Nghiên cứu ảnh hưởng một số dẫn xuất artemisinin gắn fluor lên một số chỉ số huyết học và hóa sinh ở động vật thực nghiệm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
*

NGUYỄN VĂN KÚN
NG H IÊN c ứ ư ẢNH HƯ ỞNG CỦA M ỘT s ố D AN x u ấ t
A R TEM ISIN IN GẮN FLUO R LÊN M ỘT s ố CHỈ s ố HUY ẾT HỌC
VÀ H O Á SINH Ở ĐỘ N G V ẬT T H ựC N G H IỆM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 - 2004)
NíỊLtời hướng dấn : TS. Nguyễn Xuân Trường
TS. Trương Văn Như
Nơi thực hiện : VIỆN SR - KST - CT TRUNG ƯƠNG
Thời gian thực hiện : 8/2003 - 12/2004
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói Tổ: Nguvễn Ầuân Trưòng, Tổ:
Trương Văn Như những ngưòi thầy đã tận' tình hưóng đẫn, giúp đõ em thức
hiện và hoàn thành để tài này.
Dồng thòi em xin chân thành cảm ơn các thầv, cô trong Bộ môn
Dược Lực, cản bộ của các phòng ban trong trường Dại học Dược Hà Nội.
các cán bộ của khoa Nghiên cứu lâm sàng điểu trị ố ốt R ét Viộn ỗố t Dét -
Kỷ ổinh Trùng - Côn Trùng Trung ương.
Cũng thông qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn tói các tất cả các
thầy cô, gia đỉnh và bạn bè đã giúp đõ động viên em trong suốt thòi gian
học tập rèn luyện đ ể em có được như ngàỵ hôm nay.
Hà Nội, ngày ,J>0 tháng 5 năm 200 4
ôinh viên
Nguyễn Văn Kún .
Ki
M Ụ C L Ụ C
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẨN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Lịch sử phát triển của các thuốc chống sốt rét. 2
1.2. Hiện tượng kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét 4
1.3. Tình hình nghiên cứu Artemisnin và dẫn xuất của nó. 7
1.3.1. Vài nét về cây Thanh cao hoa vàng. 7
1.3.2. Artemisinin. 8
1.4. Tình hình nghiên cứu artemisinin gắn fluor. 12
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẲ 16
2.1. Đối tượng nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm. 16
2.1.1. địa điểm nghiên cứu 16
2.1.2. Đôi tượng 16
2.1.3. nguyên liệu, phương tiện kỹ thuật 16
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 17
2.1.5. Xử lý sô liệu 20
2.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨƯ. 21
2.2.1. Kết quả nghiên cứu độc tính bán cấp ở trên khỉ tiêm
21
thuốc BB101, BB103 và khỉ chứng.
2.2.2. Kết quả nghiên cứu độc tính bán cấp ở thỏ uống Gôm
Arabic 1% và thỏ uống BB103 liều 50mg/kg X 28 ngày 29
37
và sau 7 ngày ngừng dùng thuốc.
2.3. Bàn luận
2.3.1. Ảnh hưởng của BB 101, BB103 lên các tế bào máu ở
thỏ và khỉ thực nghiệm.
2.3.2. Ảnh hưởng của BB101, BB103 lên chức năng gan,
thận thỏ và khỉ thực nghiệm
P H Ầ N 3: K Ế T L U Ậ N V À Đ Ể X U Â T . 40
TÀI LIÊU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS: Artesunat
AM:
Artemether
BB101:
Trifluouromethyl-đihvdroartemisinin
BB103:
Pentafluoroethyl- dihydroartemisinin
BC:
Bạch cầu
CT:
Công thức
DUA:
Dihydroartemisinin
H:
Eosinophil
Hb:
Hemoslobin
SLHC:
Sô lượng hổns cầu
SGOT:
Serum glutamat oxalate transaminase
SGPT:
Serum glutamat pyruvate transaminase
SR:
Sốt rét
KST-CT:
Ký sinh trùng — Côn trùng
NC:
Nghiên cứu

ĐẶT VẤN ĐỂ
Những năm gần đây, artemisinin chất được chiết lừ cây thanh hao hoa
vàng (Artemisia annua L. Asteraceae) được nhiều nhà nghiên cứu trên thế và
Việt Nam quan tâm bởi lính ưu việt của nó. Thuốc này vừa ít độc lại có hoạt
tính và hiệu quả điều trị cao, chống lại các thể kháng của p. íaclciparum và
chống lại sốt rét ác tính thể não. Tuy nhiên, do khả năng hoà tan ít cả trong
dầu lẫn trong nước cũng như liều dùng và tỷ lệ tái phát còn cao nên khả năng
ứng dụng artemisinin bị hạn chế. Mặt khác, tình trạng KSTSR kháng thuốc
SR ngày càng trở nên phức tạp [1]. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra loại thuốc
mới chống sốt rét có hiệu lực với p. íalciparum là một vấn đề mang tính chất
thời sự. Trong những năm gần đây artemisịnin và một số dẫn xuất của nó đã
được sử dụng để điều trị sốt rét trong chương trình phòng chống sốt rét quốc
gia. Nhờ vậy đã làm giảm số vụ dịch sốt rét, giảm tỷ lệ sốt rét ác tính và giảm
tỷ lệ tử vong. Tuy nhiên, dùng artemisinin vẫn còn nhược điểm lớn nhất là tỷ
lệ tái phát bệnh sốt rét còn cao (14%- 15%). Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra
một loại dẫn xuất mới của artemisinin để hạn chế được nhược điểm của thuốc
là hết sức cần thiết, các nhà khoa học Pháp đã tổng hợp được một số dẫn xuất
artemisinin gắn fluor. Trong số các dẫn xuất đó thì 10a-trifluoromethy]-
dihydroartemisimin (BB101) và 10ot - pentaíluoroethyl - dihydroartemisinin
(BB103) được thử nghiệm ban đầu tại Viện SR- KST - CT trung ương cho
thấy thuốc tác dụng tốt trên KSTSR p. falciparum và p.berghei. Viện đã phối
hợp với công hoà Pháp nghiên cứu tiền lâm sàng các dẫn chất trên trong đề tài
cấp Nhà nước giai đoạn 2002 - 2005. Thực hiện một phần của đề tài trong
khoá luận này, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một sô
dẫn xuất Artemisinin gắn íluor lên một số chỉ số huyết học và hoá sinh ở động
vật thực nghiệm”.
Đề tài có 2 mục tiêu sau:
1. Đánh giá ảnh hưởng của BB101, BB103 lên một số chỉ sô' huyết học,
ho á sinh và khả năng phục hồi sau ngừng thuốc ỏ khỉ thực nghiệm.
2. Đánh giá ảnh hưởng của BBI03 lẻn một sỏ chỉ sô huyết học, hoá sinh

