi từ sự tiêu thụ sữa lên men đã là một vấn đề gây tranh cãi
nhiều. Tuy nhiên, các nghiên cứu tiến hành từ đầu thế kỷ đã tăng cường sự hiểu
biết về các tác dụng điều trị và nó được công nhận là lành mạnh. Việc tiêu thụ các
sản phẩm probiotic là hữu ích trong việc duy trì sức khỏe tốt, hồi phục sinh lực cơ
thể và trong cuộc chiến chống bệnh đường ruột và các bệnh tật khác. Nhiều bài
báo khoa học chú ý đến việc nghiên cứu sử dụng L. acidophilus và
Bifidobacterium như một chủng loại dùng trong thực phẩm.
Theo Hughes và Hoover (1991), vi khuẩn probiotic như Bifidobacteria,
Lactobacilli có đặc tính đối kháng. Cả L. acidophilus và B. bifidum có khả năng
gây ức chế đối với các tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm. Một số nghiên
cứu cho thấy có sự kiểm soát phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đường ruột qua
sữa có chứa L. acidophilus hay B. bifidum hoặc cả hai [15].
Các giá trị chữa bệnh của các probiotic có thể kể đến như:
+ Kiểm soát các vi sinh vật đường ruột bằng các cơ chế như: tạo ra các chất
ức chế hoặc kháng khuẩn như: acid hữu cơ, hydrogen peroxide, bacteriocin,
kháng sinh và phân cắt các acid trong mật; hoạt động như đối kháng cạnh
tranh, ví dụ: cạnh tranh khu vực sống và chất dinh dưỡng, kích thích hệ miễn
dịch.
+ Tăng khả năng tiêu hóa đường lactose.
+ Giảm mức cholesterol trong huyết thanh
+ Hoạt tính chống ung thư
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

12

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu probiotic
Nguồn gốc của sữa lên men đã có từ buổi bình minh của văn minh nhân loại,

chúng đã được nhắc đến trong kinh thánh và những quyển sách thánh thiên của Ấn
Độ giáo. Điều kiện khí hậu đảm bảo về mùi vị chuyên biệt là nền tảng cho sự phát
triển của rất nhiều loại sữa chua hay sản phẩm sữa lên men truyền thống như kefir,
koumiss và dahi. Những sản phẩm này, nhiều loại vẫn còn tiêu thụ rộng rãi, đã
được dùng cho việc chữa bệnh trước khi sự tồn tại của vi khuẩn trong chúng được
phát hiện.
Từ những buổi ban đầu của thế kỷ 20, chức năng chính của vi sinh vật đường
ruột hoàn toàn không được biết đến. Ilya Ilyich Metchnikoff, người đoạt giải
thưởng Nobel Y học năm 1908, tại viện Pasteur đã liên hệ giữa sức khỏe và tuổi
thọ trong sự tiêu hóa sữa chua có hiện diện của vi khuẩn. Vào năm 1907, ông
khám phá ra vi khuẩn liên quan đến lên men sữa chua, Lactobacillus bulgaricus và
Streptococcus thermophilus, có thể cản được việc lên men thối rữa trong đường
ruột và việc tiêu thụ sữa chua đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức khỏe tốt.
Thật vậy, ông cho rằng tuổi thọ cao của người nông dân Bungary vì họ đã dùng
sữa chua có chứa các loài Lactobacillus.
Sự phát hiện Bifidobacteria trong phân su trẻ nhỏ nuôi bằng sữa mẹ bởi Tissier
(1906) cũng đóng một vai trò quan trọng cho việc thiết lập nền tảng vi khuẩn
chuyên biệt đóng vai trò duy trì sức khỏe. Tissier đã ghi nhận lại lâm sàng những
lợi ích từ việc điều chỉnh vi sinh vật ở trẻ nhỏ với chứng nhiễm trùng đường ruột.
Cùng thời điểm đó, rất nhiều người đã hoài nghi về khái niệm liệu pháp vi khuẩn
và nghi vấn rằng vi khuẩn trong sữa chua như L. bulgaricus có thể tồn tại được
không khi di chuyển trong ruột, dính lại và phát huy được tác dụng của chúng.
Vào đầu những năm 1920, L. acidophilus trong sữa đã được xác nhận là có tác
dụng điều trị đặc biệt đối với hệ tiêu hóa. Người ta tin rằng sự định cư và phát
triển của những vi sinh vật này trong đường ruột sẽ phát huy hiệu quả của chúng.
Vào những năm 1930 tại Nhật Bản, Shirota đã tập trung nghiên cứu tìm ra một
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

