khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh trên giống lúa ml213 trồng trong dung dịch khoáng




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM
VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG
DUNG DỊCH KHOÁNG


Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
GS.TS Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư - 3102695
Lớp: Cử nhân Sinh học K36





C
ần Th
ơ, 12/2013

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

i
PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)



Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
……………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp, người thầy kính mến đã hết lòng dạy bảo, định
hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn tốt nghiệp.
Ths. Văn Thị Phương Như là người luôn góp ý và sửa chữa những sai sót
giúp tôi hoàn thiện bản thân.
Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - Cán bộ phòng thí nghiệm và toàn thể các anh
chị và các bạn phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện nghiên cứu và phát triển
Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên
cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô công tác tại khoa Khoa học tự nhiên đã hết
lòng dạy dỗ và xây dựng nền tảng kiến thức vững chắc trong suốt gần 4 năm
tôi học tập tại trường Đại học Cần Thơ.
Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập Quách Quang Huy, Phạm Khánh Nguyên
Huân và tập thể lớp cử nhân Sinh học Khóa 36 - những người bạn đường trên
hành trình đi tìm tri thức - đã gắn bó, động viên và giúp đỡ tôi suốt 4 năm đại
học cũng như trong quá trình tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Con xin chân thành cảm ơn gia đình đã nuôi dưỡng, bên cạnh động viên
và giúp đỡ trong những lúc con gặp khó khăn.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho
tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

iii
TÓM LƯỢC
Đề tài được thực hiện để khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó
tan của 10 dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ đất vùng rễ của giống lúa
ML213 trồng tại Phú Yên. Hạt lúa giống được khử trùng bề mặt, xử lý nảy
mầm trên môi trường agar bán lỏng (0,8% agar) trong 48 giờ. Hạt nảy mầm
(rễ mầm khoảng 1 cm) thì chủng lần lượt mười dòng vi khuẩn ML1, ML2,
ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9 và ML10 (mật số 10
9
tế bào/ml) (hạt
lúa giống ở nghiệm thức đối chứng dương và đối chứng âm không chủng vi
khuẩn) trong 3 giờ rồi trồng trong dung dịch khoáng Yoshida. Thí nghiệm gồm
12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần trong
3 chai, mỗi chai chứa 200 ml dung dịch khoáng lỏng và 5 hạt lúa nảy mầm).
Lấy chỉ tiêu chiều cao thân lúa, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày
28), trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây (ngày 28) ở từng
nghiệm thức để xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của mười
dòng vi khuẩn nội sinh. Kết quả mười dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng
cố định đạm, hòa tan lân hữu hiệu so với nghiệm thức đối chứng âm. Hai dòng
vi khuẩn ML1, ML8 có khả năng cố định đạm nổi bật nhất thể hiện qua chỉ tiêu
chiều cao thân lúa và chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô
toàn cây cao hơn có ý nghĩa so với đối chứng dương, ba dòng ML1, ML2 và
ML5 là ba dòng có khả năng hòa tan lân thúc đẩy sự phát triển chiều cao thân
lúa, tăng dài rễ, trọng lượng khô của rễ và toàn cây khô cao hơn cả đối chứng
dương.
Từ khóa: cố định đạm, giống lúa ML213, hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

iv

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM LƯỢC iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vii
TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về cây lúa 2
2.1.1. Vị trí phân loại 2
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý 3
2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng 6
2.1.5. Sơ lược về giống lúa ML213 7
2.2. Tầm quan trọng của nguyên tố N, P 8
2.2.1. Đạm (N) 8
2.2.2. Lân (P) 9
2.2.3. Thực trạng sử dụng phân hóa học ở nước ta hiện nay 10
2.3. Vi khuẩn nội sinh 11
2.3.1. Nguồn gốc 11
2.3.2. Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật 11
2.3.3. Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật 12
2.3.4. Khái quát về sự hòa tan lân khó tan bởi vi sinh vật 14
2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa 16
2.3.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hiện nay 20
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

