Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa coumarin

Bộ YTỂ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĐỖ THỊ BÍCH THUẬN
NGHIÊN CỨU THÀNH LẬP TIÊU CHUẨN KIỂM n g h iệ m
■ ■
MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CHỨA COUMARIN
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn : TS NGUYỄN VIẾT THÂN
DS HỒ TRUNG CHIẾN
Noi thực hiện : BỘ MÔN DƯ3C LIỆU
Thòi gian thực hiện : 02/2006 - 05/2006.
Hà Nội, 5 - 2006
Lòi cm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
thầy giáo TS Nguyễn Viết Thân và thầy giáo DS Hồ Trung Oiiến đã
hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Và cũng muốn gửi lời cảm Cfn đến các thầy cô giáo, kĩ thuật viên bộ
môn Dược liệu đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt thời gian thực hiện
em thực hiện khoá luận tại bộ môn.
Để có được như ngày hôm nay, em không biết nói gì hơn là bày tỏ
lòng biết ơn tất cả các thầy, cô giáo trong trường; toàn thể các bạn;
người thân trong gia đình đã dạy bảo, giúp đỡ động viên em suốt năm
năm học vừa qua.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Đỗ Thi Bích Thuân
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần I : Tổng quan
3

Phần II: Thực nghiệm và kết quả
5
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
5
2.1.1. Nguyên liệu
5
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu

.
5
2.2. Kết quả thực nghiệm 10
2.2.1. Bạch chỉ 10
2.2.2. Cỏ nhọ n ồ i
19
2.2.3. Đương q u y 26
2.2.4. Mần tưới 34
2.2.5. Mò mâm x ô i 40
2.2.6. Sài đ ấ t 46
Phần ni: Kết luận 53
Tài liêu tham khảo.
CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT
HPTLC: Sắc ký lóỉp mỏng hiệu năng cao
TT : Thuốc thử.
nm : nano mét (10'^ m).
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong giai đoạn gần đây, ngành Dược Việt Nam phát triển khá mạnh mẽ
cả về số lượng, chủng loại cũng như chất lượng các sản phẩm. Bên cạnh các
mặt hàng thuốc tân dược các sản phẩm Đông dược cũng ngày một được sử
dụng nhiều. Trên thị trường xuất hiện nhiều tên công ty mà khi nhắc đến
người ta đã nghĩ ngay tới các sản phẩm Đông dược như: Traphaco, Đông Nam

dược Bảo Long, Đông dược Phúc Hưng Mỗi công ty hàng năm cho ra đời
nhiều sản phẩm mới cả về chủng loại cũng như mẫu mã. Số lượng các sản
phẩm đông dược sản xuất trong nước có nguồn gốc dược liệu cũng như các
sản phẩm nhập nội khá nhiều. Tuy nhiên, hiệu quả chữa bệnh của chúng còn
chưa cao. Để đánh giá hiệu quả chữa bệnh của thuốc Đông dược người ta dựa
trên nhiều yếu tố, nhưng yếu tố quyết định nhất là chất lượng nguyên liệu làm
thuốc. Chất lượng nguyên liệu lại được kiểm định qua các yếu tố như: nguyên
liệu này có đúng hay không? nguyên liệu có đạt yêu cầu ? .v.v.
Trong khi đó, nguồn nguyên liệu của Việt Nam khá phong phú với số
lượng cây cỏ hơn 3200 loài thuộc gần 1200 chi và trên 200 họ được dùng làm
thuốc. Nên việc xác định rõ được nguồn gốc thuờng không dễ dàng. Nhất là
trong giai đoạn hiện nay các văn bản mang tính pháp qui về quản lý kiểm soát
quá trình lưu thông, phân phối dược liệu trên thị trường còn thiếu thì công việc
kiểm nghiệm dược liệu để xác định rõ nguồn gốc, tránh nhầm lẫn giả mạo là
hết sức quan trọng. Các chuyên luận trong Dược điển thường chỉ mô tả: đặc
điểm hình thái cây thuốc, vị thuốc, đặc điểm vi học, các phản ứng định tính
nên các chuyên luận này mang nặng tính chất cảm quan; chưa có hình ảnh
hoá, lượng hoá các đặc điểm. Để góp phần cụ thể hoá và tạo điều kiện thuận
lợi cho việc sử dụng, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu thành lập
tiêu chuẩn kiểm nghiệm một sô dược liệu chứa Coumarin".
Với mục tiêu:
❖ Bổ sung thêm các đặc điểm làm tư liệu tham khảo góp phần tăng
tính hoàn thiện cho các chuyên luận trong Dược điển.
♦♦♦ Đưa chất lượng kiểm nghiệm dược liệu đạt mức tiêu chuẩn hoá
cao hơn.
Nội dung khoá luận:
Nghiên cứu minh họa đặc điểm hình thái câv thuốc bằng hình
ảnh.
Sử dụng kĩ thuật chụp ảnh hiển vi để đưa ra các hình ảnh của đặc
điểm giải phẫu, bột dược liệu.