và khả năng phục hồi sau ngừng thuốc ở thỏ thực nghiệm.
I
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC CHỐNG SỐT RÉT
Hai ngàn năm trước đây, sách cổ của Trung Quốc đã nói tới cây thường
sơn (Dichroa febrifuga séx) và qinghao (Artemisia annua L.). Nhưng mãi tới
thế kỷ 17, khi người châu Âu khai thác và sử dụng cây Cinchona (cây sốt,
fever trees, mọc ở sườn núi Pêru) thì việc nghiên cứu về mặt hoá học mới thực
sự bắt đầu. Năm 1810, A. Gomez (Bồ Đào Nha) và I. Gize (Nga) thu được tinh
thể quinin. Bốn năm sau, p. Pelletier và J. Caventou phân lập được alcaloid
của vỏ cây cinchona tạo thuận lợi cho việc chiết xuất quinin ở nhiều nước trên
thế giới [7]. Mặc dù vậy, quinin không đủ đáp ứng nhu cầu, nhất là trong
chiến tranh thế giới thứ nhất. Điều đó đã thúc đẩy việc nghiên cứu tổng hợp ra
các thuốc sốt rét mới. Kết quả là hàng nghìn hợp chất mới đã được đỉều chế.
Qua sàng lọc nhiều thuốc kháng sinh mới được đưa vào sử dụng.
Từ công thức của quinin cùng với sự phát hiện tác dụng ức chế ký sinh
trùng sốt rét của xanh methylen, năm 1926 Schuleman, Shoenhoíer và
Wingler (Đức) đã tổng hợp được primaquin thuộc nhóm 8-aminoquinolein,
sau đó Magnidsson và Stroukov (Nga) tìm ra plasmocid.
Năm 1932, Mauss và Mietzh tổng hợp được atebrin, mepacrin thuộc
nhóm 9 - aminoacriđin bằng cách thay thế nhân quinolein trong công thức
primaquin bởi nhân acridin. Cũng như Primaquin, mặc dù rất độc, chất này
được Pairly (úc) chứng minh có tác dụng khả quan trên 2000 trường hợp
người tình nguyện [7].
Năm 1934, Anderstag (Đức) phát hiện santochin và resorchin bằng cách
thay vị trí gắn chuỗi thẳng trong công thức pamaquin, lừ 8 sang 4. Theo cách
này, Hoa Kỳ dã tổng hợp 17000 hợp chất cùng nhóm 4 - aminoquinolcin. Rối
sau dó, nhờ thay đổi thành phần chuỗi hên (aminoalkyl amino), năm 1944
2

chloroquin và amodiaquin ra đời. Đó là íhuôc chống sốt rét lý iưởng Irong
nhiều năm qua, thuốc vừa có tác dụng điều trị p. falciparum lẫn p. vivax, vừa
có khả năng dự phòng, lại ít độc hơn các thuốc chống sốt rét khác trong Ihời kì
đó.
Năm 1945, Curd Davey và Rose tổng hợp được proguanil (chất 4880)
dựa vào nhận xét của Diaz de Leon về tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét của
sulíamid và về cơ chế tác dụng của mepacrin (cạnh tranh với ribofIavin của hệ
enzym ký sinh trùng), proguanil có một nhân chlorophonin và một nhóm
alkyl. Tác dụng của proguanil cao hơn quin, nhưng lại ít độc hơn. Cơ chế tác
dụng của proguanil là ức chế sự phân chia nhân của ký sinh trùng sốt rét thê
vô tính do ức chế hệ enzym dehydroíolatereductase (DHFR), 2 nãm sau
Bekhli (Nga) cũng tìm được một chất cùng nhóm với proguanil là bigumal [7].
Năm 1951, Falco và Hitchings (trong công trình phối hợp giữa anh và
Hoa Kỳ) tìm được pyrimethamin có cơ chế tác động giống proguanil, nhưng ít
độc hơn.
Năm 1960 xảy ra sự kiện p. íalciparum kháng lại cloroquin ở Colombia
(do Young và Moore, Hoa Kỳ phát hiện), tình trạng p. falciparum kháng lại
các thuốc sốt rét nhóm 4 - aminoquinolein lan nhanh sang các nước Nam Mỹ
và Đông Nam Á (Thái Lan, Nam Việt Nam, Malaixia ). Tổ chức Y tế Thế
giới thấy cần phải đưa việc nghiên cứu thuốc chống sốt rét mới vào chương
trình chống kháng thuốc. Có nhiều nước tham gia nghiên cứu sản xuất thuốc
chống sốt rét mới bằng cách thay thế các nhóm chức trong công thức hoá học
của các thuốc chống sốt rét đã bị kháng. Trong vòng 15 năm từ 1963, các
nước Tây Âu và Hoa Kỳ đã lổng hợp nhiều loại chất chống sốt rét, nhưng chỉ
có một số ít chất có tác dụng trên thử nghiệm bước đầu đối với KSTSR động
vật và cuối cùng chỉ có khoảng 10 hợp chất có tác dụng điều trị lâm sàng. Bên
cạnh dó, sulfamiđ, sulíon và một số kháng sinh cũng tỏ ra có giá trị Ị211. Sự
phối hợp giữa sulfamid chậm và bán chậm với các thuốc ức chế en/ym DMHR
3
cho kết quá tốt. Những phác đồ điều trị chống ký sinh trù nu kháng thuốc gổin