3.1.1. Thời gian 23
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

v
3.1.2. Địa điểm 23
3.2. Phương tiện nghiên cứu 23
3.2.1. Vật liệu 23
3.2.2. Thiết bị 24
3.2.3. Dụng cụ 26
3.2.4. Hóa chất 27
3.3. Phương pháp nghiên cứu 29
3.3.1. Chuẩn bị mẫu 29
3.3.2. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan của 10
dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213 30
3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi 31
3.3.4. Phương pháp thống kê, xử lý và phân tích số liệu 32
Chương 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 33
4.1. Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều cao cây lúa ML213 trồng
trong dung dịch khoáng 33
4.2. Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều dài rễ cây lúa ML213 trồng
trong dung dịch khoáng 36
4.3. Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên trọng lượng khô của rễ, trọng
lượng khô toàn cây 39
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
5.1. Kết luận 42
5.2. Kiến nghị 42
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

vi
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1. Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nền nông nghiệp Việt Nam từ
năm 2000-2010 10
Bảng 2. Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn 23
Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof và ctv, 1997) 27
Bảng 4. Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976) 28
Bảng 5. Các nghiệm thức đạm 30
Bảng 6. Các nghiệm thức lân 31
Bảng 7. Chiều cao cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14
ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 33
Bảng 8. Chiều dài rễ của cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7
ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 36
Bảng 9. Trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây của cây lúa trồng
trong dung dịch khoáng giai đoạn 28 ngày (g) 39


Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Oryza sativa L 2
Hình 2. Hình thái và cấu tạo một hoa lúa 4
Hình 3. Cấu tạo của một hạt lúa 6
Hình 4. Cấu trúc bậc 4 của enzyme nitrogenase 13
Hình 5. Quá trình tạo NH
3
từ N
2
thông qua H
2
N=NH

2
14
Hình 6. Vi khuẩn Enterobacter 18
Hình 7.Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 19
Hình 8. Tủ cấy vi sinh vật vi sinh vật 24

Hình 9. Nồi khử trùng nhiệt ướt 24
Hình 10. Cân điện tử 25
Hình 11. Máy lắc mẫu 25
Hình 12. pH kế 25
Hình 13. Micropipette 26
Hình 14. Hạt lúa giống có và không chủng vi khuẩn 29
Hình 15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên chiều cao thân lúa giai
đoạn 14 ngày 35

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

viii
TỪ VIẾT TẮT
IRRI: International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa gạo quốc tế)
FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức lương thực và nông
nghiệp)
pH: Power of hydrogen/ Potential of hydrogen (Chỉ số đo độ hoạt động của
các ion hydro (H
+
) trong dung dịch)
IAA: Indole Acetic acid
ĐC: Đối chứng
NT: Nghiệm thức
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

1
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế
giới với hơn một nửa dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực
chính, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Tuy nhiên, diện tích
canh tác lúa ngày càng bị thu hẹp. Năm 2008, sản lượng lúa gạo thế giới đạt 685
triệu tấn so với 822 triệu tấn ngô và 695 triệu tấn sắn (khoai mì) nhưng vẫn còn
hơn 1 tỷ người trên thế giới trên thế giới bị đói (FAO, 2010). Theo tính toán của
Peng (năm 1999), đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải đạt 800 triệu tấn
mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người.
Để đạt năng suất cao, bên cạnh việc cải tiến và tạo ra các giống lúa có phẩm
chất tốt, khả năng chống chịu cao, phân bón được xem là nhân tố quan trọng để
quyết định năng suất cũng như chất lượng nông sản. Tuy nhiên, việc lạm dụng
phân bón hóa học cũng gây ra nhiều tác động xấu đến môi trường, đặc biệt có thể
gây ngộ độc cho người và động vật khác. Vì vậy, ứng dụng phân bón vi sinh vào
sản xuất nông nghiệp là giải pháp tối ưu nhằm giảm chi phí đầu tư, tăng năng
suất, khắc phục được những hạn chế của phân bón hóa học, đồng thời góp phần
phát triển nông nghiệp sinh thái theo hướng bền vững.
Hiện nay, việc nghiên cứu khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi
khuẩn nội sinh vẫn còn hạn chế. Vì vậy, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ
ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG
LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG” được thực hiện.

1.2. Mục tiêu của đề tài
Khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh
lên giống lúa ML213 trồng trong dung dịch Yoshida (IRRI, 1976).
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






2
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây lúa
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (class): Liliopdida
Bộ (ordo): Poales
Họ (famlia): Poaceae
Chi (genus): Oryza
Loài (species): Oryza sativa L.