<♦ Thực hiện quá trình vi thăng hoa các dược liệu nghiên cứu, quan
sát và chụp ảnh tinh thể dưới kính hiển vi.
*> Định tính hoạt chất trong dược liệu theo các chuyên luận trong
Dược điển Việt Nam III, chụp ảnh và phân tích các bản sắc ký
lớp mỏng hiệu năng cao trong các điều kiện khác nhau.
PHẦN I: TỔNG QUAN
Đầu thế kỷ XIX, người ta đã tìm ra chất Coumarin đầu tiên trong một
loại cây họ Đậu (Dipteryx odorata Willd. Fabaceae). Từ đó hình thành nên
nhóm hợp chất có tên chung “Coumarin” xuất phát từ tên địa
phương"Coumarou” của cây này.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã tìm ra
hơn 200 chất Coumarin khác nhau. So với các loại hợp chất khác thì đây quả
là một con số khiêm tốn, nhưng nó là một nhóm hợp chất quan trọng trong Y
học và thậm chí đã trở thành một chương quan trọng trong dược liệu cổ điển.
Các dược liệu chứa Coumarin thấy trong 150 loài thuộc 30 họ thực vật. Những
họ hay gặp như: họ Trúc đào (Apocỵnaceae), họ Cúc (Asteraceae), họ Hoa tán
(Apiaceae), họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) [2]
Trong khóa luận chúng tôi tiến hành nghiên cứu kiểm nghiệm 6 dược
liệu thường dùng có chứa Coumarin thu từ các cây thuộc 3 họ sau:
-Họ Cúc (Asteraceae), thuộc bộ Cúc (Asteraỉes). Phân lớp Cúc
(Asteridae), lớp Ngọc lan {Magnoliopsida). Trong họ này nghiên cứu các
dược liệu lấy từ các cây: cỏ nhọ nồi (Ecỉipta prostrata (L.) L.); Mần tưói
(Eupatorium fortunei Turcz.); Sài đất {Wedelia chinensis ( Osbeck) Meư.)-
- Họ Hoa tán (Apiaceae), thuộc bộ Hoa tán (Apiales). Phân lớp Hoa
hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan {Magnoliopsida). Dược liệu lấy từ cây Bạch chỉ
[Angelica dahurica (Fisch, ex Hoffm) Benth. et Hook.f. hoặc Angelica
dahurica (Fisch, ex Hoffm.) Benth. et Hook.f. var.formosana (Boiss.) Shan et
Yuan]; và cây Đưoíng quy di thực {Angelica acutiloba (Sieb, et Zucc.)
Kitagawa).
- Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), thuộc bộ Hoa môi {Lamíales). Phân

lớp Hoa môi (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnolìopsida). Trong họ này nghiên
cứu dược liệu lấy từ cây Mò mâm xôi (Cỉerodendrum philippinum var.
Symplex Wu et Fang hoặc Clerodendrum fragrans Vent.).[6][8]
Xét về mặt cấu trúc, các chất Coumarin đều có khung Benzo a - pvron
và đây cũng chính là chất Coumarin đơn giản nhất. Trong số 200 chất đã tìm
ra dựa trên đặc điểm về cấu trúc người ta phân ra làm 3 nhóm chính:
Coumarin đơn giản, Furanocoumarin, Pyrocoumarin. Coumarin đơn giản là
những chất chỉ có khung Benzo a - pyron và các nhóm thế gắn quanh khung,
còn Furanocoumarin là những chất có khung cơ bản Benzo a - pyron gắn
thêm khung furan [2][10]
Coumarin thưòíng là những chất dễ kết tinh không màu, nhiều chất trong
số chúng có thể thăng hoa được. Ngoài ra các hợp chất Coumarin có huỳnh
quang dưới ánh sáng tử ngoại, cường độ huỳnh quang phụ thuộc nhóm oxy
của phân tử Coumarin cũng như pH của dung dịch. Khả năng cho huỳnh
quang mạnh nhất là OH ở C-7. Trong phân tử có vòng lacton (este nội) nên
Coumarin dễ bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan trong nước, nếu acid
hoá sẽ đóng vòng lại. Người ta đã ứng dụng các tính chất trên trong định tính
dược liệu chứa Coumarin.
Vì có mùi thơm, nên nhóm hợp chất Coumarin ngoài các ứng dụng trong
y học chúng còn được dùng nhiều trong nghành mỹ phẩm, thực phẩm với vai
trò như chất định hương, tạo mùi thơm cho các sản phẩm. Ví như sản phẩm
Thanakha - công ty Shwebo Minthamee Co., Ltd - Myanmar (Burma), hay các
sản phẩm của hãng Nivea trong thành phần có thêm Coumarin. Theo nhiều
nghiên cứu thì một số Coumarin có khả năng gây ung thư, độc trên gan và
thận. Để đảm bảo sức khoẻ cho người sử dụng, từ giữa thế kỷ XX, nhiều nước
đã cấm lưu hành các sản phẩm chứa chất phụ là Coumarin.
Để thuận tiện cho việc theo dõi và tránh trùng lặp, chúng tôi trình bày
phần tổng quan tương ứng với từng vị dược liệu được nghiên cứu.
PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu
Trong khoá luận chúng tôi tiến hành nghiên cứu các mẫu dược liệu sau:
- Rễ của cây Bạch chỉ {Angelica dahurica (Fisch . ex Hoffm.) Benth . et
Hook.f.), họ Hoa tán (Apiaceae). Thu hái tại trung tâm nuôi trồng và chế biến
dược liệu-Viện Dược liệu.
- Phần trên mặt đất của cây cỏ nhọ nồi [Eclipta prostrata (L.) L.], họ
Cúc (Asteraceae). Thu hái tại Vườn thực vật ĐH Dược Hà Nội.
- Rễ của cây Đương quy di thực {Angelica acutỉloba (Sieb, et Zucc)
Kitagawa), họ Hoa tán (Apiaceae). Thu hái tại thị trấn Sapa tỉnh Lào Cai.
Và trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi cũng sử dụng các mẫu Đương
quy thu mua tại một số hiệu thuốc phố Lãn ông.
- Phần trên mặt đất của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.), họ
Cúc {Asteraceae). Thu hái tại Vườn thực vật ĐH Dược Hà Nội.
- Phần trên mặt đất của cây Mò mâm xôi (Clerodendrum philỉppinum
var. Symplex Wu et Fang), họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae). Thu hái tại Vườn
thực vật ĐH Dược Hà Nội.
- Phần trên mặt đất của cây Sài đất {Wedelia chinensis (Osbeck) Meư.),
họ Cúc (Asteraceae). Thu hái tại Vườn thực vật ĐH Dược Hà Nội.
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu
Xử lý và bảo quản mẫu
Mẫu dược liệu nghiên cứu có thể là dược liệu tươi hay dược liệu đã qua
chế biến, sau khi thu về được xử lý bằng phương pháp thích hợp, rồi cho vào
túi PE bảo quản ở nơi khô ráo.
Quan sát các đăc điểm hình thái ( Nghiên cứu cảm quan)
Dược liệu được quan sát bằng mắt thường về hình dạng, kích thước, màu
sắc và thể chất.
Với những dược liệu có cây tươi thì quan sát và mô tả đặc điểm.
- Chụp ảnh:
+ Cây; Có thể chụp toàn cây hoặc một bộ phận của cây hoặc một bộ
phận mang hoa hay quả bằng máy ảnh kỹ thuật số, các file ảnh đưa vào máy