sulíbnamiđ phối hợp với pyrimclhamin và quinin đem lại kết quả đicu trị ỏ'
nhiều vùng có ký sinh trùng kháng thuốc như Thái Lan, Việt Nam và nhò' đó,
giám được tỷ lệ tử vong do sốt rét ác tính và sốt rét nặng một cách đáng kể ị 7 Ị.
Từ năm 1967 các nhà khoa học Trung Quốc đã bắt tay vào kiểm tra một
cách có hệ thống các cây thuốc cổ truyền để tìm nguồn thuốc mới. Một trong
những cây thuốc ấy, một loại cây thảo đã được sử dụng từ lâu đời có lên
Qinghao (Artemisia annua L .) đã được tập trung nghiên cứu. Năm 1972, đã
tách chiết được artemisinin (Qinghaosu) từ cây Qinghao (Thanh hao).
Artemisinin là một sesquiterpen lacton mang một nhóm peroxid nội,
khác hẳn với cấu trúc của các thuốc chống sốt rét khác, trong hệ thống dị vòng
của nó không có nitơ.
Sau khi được tách và xác định đặc tính, artemisinin và một số dẫn xuất
của nó đã được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu một cách khá toàn
diện về hiệu lực của chúng trên các mô hình sốt rét trong phòng thí nghiệm
dược học, dược động học, độc tính và thử nghiệm lâm sàng. Các dẫn xuất của
artemisinin như dihydroartemisinin, artemether, natri artesunat thể hiện hiệu
lực chống sốt rét cao hơn bản thân artemisinin (Trigg - 1989) [24]. Hiện nay,
artemisinin và các dẫn xuất của nó là loại thuốc chống SR mới được quan tâm
không chỉ riêng ỏ' Trung Quốc, ở Việt Nam, mà ở nhiều nơi trên thế giới. Nó
có tác dụng đối với các trường hợp SR nặng, SR ác tính và SR thể não.
1.2. Hiện tượng kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét.
Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới: Kháng thuốc là “khả năng
của một chủng KST có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã được
điều trị và hấp thụ một lượng thuốc hoặc chính xác hơn là trong máu bệnh
nhân có nồng độ Ihuốc mà trước đây vẫn ngăn cản và diệt được loại KST sôì
rct dó”. Định nghĩa này dược xem như là kháng tương đối và trong thực lố là
4
tiếp tục tăng liều lượng lên dến giới hạn mà bệnh nhân có thể chịu dựng dược
nhưng không khỏi bệnh, đó là khánu hoàn toàn. Hiện nay, “kháng thuốc”
mang ý nghĩa kháng hoàn toàn [6|.

Các nghiên cứu lâm sàng về kháng thuốc được đánh giá theo tiêu chuán
của tổ chức y tế thế giới (1973): đáp ứng của p. ĩalciparum theo test in vivo 7
ngày và 28 ngày.
* Test in vivo 28 ngày
- Nhạy (S): trong 7 ngày đầu bệnh nhân hết sốt, sạch KSTSR, không tái
phát KST SR cho đến ngày thứ 28.
- Kháng độ 1 (RI): hết sốt và sạch KSTSR trong tuần đầu nhưng lại tái
phát KST từ ngày thứ 8 đến 28.
- Kháng độ 2 (RII): số lượng KSTSR giảm dần nhưng không hếl hẳn,
tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng < 25% so với ngày NO.
- Kháng độ 3 (RIII): số lượng KSTSR giảm dần nhứng không hết hẳn,
cho tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng > 25% so với NO hoặc lượng KST không
giảm, thậm chí còn tăng cao hơn so với NO.
Việt Nam là nước có p. íalciparum kháng thuốc mạnh. Trường hợp đầu
tiên p. íalciparum kháng chloroquin được phát hiện tại Nha Trang (1961), An
Khê (1964), Tây Ninh, Bình Định (1968). Sau đó lan rộng ra cả khu vực Tây
Nguyên, miền Trung và Nam Bộ.
Năm 1966, Đặng Văn Ngữ và Nguyễn Duy Sỹ đã phát hiện kháng
chloroquin tại VTnh Linh. Sau đó Bùi Đại, Vũ Thị Phan (1967) cũng thông báo
nhiều trường hợp kháns thuốc của p. íalciparum.
Năm 1968, lần đầu tiên xuất hiện một vụ dịch khá lớn do p. falciparum
kháng chloroquin xảy ra ở Quỳnh Thắng, Nghệ An [16]. Sau giải phóng miền
Nam, có sự giao lưu giữa hai miền, biển động dân cư lớn, tình hình SR ở miền
Bắc quay nở lại và p. falciparum kháng thuốc lan rộng trong cá nước 117 ị.
5
Tỷ lệ kháng choloroquin tại thực dịa là 40% - 50%, tại bệnh viện là 50-
80% cả in vivo và in vilro, đặc biệt là trẻ CITI, ly lệ kháng thuốc lên lới 90c/(
(1990) Ị16J.
ỏ' nước ta, tỷ lệ kháng fancidar tương đối cao mặc dù thuốc này dược
đưa vào sử dụng chưa lâu. Năm 1998, trong một nghiên cứu tại nhiều điểm