Hình 1. Oryza sativa L
(Nguyễn Ngọc Đệ. 1998. Giáo trình cây lúa. NXB Đại Học Cần Thơ)
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài lúa canh tác. Hiện nay, loài lúa
được canh tác và sản xuất đại trà để cung cấp lương thực trên thế giới là Oryza
sativa L. và Oryza glaberrima Steud. . Loài lúa Oryza sativa L. phân bố chủ yếu
ở châu Á và có năng suất cao. Loài lúa Oryza glaberrima Steud. được canh tác ít
hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn.
Cây lúa được canh tác từ vĩ tuyến 40
0
phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53
0

của bắc bán cầu, và được trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nước biển cho đến độ
cao hơn 2000 m trên mặt biển.
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý
 Rễ lúa: thuộc hệ thống rễ chùm, rễ non màu trắng sữa, rễ trưởng thành có
màu vàng nâu hoặc nâu đậm, rễ khi già có màu đen gồm hai loại:
 Rễ mầm (radicle) mọc ra lúc hạt nẩy mầm, thường mỗi hạt lúa chỉ có
một rễ mầm, dài khoảng 10-15 cm không ăn sâu, ít phân nhánh. Rễ mầm sẽ
chết sau 10-15 ngày và các rễ thứ cấp được mọc ra.

 Rễ phụ (rễ bất định) mọc ra từ các mắt trên thân lúa, mỗi mắt có từ 5-25
rễ phụ, rễ phụ mọc dài, nhiều nhánh và nhiều lông hút. Tại mỗi mắt có 2
vòng rễ: vòng rễ trên to khỏe, vòng rễ dưới nhỏ và kém quan trọng hơn.
 Thân lúa (stem) gồm những mắt và lóng nối tiếp nhau. Tại mỗi mắt có
mang một lá, một mầm chồi và hai tầng rễ phụ. Một đơn vị tăng trưởng của cây
lúa gồm 1 lóng, 1 mắt, 2 vòng rễ, 1 lá và 1 chồi, có thể sống độc lập được.
 Lá lúa có gân song song, mọc đối. Lá trên cùng (lá cuối cùng trước khi trổ
bông) gọi là lá cờ hay lá đòng. Lá lúa gồm phiến lá (leaf blade), cổ lá (colar) và
bẹ lá (leaf sheath).
 Bẹ lá có nhiều khoảng trống nối liền các khí khổng ở phiến lá thông với
thân và rễ, dẫn khí từ trên lá xuống rễ giúp rễ có thể hô hấp được trong điều
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






4
kiện ngập nước. Bẹ lá có hình thìa, hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ
đều nhọn.
 Phiến lá là phần lá phơi ra ngoài ánh sáng, bộ phận quang hợp chủ yếu
của cây lúa nhờ vào các tế bào nhu mô có chứa nhiều hạt diệp lục. Phiến lá
thẳng, hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Phiến lá
gồm 1 gân chính ở giữa và nhiều gân song song chạy từ cổ lá đến chót lá,
chứa nhiều bó mạch lớn nhỏ và các bọng khí lớn phát triển ở gân chính,
đồng thời ở hai mặt lá đều có khí khẩu.
 Cổ lá (colar) là phần nối tiếp giữa phiến lá và bẹ lá. Tại cổ lá có 2 bộ
phận đặc biệt gọi là tai lá và thìa lá. Tai lá (auricle) là phần kéo dài của mép
phiến lá có hình lông chim uốn cong hình chữ C ở hai bên cổ lá. Thìa lá

(ligule) là phần kéo dài của bẹ lá, ôm lấy thân, ở cuối chẻ đôi.
 Hoa lúa (spikelet) là hạt lúa khi chưa thụ phấn, thụ tinh. Hoa lúa thuộc
loại dĩnh hoa, gồm trấu lớn (dưới), trấu nhỏ (trên) tương ứng với dĩnh dưới và
dĩnh trên, thuộc hoa lưỡng tính, tự thụ.