tính.
+ Dược liệu: Chọn những dược liệu có những điểm đặc trưng, rõ ràng
đặt lên nền thích hợp, chụp ảnh và xử lý tương tự như phần ảnh của cây.
Nghiên cứu hiển vi [18]
* Vi phẫu :
Các bộ phận nghiên cứu nếu cần thiết có thể làm mềm bằng nước hoặc
hỗn hợp Cồn : Nước : Glycerin (1:1:1), tuỳ theo thể chất từng dược liệu.
- Chọn phần dược liệu có đầy đủ đặc điểm thực vật, lấy một số mẫu để
cắt tiêu bản nghiên cứu.
- Các tiêu bản được cắt bằng máv cắt mỏng cầm tay, tiến hành theo các
bước sau:
Cắt vỉ phẫu: Tiến hành cắt bằng dao có lưỡi mỏng và sắc.
Xử lý lát cắt: Các lát cắt được xử lý theo các bước sau:
• Tẩy sáng: Ngâm hoặc đun các lát cắt trong dung dịch cloramin 10%, để
khoảng 5 đến 10 phút, tính từ lúc sôi tuỳ từng trường hợp cụ thể.
+ Rửa bằng nước cất cho đến sạch cloramin.
+ Ngâm trong dung dịch clorai hydrat 75% khoảng 5-10 phút.
+ Rửa lại bằng nước sạch đến hết clorai hy drat 75%.
+ Ngâm trong dung dịch Acid acetic 10% trong 10 phút.
+ Rửa bằng nước sạch đến hết acid.
• Nhuộm mầu: Nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép thông thường với
đỏ son phèn và xanh methvlen.
+ Các lát cắt sau khi rửa hết acid được nhuộm bằng đỏ son phèn.
+ Rửa bằng nước cất đến khi nước không còn màu hồng.
+ Nhuộm lát cắt bằng xanh methylen.
+ Rửa lại nhiều lần bằng nước cất.
+ Thời gian nhuộm tuỳ theo tính chất bắt màu của các tổ chức.
• Loại nước: Vi phẫu cần phải được loại hết nước trước khi cố định, quá
trình này được tiến hành theo các bước sau:
+ Các lát cắt sau khi đã nhuộm được khử nước từ từ bằng cồn có độ cồn

tăng dần từ 10°, 20° ,30° 80°, 90*^ sau đó là cồn tuyệt đối.
+ Rửa lại bằng Xvlen nguvên chất 3 lần.
- Lên kính và cố định:
+ Nhỏ lên phiến kính một giọt Bôm Canada
+ Dùng bút lông lấy vi phẫu đặt vào giữa giọt Bôm trên phiến kính, sau
đó đậy lá kính lên.
+ Để tiêu bản ở nơi thoáng mát 1-2 tuần.
+ Tiêu bản đã được ổn định, đưa lên kính hiển vi quan sát, mô tả đặc
điểm giải phẫu.
- Chụp ảnh:
+ Vi phẫu: Sử dụng kính hiển vi có gắn máy ảnh kỹ thuật số để chuyển
hình ảnh từ kính hiển vi thành các file ảnh ở máy vi tính.
• Bột dược liệu:
- Nghiền bột; Dược liệu được làm khô tự nhiên, tiếp theo cho vào tủ sấy
dược liệu, sau đó nghiền thành bột. Quan sát bằng mắt thường màu sắc, nếm,
ngửi để nhận biết mùi vị của bột.
- Xác định màu sắc, mùi, vị bột dược liệu bằng cảm quan.
- Lên tiêu bản: Sử dụng các dung dịch lên kính khác nhau để làm tiêu
bản bột dược liệu, thường dùng nước hoặc dung dịch cloral hydrat 10%,
glycerin
- Quan sát các đặc điểm bột bằng kính hiển vi. Mô tả các đặc điểm đó.
- Chuyển các đặc điểm của bột trên kính hiển vi thành các file trên máy
vi tính.
Đinh tính
- Kiểm nghiệm các vị dược liệu theo chuyên luận trong Dược điển VNIII
(Với mỗi cây sẽ nêu rõ).
- Nghiên cứu về thành phần hoá học bằng phương pháp sắc kv lớp mỏng
hiệu năng cao (HPTLC): [4][17][22][23]
Nguyên tắc: sắc ký lófp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) dựa trên nguyên
tắc của sắc ký lớp mỏng thông thường nhưng được tiến hành trong những điều

