tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy bacillus sp. sv1 sinh protease kiềm tính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC





TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
BACILLUS sp. SV1 SINH PROTEASE
KIỀM TÍNH




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ts. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN HOÀNG VŨ
MSSV: 3092561
LỚP: CNSHTT K35



Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)



Dương Thị Hương Giang Nguyễn Hoàng Vũ


DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
TRƯỞNG BỘ MÔN
(ký tên)

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nổ lực, cố gắng không ngừng
của bản thân. Tôi còn nhận được sự quan tâm chân thành từ gia đình, thầy cô, bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Thị Hương
Giang đã tận tình giúp đỡ và góp ý trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn tới các thầy, cô, các anh chị quản lý trong các phòng thí nghiệm đã
tạo điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất.
Cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ và
hướng dẫn những kiến thức cơ bản trong phòng thí nghiệm
Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ
và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình tôi đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi
có thể hoàn thành luận văn tốt nhất.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn và trân trọng.

Cần Thơ, ngày 4 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Hoàng Vũ


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Protease kiềm tính từ vi khuẩn là nguồn enzyme có giá trị cao trong công nghệ
enzyme. Quá trình phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng sinh protease kiềm tính ở
phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần
Thơ đã xác định được dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 là dòng có tiềm năng sinh tổng
hợp protease kiềm tính. Kết quả tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích tăng
sản lượng protease kiềm tính ngoại bào của dòng vi khuẩn này cho thấy với lượng vi

khuẩn chủng vào môi trường là 1ml vi khuẩn (10
9
CFU/ml) trong 30ml môi trường
nuôi cấy, nguồn nitơ là yeast extract với nồng độ 1,0%, nguồn carbon là glucose nồng
độ 1,0%. ở pH 8,3, nhiệt độ 35
o
C trong 48 giờ thì dòng Bacillus sp. SV1 sinh hoạt tính
protease cao nhất là 1,596 U/ml.
Từ khóa: Bacillus sp. SV1, nguồn carbon, nguồn nitơ, protease kiềm tính.



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về enzyme protease 2
2.1.1. Giới thiệu chung về protease 2
2.1.2. Protease kiềm tính 4
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus. 5

2.2.1. Vi khuẩn Bacillus. 5
2.2.2. Đặc điểm protease kiềm tính của Bacillus sp. 5
2.3. Ứng dụng của protease kiềm tính 8
2.3.1. Công nghiệp thực phẩm 8
2.3.2. Công nghiệp thuộc da 8
2.3.3. Công nghiệp dược 8
2.3.4. Công nghiệp chất tẩy rửa 9
2.4 Các phương pháp định lượng và xác định hoạt tính của protease 9
2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976). 9
2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947) 9
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 9
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1. Phương tiện nghiên cứu 11
3.1.1. Dụng cụ thiết bị 11
3.1.2. Nguyên vật liệu 11
3.1.3. Hóa chất 11
3.2. Phương pháp nghiên cứu 11
3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn
Bacillus sp. SV1. 11
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 12
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 13
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh

protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 13
3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê 15
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sản sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 16
4.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1 17
4.3. Ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1 18
4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh protease kiềm tính
Bacillus sp. SV1. 18
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1
19
4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus
sp. SV1. 20
4.3.4. Ảnh hưởng tương tác giữa các nhân tố nhiệt độ và pH lên khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 21

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24
5.1. Kết luận 24
5.2. Đề nghị 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
PHỤ LỤC: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Phụ lục