Hình 2. Hình thái và cấu tạo một hoa lúa
(Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005.
The biology and ecology of rice (Oryza sativa) in Australia.)
Ghi chú: a: bao phấn; f: chỉ nhị đực; st: nuốm nhụy cái; sty: vòi nhụy; o: bầu noãn; lo:
vảy cá (mày hoa; r: đế hoa; p: trấu trên (nhỏ); l: trấu dưới (lớn); g: tiểu dĩnh; g’:
cuống hoa.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






5
 Bộ nhụy cái gồm một bầu noãn và vòi nhụy chẻ đôi với hai nuốm ở tận
cùng để hứng phấn.
 Bộ nhụy đực gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn, bên trong chứa nhiều
hạt phấn.
 Bông lúa: tùy vào từng giống lúa mà có thời gian trổ bông khác nhau, sau
khi ra đủ số lá cây lúa trổ bông. Bông lúa là loại phát hoa chùm gồm một trục

chính mang nhiều nhánh gié bậc nhất, bậc hai và đôi có nhánh gié bậc ba.
 Hạt lúa (trái lúa) gồm có: phần vỏ lúa và hạt gạo.
 Vỏ lúa: Vỏ lúa gồm 2 vỏ trấu ghép lại (trấu lớn và trấu nhỏ). Ở gốc 2 vỏ
trấu chổ gắn vào đế hoa có mang hai tiểu dĩnh. Phần vỏ chiếm khoảng 20%
trọng lượng hạt lúa.
 Hạt gạo: là phần nằm trong vỏ lúa. Hạt gạo gồm 2 phần:
 Phần phôi hay mầm (embryo): nằm ở góc dưới hạt gạo, chổ đính
vào đế hoa, ở về phía trấu lớn.
 Phôi nhũ: chiếm phần lớn hạt gạo chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh
bột (phần gạo chúng ta ăn hàng ngày). Bên ngoài hạt gạo được bao bọc
bởi một lớp vỏ lụa mỏng chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B.
(Nguyễn Ngọc Đệ. 1998. Giáo trình cây lúa. NXB Đại Học Cần Thơ)
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






6

Hình 3. Cấu tạo của một hạt lúa
2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng
Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa là:
 Giai đọan tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng): Giai đoạn tăng trưởng
bắt đầu từ khi hạt nẩy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng. Giai đoạn
này, cây phát triển về thân lá, chiều cao tăng dần và ra nhiều chồi mới (nở bụi).
Trong điều kiện đầy đủ dinh dưỡng, ánh sáng và thời tiết thuận lợi, cây lúa có thể
bắt đầu nở bụi khi có lá thứ 5-6.
 Giai đoạn giai đoạn sinh sản (sinh dục): Giai đoạn sinh sản bắt đầu từ lúc
phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông. Giai đoạn này kéo dài khoảng 27-35 ngày,
trung bình 30 ngày và giống lúa dài ngày hay ngắn ngày thường không khác nhau
nhiều. Đòng lúa hình thành và phát triển qua nhiều giai đoạn, cuối cùng thoát ra
khỏi bẹ của lá cờ: lúa trổ bông.


Dầy
Ngang
Dài
1. Gạo lức
2. Trấu trên (nhỏ)
3. Trấu dưới (lớn)
4. Trục hoa
5. Mày (tiểu dĩnh)
6. Cu
ống hoa

Râu
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






7
 Giai đoạn chín: Giai đoạn chín bắt đầu từ lúc lúa trổ bông đến lúc thu
hoạch. Giai đoạn này trung bình khoảng 30 ngày đối với hầu hết các giống lúa ở
vùng nhiệt đới. Giai đoạn này cây lúa trải qua các thời kỳ sau:
 Thời kỳ chín sữa (ngậm sữa): các chất dự trữ trong thân lá và sản phẩm
quang hợp được chuyển vào trong hạt. Hơn 80% chất khô tích lũy trong hạt
là do quang hợp ở giai đoạn sau khi trổ. Kích thước và trọng lượng hạt gạo
tăng dần làm đầy vỏ trấu. Hạt gạo chứa một dịch lỏng màu trắng đục như
sữa, nên gọi là thời kỳ lúa ngậm sữa.
 Thời kỳ chín sáp: hạt mất nước, từ từ cô đặc lại, lúc bấy giờ vỏ trấu vẫn còn
xanh.
 Thời kỳ chín vàng: hạt tiếp tục mất nước, gạo cứng dần, trấu chuyển sang
màu vàng đặc thù của giống lúa, bắt đầu từ những hạt cuối cùng ở chót
bông lan dần xuống các hạt ở phần cổ bông nên gọi là “lúa đỏ đuôi”, lá già
rụi dần.
 Thời kỳ chín hoàn toàn: hạt gạo khô cứng lại, ẩm độ hạt khoảng 20% hoặc
thấp hơn, tùy ẩm độ môi trường, lá xanh chuyển sang màu trấu đặc trưng
của giống.
(Nguyễn Ngọc Đệ. 1998. Giáo trình cây lúa. NXB Đại Học Cần Thơ)
Theo Yoshida (1981) cho rằng thời gian sinh trưởng của một giống chuyên