kiện chuẩn nhất định. Bên cạnh đó, có sự hỗ trợ của máy móc và phần mềm vi
tính.
Tiến hành:
Quá trình chuán bi:
+ Chuẩn bị dịch chiết: cho một gam dược liệu vào một ống nghiệm to,
cho thêm lOml methanol. Để một thời gian. Lọc lấy dịch chấm sắc ký.
+ Hệ dung môi: dựa trên sự tham khảo các tài liệu tìm một số hệ dung
môi để thăm dò, khảo sát, từ đó tìm được hệ dung môi thích hợp đối với mỗi
dược liệu.
+ Bản mỏng: sử dụng bản sắc ký tráng sẵn silicagel GF254 (Merck)
hoạt hoá ở 110°c trong Ih.
Quá trình tiến hành:
+ Pha hệ dung môi.
+ Cho hệ dung môi chạy sắc ký vào bình, để dung môi bão hoà.
+ Chấm sắc ký: các vết dịch chiết dược liệu trên bản sắc ký được chấm
bằng máy chấm sắc ký CAMAG - Linomat 5.0 với phần mềm điều khiển
winCATS.
+ Khai triển dung môi chạy sắc ký.
+ Làm khô bản mỏng sắc ký bằng cách để dung môi tự bav hơi.
+ Pha và phun thuốc thử hiện màu.
+ Quan sát bản mỏng sắc ký dưới đèn tử ngoại (ở hai bước sóng tử
ngoại 254nm và 366nm), ánh sáng trắng (bản sắc ký sau khi phun thuốc thử
hiện màu vanilin trong ethanol).
+ Chụp ảnh các bản sắc ký: dùng phần mềm VideoScans để xử lý các
dữ liệu.
-Vi thăng hoa:[2][9][12]
Quá trình vi thăng hoa được tiến hành theo các bước sau:
Dung cu:
+ Bếp điện để tạo nguồn nhiệt, trên đặt lưới amian (có thể điều chỉnh
được nhiệt độ).

+ Một dụng cụ bằng kim loại có dạng hình trụ, có một đầu bịt kín, có
kích thước: chiều cao 2cm, đường kính 3,5cm.
Chuẩn bi nguyên liêu cho quá trình vi thăng hoa:
Các dược liệu làm khô ở nhiệt độ thấp khoảng 25°c (để tránh hiện tượng
thăng hoa của hoạt chất cần nghiên cứu).
Thưc hiên quá trình vi thăng hoa:
Lấy khoảng Ig nguyên liệu cho vào dụng cụ kim loại và đặt trên bếp
điện có lưới amian. Khi lượng nhiệt cung cấp đủ nóng (từ bếp điện) (Luôn chú
ý là phải để nhiệt độ bếp tăng dần, ban đầu luôn để phiến kính không che kín
dụng cụ kim loại), phiến kính có bông tẩm nước lạnh được đặt lên dụng cụ
thăng hoa và cứ khoảng 2-3 phút lần lượt thay phiến kính khác. Tổng cộng
cho 1 lần thí nghiệm từ 8-10 tiêu bản. Quá trình được dừng lại khi trên phiến
kính không có các vết mờ (do tinh thể bám vào).
Quan sát trên kính hiển vi:
Trong quá trình thí nghiệm sử dụng kính hiển vi độ phóng đại khoảng 90
lần. Quan sát tinh thể, nhận xét hình dạng tinh thể, phát hiện tinh thể có dạng
đặc trưng (nếu có), bằng cách dùng phản ứng tạo iodo coumarin có mầu nâu
hoặc tím, dung dịch thử là I + KI.
Chup ảnh tinh thể:
Tinh thể sau khi vi thăng hoa dược chụp ảnh dưới kính hiển vi có gắn
máy ảnh kĩ thuật số. Sau đó chuyển các hình ảnh tinh thể Coumarin thành các
file trên máy tính.
2.2 Kết quả thực nghiệm
2.2.1 Bạch chỉ
Tổng quan
Dược liệu là rễ phơi hay sấy khô của cây Bạch chỉ [Angelica dahurica
(Fisch, ex Hoffm) Benth. et Hook.f. hoặc Angelica dahurica (Fisch, ex
Hoffm.) Benth. et Hook.f. wai. formosana (Boiss.) Shan et Yuan], họ Hoa tán
(Apiaceae).[l]
Bạch chỉ được nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam sau năm 1960. Lúc