trong cả nước của Nguyễn Duy Sỹ đã xác định tỷ lệ kháng RI = 31,7%, RII =
25,8%, RIII = 14% (n= 243).
Đôi khi những chủng p. íalciparum kháng mạnh với chloroquin thì cũng
kháng chéo với quinin. Nghiên cứu ở khu vực Tây Nguyên, với liều ],25g
quinin sulíat 10 ngày thấy tỷ lệ kháng quinin RI + RII là 53,3% năm 1990.
Đến năm 1972, tỷ lệ này đã là 80% với liều 25mg/kg thể trọng 7 ngày
110,11].
Meíloquin được đưa vào sử dụng ở nước ta từ năm 1989 đến nay. Thuốc
được sử dụng chủ yếu để điều trị-P. íalciparum đa kháng. Nãm 1990 Viện SR
- KST - CT Trung đã nghiên cứu trên 274 bệnh nhân SR thuộc các vùng lưu
hành SR ở miền Bắc với liều duy nhất 15mg/kg thể trọng thấy kháng RI là
3,2%, không có kháng RII và RIII. Lê Đình Công (1990) cho thấy tỷ lệ kháng
RI là 1% [4].
Như vậy, p. falciparum kháng thuốc ngày càng tăng và lan rộng nhiều
nơi trên cả nước, do đó việc nghiên cứu để tìm ra một loại thuốc mới thay thê
các thuốc đã bị kháng là vấn đề hết sức cần thiết trong tình trạng sốt rét diễn
biến ngày càng phức tạp hiện nay [7]. Trong lúc chờ đợi vaccin và các thuốc
điều trị đặc hiệu, vấn đề phòng bệnh vẫn là biện pháp hàng đầu. Cần khuyến
khích các bệnh nhân nằm màn, làm sạch môi trường, phun thuốc diệt muỗi.
6
1.3. Tình hình nghiên cứu artcmisnin và dẫn xuất của nỏ.
1.3.1. Vài nét vê cáy Thanh hao hoa vàng.
Cây Thanh hao hoa vàng thuộc chi Artemisia. v ề thực vật học, theo
J.D’.Hooker 1882), theo M.H.Lecomte (1922) và một số tài liệu khác thì với
chi Artemisia, trên thế giới đã biết khoảng 250 loài [ ] 8].
Cây Thanh hao hoa vàng có tên khoa học là Artemisia annua L., họ Cúc
(Asteraceae).
Artemisia annua L. là cây thảo, sống hàng năm, mọc hoang thành từng
đám ở vùng đồi, ven suối, ven sông, cao từ 1,2 - 1,5 mét, lá xẻ lông chim hai
lần, thành phiến dẹt, phủ lông mềm, có mùi thơm. Cụm hoa hình cầu thành

một chuỳ kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc bầu dục, hoa mầu vàng nhạt.
Trong một cụm hoa có sáu hoa, xung quanh là hoa cái, ở giữa là hoa lưỡng
tính. Hoa nhỏ chỉ dài bằng một màng lọc, mặt vỏ có tuyến dầu [11].
Thanh hao hoa vàng mọc hoang ở Trung Quốc. Cây còn mọc hoang lại
Châu Âu, Iran, Mông cổ, Triều Tiên, Nhật, Ấn Độ, Bắc Mỹ và một số nước
Đông Nam á.
Năm 1924, Gagnepain [8] đã nói về cây Thanh hao mọc ở Lạng Sơn và
Hưng Yên. Ó Việt Nam, vùng phân bố của cây Thanh hao chủ yếu ở vùng
Đông Bắc. Cây mọc tập trung nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng, còn ở Quảng
Ninh, Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Hưng, cây Thanh hao mọc thưa thớt, không có
khả năng khai thác [18].
+ Thành phần hoá học
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 1981, phần trên mặt đất
của cây ITianh hao hoa vàng có arlemisinin, hàm lượng từ 0,01 % - 0,5%. Nãm
1984, Daniel L.Klayman và cộng sự chiết xuất 10 loài mọc ở Mỹ cũng thấy
nuoài lá hoặc hoa khô của artemisia annua L chứa 0,06% artemisinin, không
loài nào có arlcmisinin. Nãm 1994, Nguyền Gia Chấn và cộng sự cho biết hàm
7
lượng artcmisinin trong lá cây Thanh hao trồng tại Văn Đicn (rrhanh 'Trì, llà
Nội) Ircn các loại vật liệu Irồng, mậl độ trồng và thời điểm thu hái khác nhau
là 0,17% đến 0,99%.
+ Công dụng:
Thanh hao hoa vàng được sử dụng từ nhiều thê kỷ ở Trung Quốc làm
thuốc thanh nhiệt, bổ vị (dạ dày, cầm máu, chữa trĩ, chữa sốt, đặc biệt được
dùng riêng lẻ hoặc phối hợp với tẩy tê tê để chữa sốt rét ). Thế kỷ 14, Tuệ
Tĩnh, thế kỷ 18 , Hải Thượng Lãn ông Lê Hữu Trác xác nhận cây Thanh hao
có vị mát, tính lành, chữa được các chứng lao tổn, nóng âm ỉ, đồ mồ hôi trộm,
bệnh lỵ, bệnh sốt rét. Đồng bào các dân tộc vùng Lạng Sơn dùng lá, cuống
hoa làm thuốc chữa sốt cao, giải độc, cảm mạo, rối loạn tiêu hoá. Lá lộc của
cây non có thể dùng để nấu canh ăn thay rau [10].