biệt cao theo vùng và theo mùa, trung bình có thời gian sinh trưởng khoảng 75-
250 ngày. Yếu tố ảnh hưởng phổ biến đến thời gian sinh trưởng là phương pháp
canh tác và lượng phân đạm bón vào.
2.1.5. Sơ lược về giống lúa ML213
 Thời gian sinh trưởng từ 95 đến 100 ngày.
 Chiều cao cây từ 80 đến 85 cm, chiều dài bông 21-23cm.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






8
 Số bông trên 1m
2
có tới 400 đến 420 bông, hạt chắc trên bông là 85-90,
thân gọn, cứng cây trung bình, năng suất rất cao có thể đạt trên 80 tạ/ ha/vụ, khả
năng thích nghi rộng.
( />HOA-KHAO-NGHIEM-MOT-SO-GIONG-LUA-MOI-235.htm ngày 9/8/2013)
2.2. Tầm quan trọng của nguyên tố N, P
2.2.1. Đạm (N)
Đạm là một trong những nhân tố dinh dưỡng cần thiết cho sự tổng hợp tế
bào của các enzyme, protein, chlorophyll, DNA và RNA. Đạm có vai trò là chất
tạo hình cây lúa, làm cho lá xanh tốt, gia tăng chiều cao cây, số chồi và kích
thước lá thân (Hayat, 2010). Do đó, dựa vào màu sắc và kích thước lá, chiều cao
và khả năng nở bụi của cây lúa, người ta có thể chuẩn đoán tình trạng dinh dưỡng
đạm trong cây.
Cây lúa có thể hấp thu và sử dụng cả hai dạng đạm nitrat (NO
3

-
) và
ammonium (NH
4
+
), chủ yếu là đạm ammonium, nhiều nhất trong giai đoạn sinh
trưởng ban đầu.
Các loại phân đạm thường dùng: phân urea (NH
2
)
2
CO: chứa 44-48%N
nguyên chất; phân ammonium nitrat NH
4
NO
3
: chứa 33-35%N nguyên chất; phân
đạm clorua NH
4
Cl: chứa 24-25%N nguyên chất; phân đạm phosphate chứa
16%N nguyên chất.
(Nguyễn Ngọc Đệ. 1998. Giáo trình cây lúa. NXB Đại Học Cần Thơ)
 Thiếu đạm, trừ các lá non màu xanh, các lá già chuyển sang màu vàng
nhạt, cây lúa lùn hẳn lại, nở bụi ít, chồi nhỏ, lá ngắn, hẹp, trở nên vàng và rụi
sớm, cây lúa còi cọc không phát triển. Giai đoạn sinh sản, nếu thiếu đạm cây lúa
sẽ cho bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ và có nhiều hạt thoái hóa.
 Thừa đạm, cây lúa phát triển thân lá quá mức, mô non, mềm, dễ ngã, tán
lá rậm rạp, lượng đạm tự do trong cây cao, nên cây dễ nhiễm bệnh làm giảm
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

9
năng suất rất lớn đồng thời giảm thời gian bảo quản sau thu hoạch. Đạm dư thừa
có khả năng tích lũy trong cây ở dạng NO
3
, NO
2
gây độc mãn tính cho người sử
dụng.
( />oi/2004/2004_00013/MItem.2004-07-16.0249/MArticle.2004-07-
16.0917/marticle_view)
2.2.2. Lân (P)
Lân đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa vật chất và năng
lượng, từ đó quy định chiều hướng, cường độ các quá trình sinh trưởng và phát
triển của thực vật và cuối cùng là năng suất cây (Nguyễn Hữu Hiệp, 2012). Lân
là thành phần của phosphotit, acid nucleic, protein, phospholipid, coenzyme
NAP, NATP và ATP, thành phần chủ yếu của amino acid. Ngoài ra, lân có vai
trò quan trọng trong việc phân chia tế bào, tạo thành chất béo và protein thúc đẩy
việc tạo thành rễ, đặc biệt là rễ bên và lông hút. Bên cạnh đó, lân có vai trò trong
việc hình thành mô phân sinh, hạt và sự phát triển của quả, kích thích sự ra hoa,
cải thiện chất lượng sản phẩm,đặc biệt là rau và cỏ làm thức ăn gia súc. Trong
cây, lân có thể vận chuyển từ các lá già về cơ quan non, cơ quan đang phát triển
để sử dụng vào việc tổng hợp chất hữu cơ mới. Vì thế, hiện tượng thiếu lân
thường biểu hiện ở lá già trước.
 Triệu chứng thiếu lân: Đối với những cây họ lúa, khi thiếu lân cây đẻ
nhánh ít, lùn lại, hạt lép nhiều. Lá lúa thiếu lân thường có màu xanh đậm nhưng