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Một số các protease kiềm tính được sản xuất theo qui mô công nghiệp bởi
Bacillus sp 5
Bảng 2. Trọng lượng của các phân tử protease kiềm tính tổng hợp bởi các dòng
Bacillus sp 7
Bảng 3. Điểm đẳng điện pI của các protease chịu kiềm được sản xuất bởi các dòng
Bacillus sp 8
Bảng 4. Thành phần môi trường Horikoshi-I (pH 9.0) 12
Bảng 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ. 12
Bảng 8. Kết quả OD đường chuẩn Tyrosine Phụ lục
Bảng 9. Ảnh hưởng của cơ chất nguồn nitơ và nồng độ lên khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 10. Ảnh hưởng của cơ chất nguồn carbon và nồng độ lên khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 11. Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus
sp. SV1. Phụ lục
Bảng 12. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp.
SV1 Phụ lục
Bảng 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus
sp. SV1. Phụ lục
Bảng 14. Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 15. Hoạt tính của protease trong môi trường Horikoshi-I. Phụ lục
Bảng 16. Hoạt tính của protease theo nguồn nitơ và nồng độ Phụ lục
Bảng 17. Hoạt tính của protease kiềm tính theo nguồn carbon và nồng độ. Phụ lục
Bảng 18. Hoạt tính của protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy. Phụ lục
Bảng 19. Hoạt tính của protease kiềm tính theo pH Phụ lục

Bảng 20. Hoạt tính của protease kiềm tính theo nhiệt độ. Phụ lục
Bảng 21. Hoạt tính protease kiềm tính theo sự tương tác giữa pH và nhiệt độ Phụ lục

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH


Hình 1. Cơ chế phản ứng của serine proteases 3
Hình 2. Cơ chế phản ứng của cystein proteases 3
Hình 3. Cơ chế phản ứng của aspartic proteases 4
Hình 4. Cơ chế phản ứng của zinc proteases 4
Hình 5. Biểu đồ hoạt tính protease của chủng Bacillus sp. SV1 theo nồng độ và nguồn
Nitơ. 16
Hình 6. Biểu đồ hoạt tính protease với nguồn carbon và nồng độ khác nhau của dòng
Bacillus sp. SV1. 17
Hình 7. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh protease kiềm tính
của Bacillus sp. SV1 19
Hình 8. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của
Bacillus sp. SV1 20
Hình 9. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm tính
của Bacillus sp. SV1. 21
Hình 10. Hoạt tính protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1 theo nhiệt độ và pH môi
trường. 22
Hình 11. Biểu đồ đường chuẩn BSA. Phụ lục
Hình 12. Biểu đồ đường chuẩn Tyrosine. Phụ lục

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU Colony-forming unit
EDTA Ethylendiaminetetraacetic acid
pI Isoelectric point
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme đã được sử dụng trong sản xuất và đời sống từ lâu, tuy nhiên việc nâng
cao chất lượng sản phẩm enzyme và giảm chi phí sản xuất là vấn đề mà các nhà khoa
học đang chú tâm. Enzyme là chất xúc tác sinh học không thể thiếu trong quá trình
trao đổi chất của sinh vật. Enzyme tinh sạch hay enzyme thô được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, thuộc da, công nghiệp chất tẩy rửa, trong y
dược học, trong kỹ thuật phân tích xét nghiệm, trong sinh học phân tử, xử lý chất thải
v.v
Protease đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ enzyme, protease được
sử dụng rộng rãi, chiếm hơn 60% tổng sản lượng enzyme sản xuất trên thế giới
(Kalisz, 1998; Beg et al., 2003; Ellaiah et al, 2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về
protease ở nước ta nhưng về protease kiềm tính vẫn còn khá ít. Phần lớn các protease
hoạt động ở một dãy pH hẹp, chủ yếu ở pH acid và trung tính nhiều hơn. Riêng
protease kiềm tính hoạt động trong phổ pH rộng và hoạt tính khá bền ở nhiệt độ cao
cho thấy ưu việt của nhóm enzyme này.
Các enzyme của vi khuẩn Bacillus có nhiều lợi ích về mặt sản xuất với quy mô
lớn. Ngoài ra, ứng dụng vi khuẩn này trong việc sản xuất protease kiềm tính có lợi thế