1.3.2. Artemisỉnỉn.
+ Tách chiết
Artemisinin được các tác giả Trung Quốc tách chiết lần đầu vào năm
1972 bằng ethyl ether. Tuy nhiên, các chi tiết của phương pháp tách chiết này
không được công bố.
Năm 1984, Daniel L. Klayman và cộng sự đã mô tả phương pháp chiết
xuất artemisinin từ dược liệu sấy khô.
Năm 1994, Guo-Qiang Zheng và cộng sự đã đưa ra phương pháp chiết
xuất artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng mọc ở Việt Nam nhằm phục vụ
chương trình sản xuất thuốc sốt rét cho quán đội [8,10]. Việc chiết xuất
artemisinin đã phát triển rất nhanh chóng. Trong những năm gần đây (1991 -
1997) chiết xuất artemisinin ở Việt Nam đã tăng từ một vài kilôgam lên vài
tấn.
+ Xác định cấu trúc /26/
Artemisinin cổ tên khoa học như sau: Octahydro-3,6,9 - trimelhyl-3, 12
- cpoxy-124 pyrano |4,3,j| -1 ,2 - bcn/odioxcpin-10 (3ỈI)-ON.
X
Công thức của artemisinin là Cl5II22Ov Cônc thức không gian của
arlcmisinin đã được nghiên cứu tỉ mỉ bằng phương pháp nhiễu xạ tia X.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của atemitnin.
Trong công thức bên, vòng A có dạng cyclohexan, vòng D là 5 lacton,
vòng B và c đều là dị vòng oxy bão hoà, trong đó vòng c là một vòng trioxan,
có liên quan nhất đến hoạt tính chống sốt rét của artemisinin [25].
+ Tính chất
Artemisinin có dạng tinh thể hình kim không màu, không mùi, điểm
nóng chảy 156° - 157°. Artemisinin rất ít tan trong nước và trong đầu, tan
trong hầu hết các dung môi hữu cơ.
Artemisinin bền trong dung môi trung tính ở nhiệt độ 150°c, hoặc tới
50°c trên điểm chảy (khoảng 200°C) trong gần 2,5 phút [10]. Artemisinin
không bền trong acid và kiềm, thậm chí ngay cả ở nhiệt độ phòng.

Năm 1976, với mục đích làm tăng liệu lực chữa sốt rét của artemisinin, các
nhà khoa học Trung Quốc khử artemisinin bằng natri borohydriđ cho
dihydroartemisinin, hợp chất này tác dụng mạnh gấp hai lần chất gốc. Từ đó đến
nay đã có hơn 100 dẫn xuất dược tổng hợp. Trong dó atermether, arteether, acid
arlenilic và artesunat, là các dẫn xuất ether, ester của dihydroartemisinin đã thu
hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học [26] (hình 1.2).
«>
c:h 3
H
R = H
: Dihydroartemisinin
: Artemether
: Arteenther
R = CH
R = CH,CH
R = CH2CH2COO'Na+ : Natri artesunat
Dẫn xuất của artemisinin hứa hẹn nhất là dihydroatemisinin bán ester
của acid succinic dạng muối natri hoà tan trong nước, có thể dùng để tiêm tĩnh
mạch, có tên là natri artesunat.
Ở Việt Nam, từ 1992 - 1996, Phan Đình Châu, Đỗ Hữu Nghị, Phan Lệ
Thuỷ đã bán tổng hợp được artesunat [3], artemether, arteether [13] và acid
artenilic [4].
+ Dược động học của artemisinin và dẫn xuất của nó.
Atemisinin và các dẫn xuất của Ĩ1Ó được hấp thu, chuyển hoá thải trừ
một cách nhanh chóng sau khi uống, thuốc được hấp thu ở ruột, nồng độ tối đa
đạt được trong máu, sau một giờ, thòi gian bán thải là bốn giờ [2]. Thuốc gắn
với protein huyết tương trên 50%, tiêm bắp nồng độ thuốc trong huyết tương
cao và kéo dài, thuốc được phân bố khắp cơ thể nhưng phần lớn được tập trung
ở gan, thận, túi mật. Sau khi uống khoảng 80% lượng thuốc được bài tiết qua
thận và nước tiểu trong vòng 24 giờ, sodium artesunate được chuyển hoá

nhanh thành dihydroartemisinin in vitro. Ở chuột cống trắng, sau khi uống
thuốc 1 giờ nồng độ thuốc ỏ' trong các mô giảm theo thứ tự: gan > não > huyết
tương > phổi > thận > cơ > tim > lách [20]. Sau khi tiêm tĩnh mạch [3H]
arlemether vào chuột nhắt thuốc được phân bố khắp cơ thể, phần lớn tập trung
ở gan, thận, túi mậl, tổng lượng hoạt độ phóng xạ được bài tiết theo nước tiểu
và phân bố trong 24 giò' là 68%, trong 72 giờ là 95%. Điều này chứng lỏ có
ihc gan là Mơi ehuycn hoá thuốc mạnh nhất, (hận là nơi chuyển hoá íl hơn.
10
+ Độc tính của artcmisinin và dẫn xuất của nó.
Artemisinin và dẫn xuất của nó là những thuốc ít độc Ị20 Ị. Các nghicn
cứu về độc tính cấp và bán cấp của artemisinin và các dẫn xuất của nó đối với
động vật thực nghiệm là tương đối thấp.
Độc tính cấp của artemisinin và dẫn xuất của nó (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Liều chết 50% (LD50) của artemisinin và dẫn xuất của nó so
với chloroquin
Tên thuốc Loài súc vật LDS0 đường uống LDS0 đường tiêm
ART
Chuôt nhắt
4228 3840
AS
Chuôt nhắt
1180 475
AM
Chuôt nhắt
840 263
Chloroquin
Chuột nhắt
4000 63
DHA
Chuột nhắt