13

chủng để phát triển sản phẩm sữa lên men để phân phối trong các phòng khám của
ông. Sản phẩm đầu tiên của ông chứa đựng L. acidophilus Shirota (sau đó có tên là
L. casei Shirota) là cơ sở cho sự thành lập công ty Yakult Honsha sau này [12].
Chỉ vào cuối thế kỷ 20, vi khuẩn đường ruột mới có một vài chức năng được
tìm thấy như sự trao đổi chất, dinh dưỡng và bảo vệ. Chức năng trao đổi chất được
xem là tính chất cơ bản cho quá trình lên men của cặn tiêu hóa không tiêu hóa
được và dịch nhầy nội sinh, tiết kiệm năng lượng như ở các acid mạch ngắn, sản
sinh vitamin K và hấp thụ ion. Chức năng dinh dưỡng là dựa vào sự điều khiển
tăng sinh và biệt hóa trên tế bào biểu mô, sự phát triển và nội cân bằng của hệ
thống miễn dịch. Cuối cùng, chức năng bảo vệ có liên quan đến ảnh hưởng cản và
chống lại mầm bệnh. Lợi ích về sức khỏe được mang đến khi tiêu thụ thực phẩm
chứa đựng Lactobaccillus acidophilus, Bifidobacterium và L.casei đã được ghi
nhận tốt. Streptococcus thermophilus và L. delbrueckii ssp. bulgaricus và một
trong những chủng vi khuẩn probiotic.
Những hướng dẫn về thực phẩm như thế nào là probiotic đã được ấn bản bởi
FAO/WHO năm 2002 [12]. Những quy định này đòi hỏi các chủng là probiotic
phải có ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và duy trì một lượng lớn còn sống vào cuối
thời hạn sử dụng của chúng. Điều này phải được định rõ trong thành phần sản
phẩm đã được chứng nhận lâm sang ở thời điểm cuối cùng. Định nghĩa probiotic
yêu cầu rằng tác động và tính an toàn probiotic đặc biệt quan tâm và vì vậy, hai
tính chất này là một phần quan trọng được xét đến cho việc sử dụng ở con người.
1.2.3 Ứng dụng của probiotic trong thực phẩm chức năng
Quan niệm về thực phẩm có thể phục vụ như thuốc lần đầu tiên xuất hiện đã
hơn mấy ngàn năm bởi những nhà triết học Hy Lạp. Hippocrates đã viết rằng hãy
để thực phẩm là sở hữu của của thuốc và thuốc là sở hữu của thực phẩm. Trong
thời gian gần đây, quan niệm về thực phẩm có tính thuốc đã hồi sinh với tên gọi
thực phẩm chức năng. Probiotic cũng được xem là thực phẩm chức năng. Việc tiêu
thụ vi khuẩn probiotic qua các sản phẩm thực phẩm là một cách lý tưởng để tái lập
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