hiệu quả quang hợp kém, mọc thẳng hơn lá bình thường. Thiếu lân trầm trọng thì
lá già trở nên màu vàng cam hoặc hơi tím đỏ do sự tích lũy sắc tố anthoxian trong
lá. Sự thiếu lân thường xảy ra trên đất chua, đất nhiễm phèn, đất than bùn và đất
kiềm. Chất lân dễ hoà tan trong đất ngập nước hơn đất khô. Trên đất bị thiếu lân,
mà bón đạm nhiều, sẽ càng làm cho năng suất lúa bị giảm.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






10
Cây non thường rất mẫn cảm với việc thiếu lân. Lân bị thiếu trong thời kỳ
này sẽ làm cho năng suất cây trồng giảm mạnh cho dù ở những giai đoạn sau có
bổ sung bao nhiêu lân đi nữa cũng khó mà phục hồi.
( />04/2004_00013/Item.2004-07-16.0249/Article.2004-07-16.0917/marticle_view)
2.2.3. Thực trạng sử dụng phân hóa học ở nước ta hiện nay
Việt Nam được coi là nước sử dụng nhiều phân hóa học trong số các nước
Đông Nam Á. Tính từ năm 1985 tới nay, diện tích gieo trồng lúa ở nước ta chỉ
tăng 57,7%, nhưng lượng phân bón sử dụng tăng tới 517%.
( 8:10
6/8/2013).
Bảng 1. Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nền nông nghiệp Việt Nam
từ năm 2000-2010
( hoc/2195phanbon.html).
Hiện nay, hiệu suất sử dụng phân đạm mới chỉ đạt từ 30-45%, lân từ 40-
45% và kali từ 40-50%, tùy theo loại đất, giống cây trồng, thời vụ … Ngoài ra,
hiệu quả sử dụng phân đạm giảm theo mùa vụ. Như vậy, còn 65-70% lượng đạm
tương đương với 1,77 triệu tấn urea, 55-60% lượng phân tương đương với 2,07

triệu tấn supe lân và 50-60% lượng kali tương đương với 344 nghìn tấn kali
clorua (KCl) được bón vào đất nhưng chưa được cây trồng sử dụng (Sở khoa học
Năm N (tấn) P
2
O
5
(tấn) K
2
O (tấn)
2000 1.332.000 501.000 450.000
2005 1.155.100 554.100 354.400
2007 1.357.500 551.200 516.500
2010 1.627.000 892.000 669.000
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






11
và công nghệ tỉnh Bến Tre). Theo ông Lê Thanh Tùng, Phó phòng phụ trách
vùng Nam Bộ (Cục Trồng trọt), mỗi năm, chỉ riêng phân ure Việt Nam thất thoát
khoảng 1 triệu tấn so với tổng nhu cầu sử dụng là 2 triệu tấn, tương đương mất
10.000 tỉ đồng.
( />=1302. 12:00 15/08/2013)
2.3. Vi khuẩn nội sinh
2.3.1. Nguồn gốc
Vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) là những vi khuẩn cộng sinh bên
trong mô thực vật và không gây ra triệu chứng bệnh cho cây.