1150
BB101
Chuôt nhắt
820
410
BB103
Chuột nhắt
910 390
Các triệu chứng nhiễm độc cấp của artemisinin trên động vật thực
nghiệm là sự bồn chồn, run giật, suy giảm hô hấp và mất phản xạ chính xác, ỏ'
các động vật lớn hơn thì biểu hiện lúc đầu là run giật ở cường độ cao và mất
phương hướng sau đó là suy hô hấp và ngừng tim, ở các động vật nhỏ hơn sau
khi sống sót thì hồi phục trở lại bình thường trong vòng từ 10 - 24 giờ [20].
Độc tính bán cấp Artemether và artemther liều 12,5mg/kg đến
50mg/kg thể trọng ảnh hưởng rõ đến chức nâng não bộ của chó [23].
Mesnick và cs đã nhận thấy khi dùng artemether liều cao trên chuột cống đã
gây hoại tử neuron ở các vùng đặc biệt (nhân đỏ và nhân tiền đình) của não
122].
Các nghiên cứu trên chuột cống trắng cho thấy với liều uống 250 -
500mg/kg dùng 14 ngày liên tục, artemisinin và dẫn xuất của nó không ảnh
hưởng đến trọng lượng, công thức Iĩiáu, hình ảnh vi thê gan, tim, phối, thận
của chuột thí nghiệm. Các kếl quả nghiên cứu trên thỏ cho thấy với liổu AS
II
gấp 14 lần liêu dùng ư lâm sàng không làm ihay đổi số lượng hồng cầu, hạch
cầu, công thức bạch cáu của thỏ, không ảnh hưởng đến chức năng uan nếu chi
dùng từng đọt ngắt quãng. Artesunat với liều lOOmg/kg X 28 ngày liên tục trcn
thỏ không ảnh hưởng đến tim mạch và thể trọng của thỏ, giảm nhẹ số lượng
hồng cầu, tỷ ]ệ hemoglobin, tăng nhẹ bạch cầu ở thỏ, làm thay đổi cấu trúc vi
thể gan thận thỏ. Nhưng những biến đổi này được phục hồi sau 7-15 ngày
ngừng thuốc [5].

Atemisinin và dẫn xuất của nó có thể qua được hàng rào nhau thai và
máu não nên ảnh hưởng của artemisinin và dẫn xuât của nó khi dùng cho phụ
nữ mang thai còn có nhiều ý kiến khác nhau. Các nghiên cứu về sử dụng
artemisinin và dẫn xuất của nó trên phụ nữ có thai còn rất hạn chế, năm 1999
tại Gambia đã tiến hành nghiên cứu điều trị hàng loạt đối với phụ nữ ở lứa tuổi
sinh đẻ bằng liều duy nhất AS phối hợp với pirimethamin - sulíadoxin (PSD),
kết quả cho thấy trong 265 trẻ sinh ra ở nhóm bà mẹ uống thuốc trong thời
gian mang thai, không có biểu hiện gì bất thường đối với thai hoặc các biểu
hiện có hại cho sức khoẻ. Nghiên cứu các tác giả trong nước và nước ngoài
đều cho thấy artemisinin và dẫn xuất của nó không phải là chất gây đột biến,
tuy nhiên một số tác giả Trung Quốc cho rằng artemisinin độc với bào thai
chuột nhắt và chuột cống trắng chủng wistar, đặc biệt trong thời kỳ đầu và
giữa của bào thai, uống liều 1/400 liều LD50 có một nửa các bào thai bị hấp
thu, uống liều 1/25 LDS0 100% bào thai bị hấp thu gây ra một số dị hình như
thoát vị rốn.
1.4. Tình hình nghiên cứu artemisinin gắn fluor.
Mặc dù tác dụng chống SR của artemisinin có nhiều ưu việt so với các
thuốc chống SR kinh điển, nhưng việc sử dụng còn nhiều hạn chế do khả nâng
hoà lan kém của nó cả Irong nước lẫn trong dầu và dễ bị kháng thuốc. Do đó,
các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu hán tổng hợp từ nó các dẫn xuất
mới dc sàng lọc ra các hợp châì có hoạt lính chống SR mạnh hơn, dễ hoà lan
12
hơn và ít bị kháng hơn. Chủ yếu là lạo ra các nhổm háo nước, háo dầu trong
phân tử. Dẫn chất bán tống hợp dầu tiên có hiệu lực hon arlcmisinin là
dihydroarmisinin (DHA), nó cũng là tiền chất để tạo ra nhiều dãn chấl khác
của artemisinin
Các dẫn xuất ether của DHA đều tồn tại dưới 2 dạng đồng phần a và Ị3
với các ancol có mạch carbon thẳng và ngắn thì đồng phần ị3 chiếm ưu thế,
các đồng phần này thường tồn tại dưới dạng tinh thể. Các đồng phân a thường
là dạng dầu, người ta có thể điều chế chọn lọc ra đồng phân a của các dẫn

xuất ether hoá bằng cách sử dụng dẫn xuất halogen thay cho ancol để tác dụng
với DHA.
Trương Đình Thạc và cộng sự (Viện hoá công nghiệp) và Jean-Pierren
Bécgué (Pháp) đã tìm cách gắn fluor vào phân tử artemisinin, để ổn định được
dạng hemiacetal của DIIA. Các dẫn xuất ether gắn fluor của DMA sẽ chuyến
hoá chậm hơn, làm chậm quá trình oxy hoá bởi enzym cytochrome P450. Hơn
nữa, việc thay thế các nguyên tử hydrogen bằng những nguyên tử fluor có thể
làm thay đổi khả năng hoà tan của phân tử.
Các dẫn xuất ether của artemisinin có chứa fluor được điều chế theo 3
phương pháp sau:
- Cho DHA tác dụng với ancol có chứa fluor, chất xúc tác đặc hiệu BF3Et20.
- Cho DHA tác dụng với ancol có chứa íluor, chất xúc tác là CLSi (CH^V
- Áp dụng phản ứng Mitsunobu.
Trên nguyên tắc của các phương pháp trên, nhóm BIOCIS - Chatenay đã
tổng hợp được 2 dẫn xuất gắn fluor của DHA là:
* 10a - triíluoromethyl - DMA (ký hiệu BB101).
* l()a - pentaíluoroethyl - DMA (ký hiệu BB103)
Các chất này đã được phân tích cấu trúc và cho công ihức cấu tạo như sau
13
Dihydroartemisinin 10a - trifluoromethyl-DHA (BB101)
Dihydroartemisinin 10a-pentafluoroethyl-DHA (BB103)
+ Các kết quả nghiên cứu ban đầu
Một trong các dẫn xuất gắn ílour của artemisinin có tác dụng tốt với
KSTSR là 10a-trifluorromethyl-dihydroartemisinin (BB101). Thuốc đã được
thử nghiệm ban đầu tại Viện SR- KST - CT trung ương năm 1999, thấy có tác
dụng trên p. íalciparum nuôi cấy và p. berghei gây nhiễm ở chuột nhắt trắng
[2]. Nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng diệt KST nhanh và mạnh hưn
artemisinin. Nồng độ ức chế 50% KST (IC50) là 4,4 mol/1 với chủng nhạy
Cloroqunin và 4,6 mol/1 với chủng kháng Cloroquin, nồng độ này thấp hưn
artemisinin 3 lần. Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng nhiễm p.berghei cho thấy