hơn về mặt phát triển cạnh tranh so với các vi sinh vật khác, do vi khuẩn Bacillus có
khả năng thích ứng với sự biến đổi của môi trường và vẫn phát triển khi môi trường
không thuận lợi (Hirokoshi, 2011).
Một dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 sinh protease đã được phân lập, định danh
và khảo sát hoạt tính protease trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, thuộc Viện
NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ, tuy nghiên dòng này cần phải được
tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính của
dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 vừa được phân lập ở phòng thí nghiệm Công nghệ
Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về enzyme protease
2.1.1. Giới thiệu chung về protease
Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong phân tử
protein để giải phóng các acid amin, pepton hoặc di-, tripepton. Các nhóm protease
khác nhau sẽ cắt những liên kết peptide đặc trưng khác nhau. Pepsin, trypsin,
bromelain, papain, chymotrypsin, và subtilisin là các loại protease phổ biến trong công
nghiệp sản xuất enzyme.
Protease cần thiết cho đời sống của các sinh vật vì khả năng thủy phân protein
cung cấp các acid amin cần thiết cho sự phát triển của sinh vật. Enzyme này rất đa
dạng về chức năng từ mức độ bào quan, tế bào, cơ quan tới toàn bộ cơ thể sinh vật và
được phân bố rộng rãi trên các đối tượng từ vi sinh vật tới thực vật và động vật. So với
động vật và thực vật, protease vi sinh vật rất đa dạng, cùng một loại protease nhưng ở
các vi sinh vật khác nhau lại khác nhau về các đặc điểm hóa lý như tính chịu kiềm,

chịu nhiệt…
Phân loại protease
- Protease được phân làm hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
- Dựa vào phản ứng với mạch polypeptide, exopeptidase được chia làm hai
loại:
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu mút C của
chuỗi poly peptide và giải phóng tuần tự từng acid amin hay từng dipeptide.
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hay tripeptide.
- Dựa vào động học của phản ứng xúc tác, endopeptidase được chia làm 4
nhóm:
+ Serine proteases: là những enzyme có chứa nhóm –OH của serine trong
trung tâm hoạt động của enzyme và có vai trò đặc biệt trong phản ứng xúc tác của
enzyme. Nhóm này chia thành hai nhóm nhỏ hơn là chypmotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin có ở động vật như trypsin, elastase. Nhóm subtilisin gồm hai loại
protease kiềm tính từ vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN’. Các serine

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
protease hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng.

Hình 1. Cơ chế phản ứng của serine proteases
(Nguồn:
19/11/2013)
+ Cysteine proteases: bao gồm các protease có chứa –SH trong trung tâm
hoạt động. Các cysteine protease gồm papain, bromelin và các enzyme của kí sinh
trùng. Các enzyme này hoạt động ở vùng pH trung tính.

Hình 2. Cơ chế phản ứng của cystein proteases
(Nguồn:
19/11/2013)
+ Aspartic proteases: các protease nhóm này thuộc nhóm pepsin bao gồm
các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin.




Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 3. Cơ chế phản ứng của aspartic proteases
(Nguồn:
19/11/2013)
+ Zinc proteases: còn được gọi là matalloprotease, là nhóm được tìm thấy
nhiều ở vi khuẩn, nấm mốc. Các zinc protease thường hoạt động ở pH trung tính và
hoạt tính giảm mạnh nếu có sự xuất hiện của EDTA.

Hình 4. Cơ chế phản ứng của zinc proteases
(Nguồn: ngày
19/11/2013)
- Ngoài ra, protease còn được phân loại theo cách đơn giản hơn gồm 3 nhóm:
+ Nhóm protease acid: pH 2 – 4.
+ Nhóm protease trung tính: pH 7 – 8.
+ Nhóm protease kiềm tính: pH 9 – 11.
2.1.2. Protease kiềm tính
Protease kiềm tính (EC.3.4.21-24, 99) hoạt động trong phổ pH từ trung tính tới
kiềm. Những enzyme này thường thuộc 2 nhóm là metalloprotase và serine protease.