Qua những kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ thân, lá, hạt, rễ của thực
vật, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh phải là
đất vùng rễ (soil rhizosphere). Các vi khuẩn thường hiện diện trong vùng rễ thuộc
nhiều chi khác nhau bao gồm Azospirillum, Burkholderia, Azotobacter, nghiệm
thức Pseudomonas, Bacillus, nhờ vào sự đa dạng vi sinh vật cao nên vùng rễ là
nguồn quan trọng của vi khuẩn nội sinh (Hillel and Elsevier, 2005).
2.3.2. Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật
a) Sự di chuyển (Movement)
Vi khuẩn nội sinh di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ
chế hóa hướng động (chemotaxix) hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế. Rễ cây tiết
ra bên ngoài một số dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh tìm đến và quần tụ
(colonization) trên bề mặt rễ. Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên do rễ phát triển để
tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có thể tiếp
xúc với lông hút của rễ non.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






12
b) Sự tiếp cận (Attachment)
Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là
lectins. Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn
cộng sinh.
c) Sự xâm nhập hay xuyên thấu (Intrusion)
Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật thông qua nhiều con
đường như từ lỗ tự nhiên (thủy khổng - hydathodes, lỗ khí khổng -stomata hoặc
bì khổng – lenticels), lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ

ngang (lateral roots), vi lỗ (micropores) hay vết thương do tác động vật lý
(wounds).
Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3
cách là: bám ở bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots),
thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh.
Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí
khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá.
d) Sự định cư (Settlement)
Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị
ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các
khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002).
2.3.3. Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật
a) Enzyme nitrogenase
Enzyme nitrogenase thuộc nhóm EC1 là Oxidoreductases, xúc tác cho phản
ứng oxy hóa khử, nhận điện tử (e
-
) và nhả H
2
(hoặc nhận điện tử và nhả O
2
).

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






13

Hình 4. Cấu trúc bậc 4 của enzyme nitrogenase
Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố
định N
2
, khử N
2
thành NH
3
được cấu tạo bởi 2 protein. Enzyme notrogenase
được điều khiển tổng hợp bởi một hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế
bào vi khuẩn. Cả 2 protein cấu tạo nên nitrogenase đều là phân tử nhỏ và đều có
hoạt tính xúc tác:
 Protein sắt (protein Fe – dinitrogenase reductase) là protein nhỏ hơn có
trọng lượng phân tử khoảng 60 kda, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy
hóa - khử Fe
4
S
4
, có 2 vị trí gắn ATP.
 Protein sắt – molibden (protein Mo – Fe – dinitrogenase) là protein lớn
hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 240 kda, có cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác
nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa - khử.
b) Cơ chế cố định đạm sinh học bởi vi sinh vật
Cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn, trong
đó nitơ phân tử được biến đổi thành dạng nguyên tử, sau đó thành dạng đạm vô
cơ ammonia. Cuối cùng, vi khuẩn sẽ chuyển hóa một phần thành dạng hữu cơ
acid amin cho bản thân vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp, 2011).
N
2

+ 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH
3
+ H
2
+16ADP + 16Pi
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






14
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định đạm N
2
: enzyme nitrogenase có cấu
tạo bởi 2 protein: 1 protein Fe và 1 protein Mo-Fe. Phản ứng cố định xảy ra theo
trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong
ferredoxin. Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N
2
để tạo thành
NH=NH. Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra
H
2
N=NH
2
từ NH=NH và cuối cùng tạo NH
3
từ H
2

N=NH
2
.
(Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Bài giảng vi sinh học môi trường. Viện nghiên
cứu và phát triển công nghệ sinh học Đại học Cần Thơ).

Hình 5. Quá trình tạo NH
3
từ N
2
thông qua H
2
N=NH
2

2.3.4. Khái quát về sự hòa tan lân khó tan bởi vi sinh vật
Trong đất, lân tồn tại dưới hai dạng là lân vô cơ (tricalcium phosphate,
dicalcium phosphate, hydroxyapatite) và lân hữu cơ. Mặc dù trong đất thường
chứa một lượng lớn lân tổng (hiện diện ở mức 400-1200 mg/kg đất), nhưng cây
chỉ hấp thu lân ở dạng hòa tan như HPO
4
2-
, H
2
PO
4
-
(hiện diện trong đất rất thấp,
thường ở mức 1ppm hoặc ít hơn) (Hariprasad and Niranjana, 2008; Hayat, 2010).
Các vi khuẩn này hòa tan lân theo hai cơ chế:

 Hòa tan lân vô cơ: Theo Yahya và Azawi (1989) nhận thấy những vi
khuẩn hòa tan được lân là nhờ các enzyme và các acid hữu cơ (acid gluconic,
acid oxalic, acid citric, acid monolic và acid 2-ketogluconic) có khả năng hòa tan
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