ART-F với liều 50 mg/kg, 100% chuột sạch KST sau 24 giờ, tỷ lệ khỏi bệnh là
100%, chưa thấy tái phát trong vòng 60 ngày đối với cả chủng nhạy và chúng
kháng Chloroquin.
14
Một sỏ kết quả nghiên cứu của các tác giả Pháp Ị19].
Thuốc
ED50 (mg/kg)
ED90 (mg/kg)
BB101 (dưới da)
0.7
1.8
BB101 (uống)
4.3
3
BB103 (dưới da)
1.0
1.5
BB103 (uống)
2.8 4.3
Artesunate (dưới da)
, 2.8
5.4
Artesunate (uống)
10.5
15.3
Từ bảng trên ta thấy các liều có hiệu lực ED50 và ED90 của BB101 và
BB103 đều nhỏ hơn artesunate. Kết quả nghiên cứu của Pharo về dược động
học của ART-F trên lợn cho thấy nồng độ thuốc trong huyết tương là 3()ng/ml
sau 10 giờ điều trị. Qua các kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc đưa nhóm
fluoroalkyl vào C|0 là một vị trí quan trọng để làm chậm tốc độ chuyển hoá

của các dẫn xuất ART.
15
PHÂN 2
THỤC NGHIỆM VẢ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng nguyên vật liệu và phương pháp thục nghiệm.
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu.
Phòng thí nghiệm nghiên cứu độc tính, nghiên cứu sinh học thực
nghiệm của viện SR-KST-CT trung ương.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu là các động vật thực nghiệm gồm:
- Khỉ (Macaca sp Copithecidea) khoẻ mạnh, số lượng 05 con, có trọng
lượng trung bình 3,5 - 5kg/con do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp
(có nguồn gốc từ Đảo Rều Quảng Ninh). Được nuôi trong cùng một điều kiện
và chế độ ăn như nhau, ổn định trong 01 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm
-ITiỏ trưởng thành (oryctolảgus curiculus L), số lượng 20 con do Trung
tâm đê thỏ Ba Vì cung cấp có trọng lượng trung bình 2 ± 0,3kg/con được nuôi
trong cùng điều kiện, chế độ ăn uống như nhau.
2.1.3. Nguyên liệu, phương tiện kỹ thuật.
- Bột BB101, BB103 dạng tinh khiết do Jean Pierre Begue và Viện khoa
học Việt Nam cung cấp.
- Tween 80 và DMSO được dùng làm dung môi để hoà tan BB101 và
BB103 và dùng cho khỉ chứng.
- Cân đồng hồ để xác định trọng lượng thỏ và khỉ.
- Cân Sartoriuss có độ chính xác d = 0,0lm g dùng để cân thuốc.
- Chất chống đông máu heparin.
- Xét nghiệm sinh hoá được đo trên máy photometer 5010 của hãng
Mannhein Boringger (Đức).
lí)
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu.
* Thiết kế nghiên cứu.

- Thực nghiệm 1: Nghiên cứu độc tính bán cấp trên khí. Gồm 5 con chia
thành số như sau:
+ Khi số 1: Khỉ chứng tiêm dung môi (DMSO + TWEEN 80 + Nước Cất).
+ Khỉ số 2 và Khỉ số 3 tiêm BB101.
+ Khỉ số 4 và Khỉ số 5 tiêm BB103.
Khỉ ở các lô này dùng để xét nghiệm các chỉ sô huyết học và sinh hoá,
vào các ngày trước khi tiêm thuốc (NO), sau tiêm thuốc 15 ngày (N I5), sau
tiêm thuốc 30 ngày (N30). Sau 15 ngày ngừng tiêm thuốc (N45).
- Thực nghiệm 2: Nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ. Gồm 20 con
được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con.
+ Lô uống BB103 liều 50mg/kg X 28 ngày.
+ Lô chứng uống gôm arabic 1%.
Số thỏ này dùng để xét nghiệm các chỉ số huyết học và sinh hoá, vào
ngày trước uống thuốc (NO), sau 14 ngày uống thuốc (N14), sau 28 ngày uống
thuốc (N28) và sau 7 ngày ngừng uống thuốc (N35).
* Các chỉ sỏ nghiên cứu.
- Các chỉ số nghiên cứu độc tính bán cấp ở các khỉ tiêm BB101 và
BB103.
+ Các chỉ số về huyết học bao gồm: Số lượng hồng cầu (x T/l), Số
lượng bạch cầu (x G/l), Công thức bạch cầu (%), Hàm lượng Hemoglobin
(g/1).
+ Các chỉ số về sinh hoá bao gồm: Hàm lượng SGOT (U/l), Hàm lượng
SGPT (U/l), Hàm lượng Creatinin (ịimol/1), Hàm lượng protein (g/1), Hàm
lượng Bilirubin (ịiunol/1). -"-"x
* Phương pháp tiến hành.
• Phương pháp nghiên cứu độc tính bán cấp trên khỉ.
- Khí 5 con được chia như sau:
+ Khí số 1 tiêm dung môi (DMSO + Tween 80 + nước cất).
+ Khỉ số 2 tiêm BB101 liều 4mg/kg X 30 ngày.
+ Khỉ số 3 tiêm BB 101 liều 8mg/kg X 30 ngày.

