Kỹ Thuật Định Danh Vi Khuẩn

KỸ THUẬT LẤY VÀCHUYÊN CHỞBỆNH PHẨM
TRONGXÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG
KỸ THUẬT LẤY VÀCHUYÊN CHỞBỆNH PHẨM
TRONGXÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG
PhạmTháiBình
KỸ THUẬT
ĐỊNH DANH VI KHUẨN
KỸ THUẬT
ĐỊNH DANH VI KHUẨN
PhạmTháiBình
Bệnhphẩmlàmẫuthửlấytừbệnhnhân
đểpháthiệnbằngchứnggiúpxácđònh
đượctácnhângâynhiễmtrùng.
CầukhuẩnGram (-)
CầukhuẩnGram (+)
TrựckhuẩnGram (-)
TrựckhuẩnGram (+)
Bệnhphẩmthườnggặptrongxétnghiệmvi sinh
Máu
Dòchnãotủy
Nướctiểu
Đườnghôhấptrên
Hầuhọng
Mũihầu
Tai
Xoang
Đườnghôhấpdưới
Đàm
Dòchphế
quản
Dòchkhí

quản
Mủvàtiếtdòch
Phân
Đườngsinhdục
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
THỬNGHIỆM SINH HÓA
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
THỬNGHIỆM SINH HÓA
Vìbệnhphẩmđượclấybởinhiềunguồnkhácnhaunênphảilấy
bệnhphẩmđạtyêucầutrongxétnghiệmvi sinh
TRỰC KHUẨN GRAM (-)
Mac ConkeyAgar
(+) (-)
Haemophillus
HACEK
(1)
Sphingomonas
Moraxella
Pasteurella
Campylobacter
Helicobacter
Brucella
Bor
etella
Bartonella
rancisella
Legionella
Betty A. Forbes, et.al., 2002, Bailey & Scott’s, Diagnostic Microbiology, 7
th
edition, Mosby

(1)
HACEK:
Haemophilus
aphrophilus,
Actinobacillus
actinomycetemcomitans,
Cardiobacteriumhominis,
Eikenella corrodens,
Kingella sp.
(2)
cầu trựckhuẩn
Oxidase
(-) (+)
Glucose
(-)
(+)
Enterobacteriace
(
Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia, Klebsiella,
Serratia,
arsiella,
Proteus, Morganella,
Provi
encia, Salmonella,
Shigella, Yersinia
)
Glucose
(-)
Pse as

Burkhol
eria
lavobacterium
Alcaligenes
Achromobacter
Chryseobacterium
(+)
Vibrio
Aeromonas
Pleiosomonas
Chromobacterium
TrựckhuẩnGram (-) dễmọc
TrựckhuẩnGram(-)
(+)
Acinetobacter
(2)
Stenotrophomonas
lavimonas
Chryseomonas
D. Church, 2005, The seven principle of accurate microbiology specimens collection, Microbiology
newsletter a publication of the division of microbiology, CargaryLaboratory Services
Nguyênnhânlàmchobệnhphẩmkhôngđạt
yêucầutrongxétnghiệmvi sinh
Calgary Laboratory Services, Canada
 Enterobacteriaceae baogồm120 loàikhácnhau.
 Cáchọphụchính: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia,
Edwardsiella, Serratia, Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia.
 Đểđònhdanhđếnloàicóthểthựchiệnđến40 phảnứngsinhhóa.
Enterobacteriaceae
Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6

th
edition, American Society for Microbiology.
Phảichỉđònhlấybệnhphẩmsớm
-
ngaykhibệnhnhâncó ấuhiệunhiễmtrùng
1
Non ermentativeGram negative bacilli
Oxidase
(-)
(+)
Diđộng
Diđộng
(-)
(-)
(+)
(+)
Acinetobacter
Stenotrophomonas
Chryseomonas
lavimomas
Sphigomonas
Burkhol
eriacepacia
Burkhol
eriagla ioli
Pseu
omonas
Burkhol
eria
Alcaligenes

Comamonas
Sphigobacterium
lavobacterium
Chryseobacterium
Máu
Chỉđònhcấymáungaykhi
códấuhiệunhiễmtrùng
huyết(septicemia) hoặcdu
khuẩnhuyết(bacteremia).
 Sốt, ớnlạnh, lạnhrun, tiếngthổitim
(cardiac murmur).
 Nghingờviêmnộitâmmạc.
 Có xuất huyết ở da hay niêm
mạc, xuất huyết dạng sao
(splinder) trênmóngtay, choáng.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Haemophilus
V
XV
X
X
XV
V
X
V
XV
XV
X
V