Hiện nay, vi khuẩn là một nguồn cung cấp protease chính vì sự vượt trội trong sản sinh
và tốc độ xúc tác so với các protease từ nấm và các loại vi sinh vật khác. Đa số các
protease thương mại được sản xuất hiện nay, đều được sản xuất từ các chủng Bacillus
sp.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus.
2.2.1. Vi khuẩn Bacillus.
Nhóm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp trong việc sản xuất
protease và đặc biệt là một nhóm chính có tính kinh tế cao được sử dụng để sản xuất
protease kiềm tính thương mại. Môi trường sống của Bacillus sp. rất rộng rãi, nhiều
nhất là trong đất và nước. Các vi khuẩn Bacillus sp. sản xuất ra protease kiềm tính đặc
biệt còn sống trong môi trường acid. Nghiên cứu về Bacillus sp. cho thấy, khi Bacillus
sống chung với môi trường với Aperillus oryzae ở môi trường trung tính. Bacillus sp.
có khả năng thay đổi pH môi trường sang kiềm tính có lợi và chiếm ưu thế hơn
(Horikoshi, 2011). Bacillus sp. là những sinh vật hiếu khí, thường có dạng hình que,
gram dương, có khả năng tạo thành bào tử khi điều kiện sống trở nên bất lợi vì thế nó
tồn tại dưới nhiều điều kiện về nhiệt độ và pH khắc nghiệt.
Bảng 1. Một số các protease kiềm tính được sản xuất theo qui mô công
nghiệp bởi Bacillus sp.
Loài
pH tối ưu
Ứng dụng trong công nghiệp
Bacillus stearothermophilus
9.5
Công nghiệp chất tẩy, bột giặc
Bacillus sp. Y. (BYA)
10.0 – 12.5

Công nghiệp chất tẩy
Bacillus sp. (AH-101)
12.0 – 13.0
Công nghiệp thuộc da
Bacillus firmus
8.0
Công nghiệp chất tẩy
Bacillus sp. (Savinase/Durazym)
9.0 – 11.0
Công nghiệp chất tẩy
Bacillus licheniformis (Alcalase)
8.2
Sinh tổng hợp các peptide hoạt động
Bacillus subtilis
8.5
Tác nhân chất trong công nghiệp thuộc da
(*Nguồn: Anwar et al., 1998)
2.2.2. Đặc điểm protease kiềm tính của Bacillus sp.
- pH tối ưu.
Một đặc điểm quan trọng của nhiều vi khuẩn sinh protease kiềm tính là các
chủng này phụ thuộc vào pH môi trường để phát triển và sinh lượng protease, vì pH
tác động mạnh mẽ đến hoạt động của enzyme và hệ thống vận chuyện tế bào. Về tổng
thể, pH hoạt động của các protease thương mại có trong chất tẩy rửa thường có pH
khoảng rộng từ 8 – 12. Protease của các loài Bacillus có độ pH tối ưu hẹp hơn 9 – 11.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tuy nhiên cũng có một vài protease có pH tối ưu cao khoảng 12 – 13 như enzyme
được sản xuất bởi Bacillus sp. No. AH-101 (Takami et al., 1989) hay từ Bacillus sp.

B18’ (Fujiwara et al., 1991).
- Nhiệt độ tối ưu.
Nhiệt độ tối ưu của các protease kiềm tính dao động khá rộng, từ 40 – 80
o
C như
các enzyme được sinh tổng hợp từ một số loài như Bacillus brevis có nhiệt độ tối ưu là
60
o
C (Banerjee et al., 1999) hay Bacillus horikoshii với nhiệt độ ở 45
o
C (Joo et al.,
2002). Protease kiềm tính có nhiệt độ tối rất cao, đương cử là enzyme được sản xuất từ
Bacillus P-2, hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 90
o
C (Kaur et al., 2001). Bênh cạnh đó, một
số dòng khác lại có nhiệt độ tối ưu hoạt động ở khoảng thấp hơn, từ 30 – 37
o
C.
Bacillus firmus cho hoạt tính cao nhất ở 37
o
C (Moon S. H., 1991) và dòng Bacillus sp.
B21-2 cho sinh lượng protease tối ưu khi nhiệt độ môi trường ở 30
o
C (Fujiwara at el.,
1987).
- Sự hiếu khí
Trong quá trình lên men, khi ta nói đến tỉ lệ hiếu khí nghĩa là mức độ hòa tan
của oxy trong môi trường dinh dưỡng. Đa số các dòng Bacillus sp. sản sinh protease
kiềm tính là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình phát triển oxy sẽ được sử dụng, sau
một thời gian, lượng oxy trong môi trường sẽ cạn kiệt nếu không được cung cấp oxy,