14

sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Sản phẩm từ sữa được xem xét đặc biệt như
là một phương tiện lý tưởng để vận chuyển vi khuẩn probiotic vào ống dạ dày –
ruột ở người. Chất nền sử dụng thường xuyên là phô mai, sữa chua, kem và những
thực phẩm từ sữa khác. Ngoài ra, trái cây, rau, đậu và ngũ cốc cũng được xem là
chất mang probiotic tốt. Trái cây và rau có thể được xem là chất nền tốt bởi vì
chúng chứa đựng chất dinh dưỡng như chất khoáng, vitamin, xơ sợi và chất chống
oxy hóa. Sự phát triển của những sản phẩm nước trái cây probiotic khác nhau đã
được nghiên cứu. Prado và cộng sự (2008) đã miêu tả về sự đa dạng của nước giải
khát probiotic không phải từ sữa.
Một chủng được coi là ứng viên có giá trị để sử dụng như tác nhân hỗ trợ ăn
kiêng phải tuân theo các yêu cầu nhất định. Chủng đó phải là vi sinh vật cư trú
trong đường tiêu hóa của người, sống sót được qua đường tiêu hóa trên với số
lượng lớn, có thể gắn lên một vị trí thích hợp và có tác động có lợi khi ở trong hệ
tiêu hóa. Để sống sót, chủng vi sinh vật phải chịu điều kiện ở dạ dày (pH 1,0-4,0),
chịu được muối mật ở ruột non, chịu được tác động của các enzyme ở hệ tiêu hóa
(lysozyme) và chất chuyển hóa độc dược tạo ra qua quá trình tiêu hóa. Theo
Gilliland (1979), vi khuẩn sử dụng trong lên men sữa chua truyền thống,
Lactobacillus bulgaricus và Streptococus thermophilus, không thuộc hệ vi sinh vật
bản địa đường ruột, không chịu được muối mật và không thể sống sót đi đến ruột.
Tuy nhiên các giống vi sinh vật sữa chua truyền thống này có thể có tác động có
lợi như hình thành các chất chuyển hóa từ quá trình lên men cũng như bằng hoạt
động kiềm chế mầm bệnh hoặc tăng cường sự tiêu hóa lactose [15].
Vì các tiêu chuẩn trong tài liệu thường công bố rằng không ít hơn một triệu tế
bào sống/ml sản phẩm probiotic phải hiện diện để chuyển tác động của probiotic
đến người tiêu dùng, nên có thể mong muốn rằng chủng probiotic nhân lên nhiều
lần đạt đến lượng tế bào cao trong sản phẩm đã lên men và chịu đựng được acid
cao để đảm bảo lượng tế bào sống cao trong suốt quá trình bảo quản. Các chủng
Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

15

được lựa chọn phải có khả năng lên men sữa tương đối nhanh khi chỉ sử dụng một
chủng hay kết hợp với các chủng khác [15].
Khả năng tác động đến thành phần hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách hấp thụ
vi khuẩn probiotic một phần nào đó phụ thuộc mức độ sử dụng. Speck (1978) cho
rằng mật độ vi khuẩn 10
8
– 10
9
CFU/g là cần thiết tại thời điểm sử dụng. Vì vậy,
chủng probiotic phải duy trì sức sống trong thực phẩm cho đến khi sử dụng.
Một vài sản phẩm được bổ sung probiotic có chứa inulin hoặc oligofructose là
“các nhân tố bifido” (“bifidogenic factors”), cũng được gọi là prebiotic. Trong khi
các vi khuẩn Bifido gặp khó khăn trong việc nhân lên trong sản phẩm do nhạy cảm
với oxy và chịu được acid kém thì sự bổ sung prebiotic vào thực phẩm sữa có thể
mang lại kết quả hứa hẹn để đảm bảo sự hiện diện lớn vi khuẩn Bifido trong suốt
thời hạn sử dụng thông thường của sản phẩm sữa. Prebiotic được sử dụng bổ sung
vào việc ăn kiêng của người và cung cấp thức ăn cho sự phát triển của vi khuẩn
Bifido ở ruột do đó có tên “bifidogenic factor”. Các prebiotic là những đường
phức mà con người không thể chuyển hóa trực tiếp nhưng lại là nguồn cung cấp
carbonhydrate cho hệ vi sinh đường ruột. Các oligosaccharide, như là fructo-
oligosaccharide, lactulose, raffinose, các đơn phân inulin, được sử dụng như
“prebiotic” hoặc “bifidogenic factor” [15].
1.3 Bifidobacterium và 
1.3.1 Giới thiệu về Bifidobacterium
Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, không di động, kỵ khí bắt buộc và
được phân loại như sau:
+ Lớp : Actinobacteria