đầu, trồng thử ở Sapa, sau chuyển dần xuống Tam Đảo và ngoại thành Hà Nội
(các cây thuốc ở Viện Dược liệu) đều thấy cây sinh trưởng và phát triển tốt.
Hiện nay, Bạch chỉ đã được trồng phổ biến ở những tỉnh miền trung du cũng
như đồng bằng ở miền Bắc.[21]
Thành phần hoá học: ngoài tinh dầu trong rễ củ còn có các dẫn chất
coumarin đã được biết như Byak-angelicin, Byak-angelicol, Oxypeucedamin,
Imperatorin, Isoimperatorin, Scopoletin [21][7]
Bạch chỉ có tác dụng hạ sốt, giảm đau dùng trong điều trị cảm cúm, sốt
xuất huyết, đau nhức đầu, đau răng, đau kinh, còn dùng chữa đau khớp xương,
mụn nhọt mưng mủ, vết thương do bỏng. [3][5]
*Yêu cầu kiểm nghiệm:
Dược điển Việt Nam III có chuyên luận Bạch chỉ với các tiêu chuẩn kiểm
nghiệm: Đặc điểm dược liệu, đặc điểm hiển vi, các phản ứng định tính và sắc
ký lớp mỏng so với mẫu chuẩn
Cây dùng thay thế: ở nước ta, không có cây Bạch chỉ mọc hoang. Các
thầy thuốc y học cổ truyền và nhân dân ở nhiều nơi đã dùng rễ cây M
át rừng (Miỉlettia pulchra Kurz, họ Đậu - Fabaceae) còn gọi là Đậu dự,
cây Nếnh để thay với tên Bạch chỉ nam [21]. Để giả mạo Bạch chỉ ở Trung
quốc người ta dùng rễ của một số cây trong họ Cần như: Heracleum
scabridum Franch; Seseli mairei Wolff.[19]
Kết quả thưc nghỉèm
- Mô tả cây:
Cây cỏ, cao 0,5-1 m, sống lâu năm, thân hình trụ, rỗng, không phân
nhánh. Lá to, có cuống, phần dưới phát triển thành bẹ ôm lấy thân, phiến lá xẻ
2-3 lần lông chim, mép khía răng, có lông ở gân lá mặt trên. Cụm hoa tán
kép, mọc ở ngọn, hoa nhỏ màu trắng. Quả bế, dẹt, toàn thân câỵ có mùi thơm
(Ảnh la).
- Mô tả dược liệu:
Rễ nguyên, ít khi phân nhánh, thẳng hoặc hơi cong, đầu trên mang vết
tích của cổ rễ, đầu dưới nhỏ dần, mặt ngoài màu vàng nhạt, có nhiều nếp nhăn

dọc, có dấu vết của rễ con và nhiều chỗ sần sùi nhô lên. Thể chất cứng chắc
khó bẻ. Dươc liêu có mùi thơm.
- Đặc điểm bột dược liệu:
Bột màu trắng ngà, mùi thơm hắc, vị cay hơi đắng. Soi trên kính hiển vi
thấy nhiều hạt tinh bột hình tròn hay hình khối, nằm riêng lẻ hay tập trung
thành đám, các mảnh mạch mạng hoặc mạch vạch.
- Đặc điểm vi phẫu:
Mặt cắt ngang rễ tròn. Từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm những tế bào
hình chữ nhật xếp thành các vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm. Mô mềm vỏ
được cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, có các khuyết, nhiều ống tiết to
nằm rải rác trong mô mềm và cả trong vùng libe. Libe tạo thành các bó sít
nhau. Tầng phát sinh libe-gỗ tạo thành vòng rất rõ. Các mạch gỗ lófn tập trung
thành dãy hướng tâm trong mô mềm gỗ không hoá gỗ. Tia tuỷ rộng gồm 5-10
dãy tế bào.
Các đặc điểm vi phẫu, bột của Bạch chỉ về cơ bản không có gì khác so
với các hình ảnh trong cuốn sách “Kiểm nghiệm Dược liệu bằng phương pháp
hiển vi”.[19]
- Định tính:
*> Các phản ứng hoá học:[l]
A. Lấy 5g bột dược liệu, thêm 50ml ethanol (TT), lắc đều, đun cách thuỷ
5 phút. Lọc, cô dịch còn khoảng lOml (dung dich A).
Lấy 1 ống nghiệm, cho vào Iml dung dịch A, thêm Iml dung dịch
Natri carbonat 10% (TT) hay Natri hydroxyl 10% (TT) và 3ml nước cất, đun
cách thuỷ 3 phút, để thật nguội, cho từ từ từng giọt thuốc thử Diazo (TT)
Kết quả: Dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu đỏ cam.
B. Lấv 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 3ml nước, lắc đều
trong 3 phút, lọc, nhỏ 2 giọt dịch lọc vào tờ giấy lọc, để khô, quan sát dưới
ánh sáng tử ngoại (365nm).
Kết quả: Phần giấy lọc nhỏ dịch chiết thấy có huỳnh quang màu xanh da trời.
C. Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 3ml ether, lắc 5 phút, để