điều này làm hạn chế sự phát triển và sinh protease (Moon và Parulekar, 1991). Hai
phương pháp thường được sử dụng để cung cấp oxy cho môi trường là bơm sục khí và
lắc ủ môi trường. Hàm lượng protease sản sinh đạt tối ưu của dòng B. subtilis ATCC
14416 (Hubner et al., 1993) và B. licheniformis (Sen và Satyanarayana, 1993) khi
được nuôi lắc ủ ở 200 vòng/phút. Cũng có một số dòng khác có tỉ lệ hiếu khí cao hơn,
hoạt tính protease đạt tối ưu khi nuôi ủ lắc ở 600 vòng/phút.
- Ion kim loại
Nhiều ion kim loại có hóa trị II như canxi, coban, đồng, bo, sắt, magie, mangan
cần thiết cho môi trường lên men nếu muốn tối ưu hóa các sản phẩm enzyme. Vì
những enzyme khác nhau sẽ cần ion kim loại đặc trưng khác nhau, phụ thuộc vào tâm
hoạt động của mỗi enzyme. Bên cạnh đó, môi trường cơ bản nuôi dưỡng vi sinh của
nhiều nghiên cứu có chứa kali photphate (Moon và Parulekar, 1991; Mao W. et al.,
1992; Hubner U. et al., 1993) với vai trò là một chất đệm, ổn định pH của môi trường.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tuy nhiên, hàm lượng chất đệm này quá cao sẽ hạn chế sự phát triển của tế bào và ức
chế protease.
- Trọng lượng phân tử
Phương pháp xác định trọng lượng phân tử thường được áp dụng là SDS-
PAGE, SDS và Gel filtration. Trọng lượng phân tử protease kiềm tính dao động từ 15
– 30 kDa. Một số nghiên cứu chỉ ra trọng lượng phân tử của các protease kiềm tính có
trọng lượng phân tử lớn hơn như protease kiềm tính của Bacillus lichenformis MIR 29
(Ferrero el al., 1996) và Bacillus stearothemophilus F1 (Rahman el al., 1994).
Bảng 2. Trọng lượng của các phân tử protease kiềm tính tổng hợp bởi các
dòng Bacillus sp.
Loài
Trọng lượng Phân tử
(kDa)

Phương pháp xác định
Nguồn tham khảo
Bacillus sp. No. AH-101
30
SDS-PAGE
Takami et al., 1989
Bacillus Pumilus MK 6-5
28
SDS-PAGE
Kumar, 2002
Bacillus stearothermophilus F1
33.5
SDS
Rahman et al., 1994
Bacillus licheniformis MIR 29
40
SDS-PAGE
Ferrero et al., 1996
Bacillus pseudofirmus AL-89
24
SDS-PAGE
Gessesse et al., 2003
Bacillus sp. B18’
30
28
SDS PAGE
Gel filtration
Fujiwara et al., 1993
(*Nguồn: Anwar et al., 1998)
- Điểm đẳng điện.

Điểm đẳng điện là giá trị pH mà phân tử enzyme có tổng các điện tích âm và
điện tích dương bằng không, nghĩa là phân tử enzyme không mang điện. Trong môi
trường lỏng, các nhóm điện tích tương tác với phân tử nước, giúp phân tử protein tan
và ổn định. Do vậy, một protein nếu có ít nhóm mang điện tích và nhiều nhóm kị nước
thì protein đó sẽ ít tan trong nước. Khi sự chênh lệch giữa giá trị pH và pI càng cao,
các nhóm điện tích sẽ tăng lên do vậy độ tan của chất sẽ tăng lên.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 3. Điểm đẳng điện pI của các protease chịu kiềm được sản xuất bởi các
dòng Bacillus sp.
Vi khuẩn
pI
Nguồn tham khảo
Bacillus sp. PS719
4.8
Hutadilok-Towana et al., 1999
Bacillus sp. NKS-21
8.2
Tsudchida et al., 1989
Bacillus sp. No. AH-101
9.2
Takami et al., 1989
Bacillus sp. GX6638
4.2
Durham et al., 2003
Bacilluspumilus UN-31-C-42
9.0