+ Lớp phụ : Actinobacteriadae
+ Bộ : Bifidobacterales
+ Họ : Bifidobacteriaceae
+ Giống : Firmicutes

Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

16

Bifidobacterium
 Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với
nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, dạng hình cây gậy đánh gôn,
dạng phân nhánh…và cũng thường xuyên xuất hiện ở dạng chữ “Y”.
Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria thường đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc xếp
thành hình chữ V, kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,5-1,3 µm.





Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn Bifidobacteria
Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhánh dưới điều kiện
tăng trưởng khác nhau. Khi sử dụng N-Acetyl D-Glucosamine, acid aspartic, acid
glutamic, serine và Ca
2+
trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến hình dạng
của tế bào vi khuẩn Bifidobacteria.
Tế bào Bifidobacteria không có vỏ bao và không có hệ thống tiêm mao bao
quanh. Vách tế bào được cấu thành bởi 3 thành phần chính là peptidoglycan,

polysaccharide, acid lipoteichoic. Peptidoglycan của vi khuẩn Bifidobacteria được
cấu tạo từ acid N-Acetylmuramic và N-Acetylglucosamine. Các phân tử này kết
hợp với nhau tạo thành chuỗi oligopeptide. Ngoài ra, vách tế bào vi khuẩn
Bifidobacteria còn chứa nhiều polysaccharide gồm các phân tử đường glucose,
galactose, … liên kết với nhau.


Khóa luận cử nhân khoa học Chương 1. Tổng quan tài liệu

17

 Đặc điểm sinh lý
Bifidobacteria cư trú trong ruột của cơ thể người và động vật. Chúng đóng vai
trò quan trọng trong việc kiểm soát pH ở đường ruột và kết tràng. Chúng được
phát hiện từ phân trẻ sơ sinh còn bú mẹ. Lượng vi khuẩn này phổ biến trong
đường ruột, tính ổn định của chúng liên quan đến tuổi tác, tuổi càng lớn thì lượng
vi khuẩn càng giảm. Lượng vi khuẩn Bifidobacteria trong cơ thể bị tác động nhiều
bởi các yếu tố như thức ăn, nước uống, sử dụng kháng sinh và tình trạng cơ thể.
 Dạng hô hấp
Bifidobacteria là vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Tuy nhiên, tính nhạy cảm với oxy
thay đổi tùy theo loài và các giống khác nhau của mỗi loài. Một số loài có thể chịu
được oxy khi có sự hiện diện của CO
2
. Bifidobacteria có nhiều dạng hô hấp khác
nhau, bao gồm:
+ Tăng trưởng hiếu khí không có sự tích lũy H
2
O
2
: một dòng vi khuẩn B.

bifidum chịu được điều kiện hiếu khí, tạo thành một lượng nhỏ H
2
O
2
bởi quá
trình oxy hóa NADH.
+ Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H
2
O
2
: sự tích lũy H
2
O
2
là một độc tố đối
với Enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase trong quá trình chuyển hóa
đường của giống Bifidobacteria.
+ Tăng trưởng không có sự tích lũy của H
2
O
2
: một số dòng vi khuẩn
Bifidobacteria có mức oxy hóa khử thấp trong quá trình chuyển hóa các chất
và không tạo H
2
O
2
.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn này là 33

o
C- 41
o
C. Tế bào
không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20
o
C và trên 46
o
C. Tuy nhiên, Bifidobacterium
thermacidophilus có khả năng phát triển ở nhiệt độ 49,5
o
C. Phần lớn các chủng có
nguồn gốc từ động vật đều có khả năng phát triển ở nhiệt độ 45
o
C. Riêng các
chủng có nguồn gốc từ người thì không có khả năng phát triển ở nhiệt độ này.