15
các hợp chất khó tan. Tuy nhiên, các vi khuẩn này sử dụng các acid hữu cơ tiết ra
từ rễ cây vì thế có thể gián tiếp ức chế sự hòa tan lân và các nguyên tố bất định
khác như Fe và Mn (Mukerji et al., 2006).
Đa số các vi sinh vật phân giải phosphore đều sinh ra CO
2
trong quá trình
sống, CO
2
sẽ phản ứng với H
2
O có trong môi trường tạo thành H
2
CO
3
, H
2
CO
3
sẽ

phản ứng với phosphate khó tan tạo thành phosphore dễ tan theo phương trình:
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4H
2
CO
3
+ H
2
O => Ca(H
2
PO
4
)
2
+ H
2
O+ 2Ca(HCO
3
)
2
Dạng khó tan Dạng dễ tan
Vi khuẩn nitrate hóa cũng có khả năng phân giải phosphore vô cơ do nó có
khả năng chuyển hóa NH
3
thành NO

3
-
. NO
3
-
sẽ phản ứng với H
+
tạo thành HNO
3
.
Sau đó HNO
3
sẽ phản ứng với muối phosphate khó tan tạo thành dạng dễ tan.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4HNO
3
=> Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2Ca(NO
3
)

2
Các vi khuẩn sulphate hóa cũng có khả năng phân giải sulphate khó tan do
sự tạo thành H
2
SO
4
trong quá trình sống.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2H
2
SO
4
=> Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2CaSO
4
Đa số các vi sinh vật phân giải phosphore vô cơ trong quá trình sống đều
làm giảm pH của môi trường. Gần đây một số nhà khoa học đã tìm ra một số
chủng vi khuẩn phân giải lân mà trong quá trình nuôi cấy không làm giảm pH
của môi trường. Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh là Bacillus
megatherium, Bacillus butyricus, Bacillus mycoides, Pseudomonas radiobacter,

nghiệm thức Pseudomonas gracilis…trong nhóm nấm thì có Aspergillus niger có
khả năng phân giải mạnh nhất. Ngoài ra một số xạ khuẩn cũng có khả năng phân
giải lân vô cơ.
(Lê Quốc Tuấn. 2009. Giáo trình Vi sinh vật môi trường. NXB Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.)
 Hòa tan lân hữu cơ: cơ chế của sự hòa tan là nhờ vào các phosphatases
(hay phosphohydrolases) do vi khuẩn tiết ra. Các phosphohydrolases là nhóm
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36






16
acid hoặc bazơ. Bởi vì hầu hết các loại đất có pH từ acid đến trung tính nên các
phosphohydrolases acid có vai trò quan trọng. Không giống với
phosphohydrolases bazơ, các phosphohydrolases acid thể hiện hoạt tính xúc tác
đặc trưng ở giá trị pH acid đến trung tính. Các enzyme này thủy giải các liên kết
phosphoester hoặc phosphoalhydride (Rodríguez, 1999 và Stefan, 2012) .
2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa
a) Vi khuẩn Pantoea agglomerans
Pantoea agglomerans là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Pantoea
agglomerans là vi khuẩn nội sinh quan trọng trong cây lúa mì và cũng được phân
lập từ thân của khoai tây, hạt lúa, lá của các cây thuộc họ cam quýt. Nhiều nghiên
cứu đã chứng minh tiềm năng của Pantoea sp. có khả năng tạo nên sự kích
kháng và chống các vi sinh vật gây bệnh cho cây. Thêm vào đó, vi khuẩn
Pantoea sp. có thể kích thích sự sinh trưởng bằng cách cố định đạm, hòa tan lân
và tạo ra các kích thích tố tăng trưởng.
( ngày 01.12.2013).

Pantoea agglomerans YS19 thể hiện hoạt động cố định đạm trong môi
trường thiếu đạm, tạo ra bốn loại phytohormones (indol-3-acetic acid, abscicis
acid, gibberellic acid và cytokinin) trong môi trường Luria-Bertani, và có thể
tăng khối lượng/sinh khối của cây mạ (Hironobumano và Hisaomorisaki).
b) Vi khuẩn Bacillus megaterium
Vi khuẩn Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hiếu khí
nhưng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí khi cần thiết, có thể hình thành
bào tử.
Theo nghiên cứu của Fernando et al. (2005), Bacillus megaterium được
phát hiện là vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê. Aravind et al. (2009) cũng phát
hiện vi khuẩn Bacillus nội sinh trong cây tiêu, đặc biệt dòng IISRBP 17 được xác