Huang et al., 2003
Bacillus subtilis no. 16
3.9
Kato et al., 1992
Bacillus sphaericus
8.6
Singh et al., 2001
(*Nguồn: Hande Genckal, 2004)
2.3. Ứng dụng của protease kiềm tính
2.3.1. Công nghiệp thực phẩm
Protease kiềm tính thủy phân protein của thực vật và động vật tạo ra các sản
phẩm có vai trò quan trọng trong việc điều hòa huyết áp, trong thành phần thức ăn của
trẻ em, trong thực phẩm dinh dưỡng và trong công nghiệp nước giải khát. Vào những
năm gần đây, các enzyme cũng được sử dụng để thủy phân nhiều protein như những
protein trong đậu, gelatin, casein nhằm nâng cao chất dinh dưỡng trong thực phẩm.
2.3.2. Công nghiệp thuộc da
Đối với công nghiệp thuộc da, xử lý bằng protease có thể xóa được các màu
không mong muốn, tăng diện tích sử dụng được của da nên tăng năng xuất sản xuất
(Gupta et al., 2002). Phương pháp sử lý da bằng protease có nhiều ưu thế hơn so với
phương pháp sử lí lý hóa khác vì khả năng điều khiển thời gian xử lí dễ hơn và giảm
lượng chất thải. Protease kiềm tính được úng dụng trong cả ba giai đoạn của công
nghiệp thuộc da là quá trình ngâm, cạo bỏ lông và ngâm mềm da.
2.3.3. Công nghiệp dược
Protease cũng có vai trò quan trọng trong công nghiệp thuốc. Dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis 316M sinh ra elastoesterase giúp chữa các vết bỏng, vết thương có
mủ, các mụn nhọt (Gupta et al., 2002; Kudrya và Simonenko 1994). Bên cạnh đó các
protease kiềm tính từ Bacillus dòng CK11-4 có tác dụng làm tan các vết máu tụ
(Gupta, 2002).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.4. Công nghiệp chất tẩy rửa
Protease là một trong những chất được ngành công nghiệp chất tẩy ứng dụng để
tẩy các chất dơ có nguồn gốc protein. Enzyme được sử dụng rộng rãi ở rất nhiều nước
và tới hơn 30% lượng emzyme sản xuất được sử dụng làm chất tẩy.
Trong các protease thì protease kiềm tính có nhiều lợi thế hơn vì khả năng hoạt
động ở các phổ pH và nhiệt độ rộng. Và được sử dụng với liều lượng ít (0.4-0.8%) nên
tăng tính kinh tế.
2.4 Các phương pháp định lượng và xác định hoạt tính của protease
2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976).
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi màu của thuốc thử Bradford khi hết hợp
với protein trong môi trường acid. Thuốc thử Bradford là hợp chất bao gồm
Coomassie Brilliant Blue (CCB) G250, phosphoric acid hòa tan trong hỗn hợp ethanol
95% và nước cất. Khi chưa gắn với protein, thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng
hấp thụ cực đại 465nm. Sau khi kết hợp với protein, thuốc thử chuyển sang màu xanh
dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm. Vì vậy, lượng protein có thể được biết
bằng cách xác định thuốc nhuộm màu xanh dương khi đo hấp thụ của dung dịch ở
bước sóng 595nm. Độ hấp thu tỉ lệ thuận với hàm lượng protein có trong dung dịch.
2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947).
Phương pháp đo dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein bởi enzyme. Phản
ứng sẽ được dừng lại bằng acid trichloroacetic. Sau đó sản phẩm tạo thành được xác
định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm acid amin sinh ra ở bước sóng 280
nm.
Đơn vị hoạt tính enzyme được biểu hiện qua đơn vị Tyrosin. 1U là lượng
enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân casein, cho ra lượng sản phẩm sản phẩm tương
đương với 1µM Tyrosin sinh ra
Hoạt tính đặc hiệu enzyme là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1mg protein
(U/mg)
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện đã có rất nhiều nghiên cứu ở nước ta về enzyme và protease nói riêng ở
nước ta nhưng số lượng nghiên cứu về protease kiềm tính vẫn còn hạn chế. Đa số các