+ Khỉ số 4 tiêm BB103 liều 3,5mg/kg X 30 ngày.
+ Khỉ số 5 tiêm BB103 liều 7 mg/kg X 30 ngày.
- Tiêm bắp cho khi vào lúc 9 giờ sáng hàng ngày khi khỉ chưa được ăn
uống gì, tiêm liên tục trong 30 ngày, theo dõi các biểu hiện ăn uống, đại tiểu
tiện, hình dáng bên ngoài hàng ngày.
- Các chỉ số nghiên cứu được đánh giá vào các thời điểm: ngay trước
tiêm thuốc (N0), ngày thứ 14 (N14) ngày thứ 30 (N30) và sau 15 ngày ngừng
tiêm thuốc (N45).
- Phương pháp xác định các chỉ số về huyết học. Sô lượng hồng cầu,
hàm lượng Hb, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu được xác định bằng kỹ
thuật thường qui.
- Phương pháp xác định các chỉ sô về hoá sinh.
+ Hoạt tính enzym SG OT (serum glutamat oxaloacetat transaminase)
được xác định theo phương pháp của Bermeryer H.Ư theo nguyên lý
sau:
GOT
a-cetoglutamat + L - aspartat " L- glutamat + oxaloacetat.
MDH
oxaloacetat + NADH 4- H+ - —► L. maỉat + NAD+.
MDH: malad dehydrogenase.
Đo NADH ở bước sóng 340nm trên máy quang kế 4010 của Đức.
+ H oạt tính enzym SGPT (serum glulamat pyruvat transaminase) được
xác định theo phương pháp Bermaryer H.Ư theo nguyên lý sau:
18
(.IM
u-cetoulutamut -+- L - alaniii " l ululumut + pyvuvat.
MHI I
pyvuvat + NADH + H+ I lactat + NAI)'.
Đo NADH ứ bước sóng 340mn tròn máy quarm kế 4010 cúa Đức .
- Phưong pháp xác định protein toàn phần trong huyết thanh.

Nsuyên lý: - protein huyết thanh tạo phức màu với muôi đồng trong
môi trường kiềm. Đậm độ màu tỷ lệ với nồns độ protein có tronc duníi dịch.
Tiến hành do màu ở bước sórm 550 nm trên máy tư đônu LISA của hãn°
<_ J . . <_ CT
Viphaco (Pháp) ở nhiệt độ 37°.
rr ' - A t h ử
Kết qua: Protein (g/1) = — X 60.
Amẫu
- Phương pháp định lượng creatinin trong huyết thanh
Nguyên lv: Xác định hoạt độ của enzym thuỷ phân creatinin theo phản
ứng sau:
Creatinase
Creatinin + H20

► Creatin
Creatin + H-,0 Sarc.oim.Qxy da^ Sarcorin + Urê
Sarcorin + 0 2 + H20 Crcatiiia.sc Glyxin + HCHO + iI:0 2
11,02+EIISPT+4 aminoantipyrin

► Đỏ quinon.
Đậm độ đỏ quinon tỷ lệ với nồníi độ creatinin có trong dung dịch. Tiên
hành do màu ớ bước sóng 500 nm trên máy tự dộng USA của hãng Viphaco
(Pháp) ư nhiệt độ 37°c.
Athử
Kết qua: creatinin (|Limol/l) = — —-X 176,8
Amẫu
- Phương pháp xác định hàm lưựng bilirubin huvèt thanh.
Nuuyêiì 1V: Dìm lì duníi dich cafein ben/.oat dể hoà tan bilirubin tự do.
Bilirubin tạo với thuốc thử cỉia/.o (acid dia/o phcnylsimfonic) thành
azobilirubin màu hồng, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 530 nm, Đậm độ

màu tỷ lệ thuận với nồng độ bilirubin.
A thử
Kết quả: Nồng đô bilirubin (|imol/l) = — —— x85,5
Amẫu
• Phương pháp nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ.
- Thỏ được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con:
+ Lô thỏ uống BB103 liều 50mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục.
+ Lô thỏ chứng uống gôm arabic với liều trên.
Các thỏ được uống thuốc hàng ngày vào lúc 9 giờ sáng. Theo dõi các
biểu hiện ăn uống, đại tiểu tiện, hình dáng bên ngoài hàng ngày.
- Các chỉ số huyết học, hoá sinh được tiến hành vào các thời diểm trước
uống thuốc ngày NO, ngày thứ 14 (N14), ngày 28 (N28) và sau 7 ngày ngừng
thuốc (N35).
Các chỉ số nghiên cứu độc tính bán cấp ở các lô thỏ uống BB103. Các
chỉ số về huyết học, hoá sinh, đánh giá giống như ở khỉ.
2.1.5. xủ lý số liệu.
- Trên khỉ: do số lượng khỉ ở mỗi lô chỉ có một con không dùng được
phương pháp thống kê y - sinh học mà dùng phương pháp thống kê miêu tá để
nhận xét số liệu trước trong và sau thực nghiệm.
- Trên thỏ: các kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống
kê y- sinh học, dùnơ các mẫu nhỏ (n < 30) trên máy tính theo chương trình
Epiĩnfo 6.0 để đánh giá trung bình (X)và dộ lệch chuẩn (SD) theo các nội
dung:
+ So sánh ngang sự thay đổi các chỉ số nghiên cứu ở các thời điểm N I4,
N28, N45 trong từng lô theo phương pháp tự chứng.
+ So sánh dọc giữa các lô ở từng thời điểm nghiên cứu theo phương
pháp so sánh giữa các nhóm độc lập.
Nếu p > 0,05 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
20