yên 20 phút. Lấy Iml dịch ether, thêm 2-3 giọt dung dịch hydroxylamin
hydroclorid 7% trong methanol và 2-3 giọt dung dịch kali hydroxyd 20%
trong methanol. Lắc kỹ, đun nhẹ trên cách thuỷ, để nguội điều chỉnh pH 3-4
bằng acid hydrochloric loãng (TT). Sau đó thêm 1-2 giọt duns dịch Sắt(III)
clorid 1% trong ethanol (TT).
Kết quả: dung dịch xuất hiện màu nâu nhạt.
♦♦♦ Sắc kv lớp mỏng:
Các mẫu Bạch chỉ được chiết bằng dung môi ethanol sau đó triển khai
bằng hệ dung môi Benzen-ethyl acetate (9 : 1)[1]. Dung dịch thử và dung dịch
đối chiếu cho các vết trên sắc ký đồ tương tự nhau. Đồng thời chúng tôi cũng
chiết các chất trong mẫu Bạch chỉ bằng dung môi methanol, sau đó triển khai
ở hai hệ dung môi:
Hệ 1: Ethylacetat - Toluen - Acidformic (5:6:1).
Hệ 2: Benzen - Ethỵlacetat (95 : 5).
Kết quả sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết Bạch chỉ trong
methanol sẽ trình bày trang sau (Hình 1.1-6).
Nhân xét: Qua kết quả sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết Bạch chỉ
trong methanol cho thấy ở điều kiện thí nghiệm, các bản sắc ký triển khai
trong hai hệ dung môi khác nhau nhưng số lượng vết trên sắc ký đồ quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm là như nhau
❖ Vi thăng hoa:
Tinh thể Coumarin trong Bạch chỉ có hình khối (Ảnh Ib). Khi nhỏ một
giọt dung dịch I + KI lên phiến kính có tinh thể, quan sát trên kính hiển vi
thấy các tinh thể chuyển sang màu tím.
Nhân xét
Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy các mẫu dược liệu Bạch chỉ trên thị
trưòỉng thường ít có nhầm lẫn, giả mạo. Tuy nhiên, giữa các mẫu được trồng ở
các điều kiện khác nhau có sự khác nhau không nhiều; như với mẫu Bạch chỉ
trồng vùng đồng bằng thường có lõi giữa rễ và giảm độ thơm, lượng tinh bột ít
hơn so với Bạch chỉ trồng vùng núi. Do vậy nên trồng Bạch chỉ theo một quy

trình thích hợp.
Phản ứng định tính Coumarin bằng cách tạo phức màu tím đỏ, trên thực
tế chỉ thu được phức màu nâu nhạt. Điều này do nhiều nguyên nhân khác
nhau, có thể do trong dịch chiết Bạch chỉ trong ether có lẫn nhiều chất khác
không chỉ có Coumarin. Riêng với quá trình vi thăng hoa trên phiến kính thu
tinh thể Coumarin ở dược liệu Bạch chỉ khó thực hiện, vì trong Bạch chỉ hàm
lượng tinh dầu rất cao, khi vi thăng hoa ở nhiệt độ cao Coumarin và tinh dầu
cùng bay hơi. Coumarin dễ tan trong tinh dầu nên rất khó thấy tinh thể.
'■

r ^ - - A .
' X^ềềM
Track 3
«ICV-
Track 3
Anh lb; Tinh thể coumarin của
Bạch chỉ
Ảnh la: Cây Bạch chỉ
Peak sta rt
Rf
O.ỮOO
D-039
0.284
0.352
0.434
0.fm
D D
p ử
2m^
205 9

DO
314.5
0.7111 302.7
F1
Ữ.022
Ử.05Ộ
Ử.306
D.374
D.4?'
D.621
D.733
M s x.
H
245.6
393 .ộ
455.2
2165.8
1473
4.93
10.69
7.92
Q.15
43.54
9 04
Er.d
Rrf
0.036
Ũ.Ũ6§
0.342
D.40$

0.4^3
Ủ.7Ủ1
D 74C»
21.6
SS.7
1$17
2S.0
2327,
295.1
415.5
5506.3
16§1.D
9^34,0
6Ù6ÍÍ,3
65D9.2
Ộ9843.1
4Ã54.6
5-28
1.61
5.82
6.24
íiộ.97
4.65
Subst
Name
Total Height 4ở74.ti4 Total A-ea ; 1042ỷ:5
/ \
*
A /
Á,

' \
T rac k 3
P eak Start
M b x .
End
Subsì
# F!f H
Rí
H
p.y
Rf H A
p/o]
Nam e
1
Ủ.ŨOO ữ.ũ 0.029
ÍÌỮ73.ÍÌ
23.03 0 095 2216.5 160513.3 24.03
7
Ũ.cm 22 lộ 5 Ử.1ŨỬ
252i:.6 0 14Ủ 254.7 25491.5 5.Ỉ2
3
Ü.314
55S.5 ữ.3;::s 1659.7 6.29
Ũ 35Ủ 114ỹ.7 Iỹ2ỹ5.5 2 M
4
Ử.35Ù
1149.7
ủ.3:56
2053.1 7.7Ổ ủ 393 191ÍÌ.S 28422.5 4.26
Ù.514

1113.1 ủ 56ìỊ ỉiỉũủl.ỹ 22.75 Ü 595
4576 4
l;m ì21 4
20 m
fi
ù.^m
457ÍÌ.4 ù.64;i
$Í6 0 2
31 32 0 736 9§7.3 m)4ũ.ũ
44 lý
Total Height 26377 1 Total .iifea 667383
Hình 1.2: Kết quả sắc ký dịch chiết Bạch chỉ trong methanol
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm
•T.rsck 3
. ICO.
Traok 3
oo


1" "
o 1
.
^

ĩ

.
0_2:
.
'T

o.ị
ì ' 1
0.” 0.
1 * T ^ T ^ 1 ^
P eak
lart M a x
.
End are
a
Subst
Rf H Rf
H pvbl Rf H
A
p-o] Ns rne
1
0 DOỮ
Ü Û
0 027 1836.6
20 Ỡ1
0 D4Ô
10
^ s 18695.9 12 18
2
0.196 35.3 ữ 222
376.7 4.27 0 .239 2 10.4 3873$ 2.52
3
ũ 23Q
210 4 ừ 251 272 1 3 OS
0 268 137 6 2711 >ị 1 77
4