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
nghiên cứu quan tâm về các protease có nguồn gốc từ động và thực vật như bromelain,
papain, trypsin, pepsin. Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu về ứng dụng của protease
kiềm tính trong việc xử lý môi trường bằng nấm mốc như Asperillus Oryzae trong đề
tài nghiên cứu thu nhận protease kiềm tính và ứng dụng trong xử lý phế liệu da giầy
(Đặng Thị Đăng Phương, 2005). Bên cạnh đó, đề tài “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme protease từ ruột cá basa” (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) nghiên
cứu về quy trình thu nhận protease từ ruột cá và trong điều kiện chiết enzyme với độ
pH = 9.5.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, trước năm 1971 có rất ít các nghiên cứu về protease kiềm tính.
Nhưng kể từ khi dòng Bacillus 221 được phân lâp và có khả năng sản xuất serine
protease kiềm tính (Hirokoshi, 1971) thì rất nhiều các nghiên cứu khác đã tìm hiểu và
ứng dụng những chủng khác vào sản xuất.
Chủng Bacillus Mycoides cũng được Mohamed và các cộng sự (1997) tìm hiểu
và có khả năng sản xuất protease kiềm tính. Các điều kiện phát triển tối ưu của chủng
này là pH 9.0, dextrin 3%, (NH
4
)
2
SO
4
0,1%, peptone (0-1%) và KH
2

PO
4
. Nhiệt độ tối
ưu cho enzyme của chủng này hoạt động là 50 – 55
o
C.
Nghiên cứu về chủng Bacillus cereus strain 146 (Norazizah Shafee et al., 2005)
cho thấy chủng này phát triển tối ưu nhất dưới nhiệt độ 37
o
C được ủ lắc ở 170
vòng/phút với nguồn nitơ tối ưu là beef extract, nguồn carbon là glucose và thời gian ủ
là 48 giờ.
Gần đây hơn, Kumar và các cộng sự (2012) cũng tinh sạch sản phẩm protease
kiềm tính của dòng Bacillus MPTK 712 được phân lập từ nước thải của nhà máy sản
xuất bơ. Nghiên cứu cho thấy hoạt tính của protease kiềm tính cao nhất ở pH 9.0, nhiệt
độ 55
o
C.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ thiết bị
Đầu cone, pipet, ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, que cấy, máy ủ lắc, nồi khử
trùng nhiệt ướt, pH kế, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ ủ, và một số dụng cụ thiết bị thường
dùng khác trong phòng thí nghiệm.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 được cung cấp từ phòng Công nghệ Enzyme,

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Hóa chất
Glucose, KH
2
PO
4
, polypeptone, MgSO
4
, Na
2
CO
3
, Tris-HCl, EDTA, Comassive
Brilliant Blue G250, yeast extract, casein.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn
Bacillus sp. SV1.
Vi khuẩn được chủng 1ml với mật độ 10
9
CFU/ml vào 30ml môi trường
Horikoshi-I (Horikoshi, 1971) trong bình tam giác 100ml được ủ lắc ở 32
o
C, tốc độ
120 vòng/phút. Phần dịch nuôi cấy được ly tâm ở 4
o
C, 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Phần dịch nổi bên trên được lấy để xác định hoạt tính protease.
Chỉ tiêu khảo sát: hoạt tính protease của dịch nuôi cấy được xác định bằng
phương pháp Kunitz (1947).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 4. Thành phần môi trường Horikoshi-I (pH 9.0)
Thành phần
Hàm lượng (g/l)
Glucose
10
Polypeptone
5
Yeast extract
5
KH
2
PO
4
1
MgSO
4
.7H
2
O
0,2
Na
2
CO
3
10
Agar
20