(-)(-)
H. aphrophilus
Vi khuẩnkhác(khôngphải
Haemophilus)
(-)(+)H. ducreyi
(+)(-)
H. parainfluenzae
H. parahaemoliticus
H. segnis
H. paraprophilus
H. paraphrophaemolyticus
(+)(+)
H. Influenzae
H. Haemoliticus
V X Vi khuẩn
Dòchnãotủy
Chỉđònhcấydòchnãotủykhicócáctriệu
chứngnghingờviêmmàngnão.
Khôngchỉđònhchọc dòDNT:
 trẻsơ sinh bò suy tim, suy hô hấp.
 bệnh nhân códấuhiệugiatăngáplựcnộisọ(soi
đáymắtthấygaithòbòphùnề).
 bệnh nhân bò nhiễm trùng vùng da nơi kim chọc dò
đi qua đểlấy DNT.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
CẦU KHUẨN GRAM (-)
(+)
Acinetobacter
(

*
)
M. catarrhalis
Neisseriaceae
(-)
Oxidase
N. gonorrhoeae N. meningiti is N. lactamica N. sicca M. catarrhalis
CầukhuẩnGram (-)
(
*
)
cầutrựckhuẩn
Nướctiểu
Chỉđònhcấynướctiểukhinghingờ
nhiễmtrùngtiểucấptính, mạntínhcó
hoặckhôngcótriệuchứng
 Nhiễmtrùngbàngquang(đáira
mủ, ramáu, đáikhó, đáiđau,
đau tức vùng xương mu hay
bụngdưới).
 Nhiễmtrùngthận(đaulưng, tức
căngvùnggócsống-sườn).
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
TRỰC KHUẨN GRAM (+)
Sinhbàotử
(+)
(-)
Catalase
(+)

Bacillus
Diđộng
(+)
(-)
Corynebacterium
Listeria
(-)
Erysipelothrixrhusiopathiae
Arcanobacterium
Gar
nerellavaginalis
Lactobacillus
TrựckhuẩnGram (+)
Phân
Chỉđònhcấyphânkhibòtiêu
chảyhoặcbòrốiloạntiêu
hoánghingờdo nhiễmtrùng
 Tiêuchảy.
 Lỵvớiphâncómủ, nhầy
hoặcmáu.
 Bòđaubụngcơn.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
CẦU KHUẨN GRAM (+)
Catalase
Micrococcaceae
Streptococcaceae
Planococcus
Micrococcus
Stomatococcus

Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Aerococcus
Lactococcus
Pe
iococcus
Leuconostoccus
Genella
Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6
th
edition,
American Society for Microbiology.
Diđộng
6.5% NaCl
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
Oxidase
Chỉđònhcấườnghôhấptrênkhicó
nhiễmtrùngvùnghầuhọng, tai, mũixoang
Đườnghôhấptrên
 Viêmtai ngoàicấptính.
 Viêmtai giữacấptínhhoặcmạntính.
 Viêmxoangcấptinhhoặcmạntính.

 Viêmmũicấptínhhoặcmạntính.
 Viêmnhiễmvùnghầuhọng(đaurátvùnghầu
họng, niêmmạchầuhọngsưngđỏ, phùnề,
viêmamydan, cómàngmủhay mànggiả,
phùnềtiểuthiệt, lõiđỏdâutây, vàsưng
hạchcổ).
 Tìmngườilànhmangtrùng.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Staphylococcus
S. aureus
Coagulase
Novobiocin
S. saprophyticus
MannitolSalt
S. epi ermi is
Alkaline
phosphatase
S. schlei eri
Ornithin
decarboxylase
S. lu unensis
S. hominis
Urease
PolymycinB
S. haemolyticus
Staphylococcus
coagulasenegative khác
Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2
nd

edition, WHO
(+)
(-)
(S)
(-)
(-)
(-)
(+)
(R)
(-)
(+)
(+)(+)
(R)
(S)
Chỉđònhcấườnghôhấpdướikhi
cóviêmnhiễmđườnghôhấpdưới
(viêmphổi, viêmphếquảncấp,
cơncấpcủaviêmphếquảnmạn).
Đườnghôhấp ưới
 Ho cómáu, ho nhiều, đau
ngực, khóthở.
 Có dấu hiệu đặc phổi,
phimphổicóthâmnhiễm
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Streptococcus Enterococcus
(-)IViridansstreptococcus
RViridansstreptococcus
(+)IS. pseudopneumoniae
SS. pneumoniae