D 268 137 6 0 2Ô7
279.1 3 16 0 .302 167 4
2Ỡ77 7
1 .87
5
D.343 S8.7
ữ 391 402.1
4.56 Û .415 16Û.0 8011 .0 5.22
6
0.570
270.5 Ữ.626
2353 .ỡ
26.67 0 .655 1367.1 49966.9
32.54
7
Û 662 1362.9
0 676 1515 2
17.17 0 .727
869.2
33672.4
21 86
8
0 727 859.2 ữ 749
980.4 1111 ủ .778 697.s
18233.4 11 .87
9
0.77$ 697.8 D.SOD sto 1 9.18
0 .845
127.8
15609.4 10.17

Total Heiqht 8826 36
Total /Vea : 153552
T ra c k 9
P e a k
S tart
M a x
E n d
a re
3
S u b s i
ìi^
F:f H
Rf
H
F^f H
A N a m e
1
Ù.D45 0.0
Ử.D71
277.7
11 22
Ù 106 3.Ộ
27S3.Ỗ
9.35
2 D.21Ỡ 60 6
o .it í l
127S.4
íi t 6t5 ữ .30Ừ
82.3 1626S.7 54.67
3

0.3ỬỮ §2.3 0.339
91í5 9
:57.K:
0 59Ù Í.5
1Ũ7DS.Ủ 3 5 .ỹ§
Total Height 2475 0^ Total .¿v-ea ; 297Ộ0.5
Hình 1.4: Kết quả sắc ký dịch chiết Bạch chỉ trong methanol
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm
T rack 3
Hệ 2
Track 9
F‘i5;3 k
Start
M-b x .
E
r,d
a re a
Sub=:t
Frf H
H
m
Rf H
VA.
p/o]
f4am e
1
Ữ.042
0.0
ũ ;ũ í:2 1 1133.2
S.54

o .i ứ í ;
276.5
11541.9
6.42
2 0 1 Dí ;
276.3
D.124
14Í7.2 10,9$
0.157
22,4
131ỹ4.6
7.33
3
ù .V iỉ
D.o 0.216
1495.4
11.26
0 239 542.0
14150-6
7.$7
4
0.23i? 542.0
D.304
47S9.5
36.D7
0.330 3523.1
90372.6
5li.2:3
5
0.330

352:5.1
ũ.:::4íi 3ộ4ỹ.í
2Ỡ.75
0.3:?íỊ
47819.0 26.58
6
Ũ,4í:i4 26.7
0.4Ỡ? 451.7
3 4Ứ
o.íiủủ 425.6
2 8 2 5 $ 1.57
Total Height 13276.4 Total A-ea : 1799Df.
• ICO-
T ra c k 9
P e a k SI
a rt
fvl3X.
E n d
a re
:3
Sub:=:t
Frf
H
F1
H
H
A
Na m e
1
D 052 D.ũ ũ D$6

144ti,4
35 74
Ũ. 104
6.9 IS 137 í
55.Ù5
‘V
ũ. 162
Ủ.D Ù,19D
13.22
Ũ.231
7.3
ộ;;í 61.6
12.2ỹ
-•
ũ.234
0.0
ù.2m
279.2 6.90 0.290
27 7.:5
2441.6
4.72
4
0.29Ù
277.S 0.310
4211I
lù 4Ĩ»
Ũ.341 137,7
4CiS4,0
9 05
íf.

0 :H1
13? 7 Ữ.359
í 97.2
4.S7 D.37ỹ
120.f.
17CI1.9
3.29
6
D.379
120,í.
Ữ.4Ữ7
30Ũ.9 7.44
Ữ.452
20.9
-3491.5
6.75
7
Ũ, 5 79
19 7 Ũ.624
3 5 0 7
$.67
o.mti
90.3
4ĩỉm.5 9 -CI
s
Ù.mo 95.3
ù.7m
516.7
1277
Ũ.810 110.5

1Ủ061.3
19,44
Total Height 4CỈ47.18 Total Av:3 : 51 746.Ở
ílình 1.6: Kết quả sắc ký dịch chiết Bạch chỉ trong methanol
quan sát dưới ánh sáng trắng khi hiện màu
2.2.2 Cỏ nhọ nồi
Tổng quan
Theo Dược điển VN III, dược liệu là toàn bộ phần trên mặt đất đã phơi
hay sấy khô của cây cỏ nhọ nồi [Eclỉpta prostrata (L.) L.], họ Cúc
(Asteraceae).
Chi Ecỉipta.L. chỉ có một loài là cây Nhọ nồi mọc tập trung nhiều ở hầu
hết các nước vùng Nam hoặc Đông Nam Châu Á. ở Việt Nam, Nhọ nồi phân
bố rộng rãi ở khắp các vùng đồng bằng, trung du và miền núi.[21]
Nhọ nồi chứa các dẫn chất Thiophen, coumarin (Wedelolacton),
Stigmasterol Ngoài ra còn có một số glycosid, tanin, tinh dầu, chất đắng và
một lượng nhỏ các alcaloid như nicotin 0,078% (theo khối lượng khô)
ecliptin [21]
Cỏ nhọ nồi có tác dụng bổ thận, mạnh xương, đen tóc, mát huyết, cầm
máu, giải độc. VỊ thuốc Nhọ nồi thường được dùng là thuốc bổ máu, cầm
máu, bên trong và bên ngoài, chữa ho ra máu, lỵ ra máu, rong kinh, băng
huyết, chảy máu cam, trị ra máu. Ngoài ra còn dùng chữa ban sởi, ho, hen,
viêm họng, lao phổi, di mộng tinh, bệnh nấm ở da, làm thuốc mọc tóc và
nhuộm tóc. [5][14][16]
*Yêu cầu kiểm nghiệm:
Dược điển Việt Nam III có yêu cầu kiểm nghiệm cỏ nhọ nồi theo các
tiêu chuẩn: đặc điểm thực vật, đặc điểm hiển vi, các phản ứng định tính
Kết quả thưc nghiêm
- Mô tả cây:
Cây thảo, thân hình trụ, màu lục hoặc đỏ tía,dài khoảng 30-50cm, có
lông cứng. Lá nguyên hình mũi mác, mọc đối, gần như không cuống, mép có