(*Nguồn: Horikoshi, 2011)
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nguồn nitơ và nồng
độ.
Nhân tố C: nguồn Nitơ
C
1
: casein C
3
: yeast
C
2
: pepton
Nhân tố D: nồng độ của nguồn nitơ (w/v).
D
1
: 0,5% D
2
: 1,0%
D
3
: 1,5% D
4
: 2,0%
Thí nghiệm 3 lần lặp lại với 12 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 36.
Bảng 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và
nồng độ.
Nhân tố C
Nhân tố D

D
1
D
2
D
3
D
4
C
1

C
1
D
1
C
1
D
2
C
1
D
3
C
1
D
4
C
2
C

2
D
1
C
2
D
2
C
2
D
3
C
2
D
4
C
3
C
3
D
1
C
3
D
2
C
3
D
3
C

3
D
4

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố là nguồn
carbon và nồng độ.
Nhân tố A: nguồn carbon
A
1
: glucose A
3
: fructose
A
2
: maltose
Nhân tố B: nồng độ nguồn carbon (w/v).
B
1
: 0,5% B
3
: 1,0%
B
2
: 1,5% B

4
: 2,0%
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với với 12 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm
là 36.
Bảng 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và
nồng độ.
Nhân tố A
Nhân tố B
B
1
B
2
B
3
B
4
A
1

A
1
B
1
A
1
B
2
A
1
B

3
A
1
B
4
A
2
A
2
B
1
A
2
B
2
A
2
B
3
A
2
B
4
A
3
A
3
B
1
A

3
B
2
A
3
B
3
A
3
B
4
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
3.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1
- Chủng Bacillus sp. SV1 được nuôi cấy theo môi trường dinh dưỡng nhận từ
thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3.
- Thí nghiệm được khảo sát với một nhân tố là thời gian theo các khoảng 24h,
48h, 72h và 96h

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Thí nghiệm có 3 lần lặp lại với tổng đơn vị thí nghiệm là 12.
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1.
- Vi khuẩn Bacillus sp. được nuôi trong môi trường có nguồn carbon và nitơ
nhận được từ thí nghiệm 3.2.2, 3.2.3.

- Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố là độ pH với pH thay đổi từ 7; 8; 9;
10.
- Thời gian thu mẫu theo kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian. Thí nghiệm 3
lần lặp lại với tổng số đơn vị thí nghiệm là 12.
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh protease kiềm tính
của Bacillus sp. SV1.
- Mẫu vi khuẩn được nuôi trong 30ml môi trường nhận được từ thí nghiệm
3.2.2 và 3.2.3. Nhân tố T
o
thay đổi trong khoảng 32, 37, 42, 47 độ C lắc ủ ở 120
vòng/phút
- Thời gian lấy mẫu theo kết quả khảo sát thí nghiệm thời gian. Thí nghiệm 3
lần lặp lại với tổng số đơn vị thí nghiệm là 12.
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4.4. Ảnh hưởng tương tác giữa pH ban đầu và nhiệt độ tới khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường có nguồn carbon và nitơ nhận được từ
thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với hai nhân tố gồm nhiệt độ và pH
theo bảng sau:


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng giữa nhiệt độ và pH.
Nghiệm thức
Nhân tố
Nhiệt độ

pH
1
0
0
2
0
1
3
0
-1
4
-1
0
5
-1
-1
6
-1
1
7
1
0
8
1
-1
9
1
1
Trong đó 0 được xem là nghiệm thức tối ưu của mỗi nhân tố, -1 và 1 là hai
điểm biên trong kết quả thí nghiệm 3.2.4 (b) và 3.2.4 (c). Thời gian thu mẫu nhận được

theo thí nghiệm khảo 3.2.4 (a).
Thí nghiệm có ba lần lặp lại với số nghiệm thức là 9. Tổng số đơn vị thí nghiệm
là 27
Chỉ tiêu khảo sát: hoạt tính (U/ml)
3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê
Dữ liệu được nhập vào phần mềm Microsoft excel, xử lý và phân tích số liệu
bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.