Bile solutionOptochinVi khuẩn
(+)(-)REnterococcus
(-)
Bile esculin
R
R
S
SXT
(-)R/SC/F/G streptococcus
(+)RS. agalactidae
(-)SS. pyogenes
CAMPBacitracinVi khuẩn
Tiêuhuyết α
Optochin Bile solution
Tiêuhuyết β
CAMP
Bacitracin Bile esculin
SXT
Tiêuhuyết γ
CAMP
Bile esculin
6.5% NaCl
(-)(-)Viridansstreptococcus
(+)(-)S. agalactidae
(-)(+)Non enterococcus
CAMP
(+)(+)Enterococcus
6.5 NaClBile esculinVi khuẩn
Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2
nd

edition, WHO
(-)E. faecium
(+)E. faecalis
Pyruvate
Enterococcus
Chỉđònhcấymủvàtiếtdòchtrongcác
trườnghợp:
Mủvàtiết òch
 Mủáp-xe.
 Vếtthươngnhiễmtrùng(vếtloét,
lở, mổhậuphẫu, loétdo nằmlâu).
 Mạchlươn; mạchdẫnxoanghay
hạchbạchhuyết.
 Dòch tiết (dòch màng phổi, dòch
màngbụng…).
 Mẫunạomủxươngkhigiảiphẫu
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
KITS THƯƠNG MẠI
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
KITS THƯƠNG MẠI
Chỉđònhcấườngsinhdụcnghingờ
bệnhlâytruyềnbằngđườngsinhdục
(ởđànôngvàđànbà) hoặcbòhuyết
trắngnghido nhiễmtrùng(ởđànbà).
Đườngsinh ục
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Đònhdanhbằngkits thươngmạigiúp

đònhdanhnhanhchóngvàchính
xáchơnnhờhệthốngmãđònhdanh
Phảilấúngbệnhphẩm
-
nơimàcósựhiện iệncủatácnhânnhiễmtrùng
2
TrựckhuẩnGram (-), ễmọc
bằnghệthốngIDS14GNR (Nam Khoa)
Oxidase
LDC
Di
động
35
o
C/
12-16h
200µl/giếng
35
o
C/12-16h
Xanhlá/ vàngXanhbiểnα-napthtol+KOHMalonate10
VàngĐỏ
VP9
VòngvàngVòngđỏKovacIndol8
KhôngđenĐen
H
2
S8
KhôngđenĐen
Esculin7

Xanhlá/ vàngXanhbiểnCitrate6
VàngnhạtXanhláFeCl
3
PAD5
Vàng/đỏnhạtĐỏhồng
SinhUrease4
TrắngVàngONPG3
VàngĐỏTìmnitriteNitrate → Nitrite2
TímVàng
Glucose1
(-)(+)ThuốcthửThửnghiệmGiếngsố
Tìmtácnhângâynhiễmtrùngvết
thươngphảilấymủhoặcdòchtiết
gầnlớpmô, khônglấymủtrênbề
mặtvếtthương.
Tìmtácnhângâyviêmxoang
phảilấyquệtmũisau, không
lấyquệtmũitrước.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Mỗinhómgồmcó03 phảnứng
 Cácphảnứng(-): 0 điểm.
 Phảnứng(+): 1 điểm (thứnhấtcủanhóm); 2 điểm (thứhaicủanhóm); 3 điểm (thứbacủanhóm).
 Tổngđiểmcủanhómđượcsốđònhdanhthứnhất.
 Tậphợpcácsốđònhdanhđượcmãsốđònhdanh.
IDS 14GNR- Hệthốngđònh anh
trựckhuẩnGram (-),
ễmọc
Số: …………………………………………………………… ……
Tên: ………………………………………………………………………