khía răng cưa và có lông cứng cả hai mặt. Cụm hoa hình đầu, màu trắng, mọc
ở kẽ lá hay ngọn cành. Đầu mang hai loại hoa: hoa cái hình lưỡi nhỏ ở ngoài,
hoa lưỡng tính hình ống ở trong. Quả bế hình trái xoan (Ảnh 2a).
- Mô tả dược liệu:
Dược liệu là toàn bộ phần trên mặt đất đã phơi hav sấy khô, có màu xanh
đen (Ảnh 2b).
- Đặc điểm bột dược liệu:
Bột màu lục xám, không có mùi vỊ gì đặc biệt. Soi trên kính hiển vi thấy:
Mảnh biểu bì phiến lá thường mang lông che chở đa bào và lỗ khí; lông che
chở có thành dày, mặt ngoài xù xì. Mảnh mạch vạch, mạch xoắn. Sợi có thành
hơi dày. Hạt phấn hoa hình cầu gai, màu vàng nhạt. Đôi khi thấy những mảnh
cánh hoa gồm những tế bào thành mỏng, lông tiết chân đơn bào đầu đa bào.
- Đặc điểm vi phẫu:
Vi phẫu thân: Mặt cắt thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì có
lông che chở đa bào, có 2-3 hàng tế bào mô dày có thành dày ở góc. Bên trong
là mô mềm vỏ gồm các tế bào có thành mỏng. Trong mô mềm vỏ có các mô
khuyết lớn. Đám mô cứng có tế bào hình đa giác, thành hoá cellulose. Trụ
giữa gồm nhiều đám libe-gỗ xếp rời nhau, mô mềm ruột gồm các tế bào hình
tròn hay đa giác, thành mỏng, càng vào trong tế bào càng lớn.
Vi phẫu lá:
Phần gân lá: Mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi. Biểu bì trên và biểu bì dưới
gồm một hàng tế bào hình trứng. Tế bào biểu bì trên nhỏ hcfn tế bào biểu bì
dưới. Biểu bì có lông che chở đa bào, thành dày, mặt ngoài xù xì. Dưới biểu bì
là mô dày gồm 2-3 hàng tế bào thành dày ở góc. Mô mềm gồm các tế bào
hình trứng, thành mỏng, ở giữa gân có 3-7 bó libe-gỗ xếp thành hình vòng
cung, bó libe-gỗ ở giữa to nhất. Libe gồm các tế bào hình đa giác nhỏ, kích
thước không đều nhau. Gỗ có mạch gỗ xếp thành hàng.(Ảnh 2c)
Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm một dãy tế bào mang
lông che chở. Biểu bì dưới có lỗ khí. Mô giậu gồm 1 hàng tế bào hình chữ
nhật, thành mỏng, chiếm khoảng 1/3 bề dày phiến lá. Mô khuyết (Ảnh 2d).

Các đặc điểm vi phẫu thân, bột của cỏ nhọ nồi về cơ bản không có gì
khác so với các hình ảnh trong cuốn sách “Kiểm nghiệm Dược liệu bằng
phương pháp hiển vi “.[19]
- Định tính:
Phản ứng hoá học:[l]
Lấy khoảng Ig bột dược liệu, thêm 5ml ether. Ngâm 10 phút thỉnh
thoảng lắc, lọc. Lấy Iml dịch lọc trên cho vào một ống nghiệm, thêm 10 giọt
dung dịch acid acetic (TT). Sau đó thêm từ từ 15 giọt dung dịch acid sulfuric
đậm đặc (TT) theo thành ống nghiệm.
Kết quả: Nơi giáp ranh giữa 2 lớp chất lỏng có đỏ nâu nhạt, đồng thời lớp
ether chuvển sang màu xanh da trời.
*> Sắc ký lớp mỏng:
Trong chuyên luận cỏ nhọ nồi của Dược điển Việt Nam III không có tiêu
chuẩn về sắc ký lớp mỏng, để góp phần bổ sung tư liệu tham khảo, chúng tôi
tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với:
+ Dịch chấm sắc ký: dịch chiết cỏ nhọ nồi trong methanol.
+ Hệ dung môi triển khai: Benzen-Aceton (9 : 1).
Kết quả sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dịch chiết cỏ nhọ nồi trong
methanol sẽ trình bày ở những trang sau (Hình 2.1-3).
*1* Vi thăng hoa:
Các tinh thể có hình khối nằm riêng lẻ, không màu (Ảnh 2e). Khi nhỏ
một giọt dung dịch I + KI lên phiến kính có tinh thể, thấy các tinh thể chuyển
sang màu nâu .