ISO 9001:2000
WHO GMP/GLP
OXI
1
GLU
2
NIT
4
ONPG
1
URE
2
PAD
4
CIT
1
ESC
2
H
2
s
4
IND
1
VP
2
MLO
4
LDC
1

MOB
2
Kếtquảđònh anh:
Enterobactercloaceae
(ID: 100 , P: 0.67)
6 1 3 6 0
Tìmtácnhângâyviêmphổi
phảilấàmhoặcdòchhútkhí
phếquản, khônglấynướcbọt
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Phảilấybệnhphẩmđúngthờiđiểm
-
vàolúcmàtácnhânnhiễmtrùng
hiện
iệntrongbệnhphẩm
3
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
MÁY ĐỊNH DANH TỰĐỘNG
PHƯƠNG PHÁP SỬDỤNG
MÁY ĐỊNH DANH TỰĐỘNG
BioMerieux VITEK2
PHOENIX
Tìm S. typhi gâythươnghàn
Cấymáunếûtuầnthứ
nhấtsaukhikhởibệnh
Cấyphânnếûtuần
thứbasaukhikhởibệnh
PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰGEN

16S rRNA
PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰGEN
16S rRNA
Máu
Thờiđiểmtốtnhấtđể
lấymáulàkhibệnh
nhânbòớnlạnhhoặc
đanglạnhrun trướckhi
sốt, hoặc lúc bệnh
nhânđanglêncơnsốt.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Gen 16S rRNAgồmkhoảng
1542bp vớinhiềutrìnhtựbảo
tồn. Trongđócómộtđoạn
trìnhtự#550bps đặchiệucho
giốngvàloàicủavi khuẩn.
Giảitrìnhtựđoạnđặchiệu
nàygiúpđònhdanhchínhxác
vi khuẩn
1542bps
120bps
2904bps
Nguyêntắc
Nướctiểu
Thờiđiểmtốtnhấtđể
lấynướctiểulàvào
buổisáng, bệnhnhân
cốnhòntiểutrongđêm

chếnlúclấymẫu.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Cácbệnhphẩmkhác
Thờiđiểmtốtnhấtđểlấy
mẫulàcàngvàogiai
đoạn sớm của bệnh
càngtốt, nghóalàngay
khicóchẩnđoán
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Quytrìnhthựchiện
Vi khuẩntrên
mặtthạch
LấykhúmkhuẩnchovàoTE
1X đểlàmthànhhuyềndòch
tươngđươngMc. F 1.0
TáchchiếtDNA :
– Đunsôi10min
– Đểlạnh5min
– Ly tâm5min.
Lấydòchnổi
ChovàoPCR mix để
khuếchđạigen16S rRNA
Primers
Taq polymerase
dNTP
Mg
2+
DNA đích

PCR 16SrRNA
(40X)
94
o
C/15s
60
o
C/30s
72
o
C/1min
Điệnditrêngel
agarose để xác
đònhsảnphẩmPCR
Phảilấybệnhphẩmtrướckhibệnhnhân
sử ụngkhángsinh
-
đểtangkhảnangphânlậptácnhânnhiễmtrùng
4
Tinhsạchsản
phẩmPCR
Đonồngđộ
DNA (10pg/µl)
SV gel & PCR cleanup
system (Promega)
DTCS Quickstartmix
(Beckman Coulter)
PCR giảitrìnhtự
(30X)
96

o
C/20s
50
o
C/20s
60
o
C/4min
Tủavàtinhsạchsản
phẩmPCR giảitrìnhtự
Agencourt
Clean SEQ
(Beckman
Coulter)
Điệndimaoquản
trênCEQ 8000
Xuấtkếtquảgiải
trìnhtựđểphântích
Đăng nhập vào
NCBI BLAST SEARCH
Xác đònhtênvi khuẩn
cầnđònh nh
Việcđiềutròkhángsinhtheokinhnghiệm
cóthểkhôngtiệttrừhoàntoànnhưng
ứcchếsựpháttriểncủatácnhân
nhiễmtrùngkhinuôicấyvàcóthểcho
kếtquảâmtínhgiả.
Phảilấybệnhphẩmnuôicấy
trướckhiđiềutròkhángsinh, nhất
làvớikhángsinhphổrộng.

5
Phảilấybệnhphẩmđúngphươngpháp
-
đểtránhbệnhphẩmbòngoạinhiễmvàlấy
đượcbệnhphẩmcầnlấy